一種豬瘟病毒基因重組腺病毒載體疫苗病毒含量測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于家畜病毒檢測技術領域，具體涉及一種新型豬瘟病毒基因重組腺病毒 載體疫苗病毒含量測定方法。
【背景技術】
[0002] 豬瘟（CSF)是由豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV)引起的一種豬 的高度接觸性傳染病，死亡率極高，給世界養豬業造成了巨大的經濟損失。豬瘟已被世界動 物衛生組織（OIE)列為家畜A類傳染病，我國也將其列為一類動物疫病。臨床以稽留高燒、 皮膚和黏I旲出現大M出血點為特征。多年的實踐經驗證明，疫苗接種是預防和控制動物疫 病的主要手段。20世紀60年代，我國研制出經人工誘變獲得的豬瘟兔化弱毒株（又稱C 株）疫苗在CSFV防控中起到了決定性作用，有效的控制了豬瘟在我國乃至世界范圍內大規 模的流行。因此，疫苗的質量至關重要，疫苗效價是評價疫苗質量的關鍵指標。
[0003] 到目前為止，對于豬瘟活疫苗中病毒含量測定還沒有一種穩定性、重復性好的定 量方法，還不能進行病毒含量測定。過去，一直采用兔體定型熱反應法來檢測疫苗效力。 但是該方法周期長，兔體個體的反應會影響結果的穩定性。近幾年，一些學者采用實時熒 光定量PCR方法快速檢測豬瘟活疫苗中病毒含量（HoffmannB，etal.Validationofa real-timeRT-PCRassayforsensitiveandspecificdetectionofclassicalswine fever.JVirolMethods，2005,130 (1-2) :36-44;高博，等.快速檢測豬瘟兔化弱毒疫苗 株的TaqMan熒光定量RT-PCR方法的建立應用。西南民族大學學報：自然科學版，2009， 35(1) :92-97)和RT-PCR方法（羅廷榮，等.RT-PCR診斷CSFV的應用研宄.中國預防獸 醫學報，2003, 25 (3) : 219-222)，這些方法雖然靈敏度很高，但都不能進行完全定量，并且不 能區分活疫苗中有復制能力的活病毒粒子和死亡的病毒粒子，因此，實時熒光定量PCR方 法和RT-PCR方法不能對疫苗中活病毒進行定量。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種用于豬瘟病毒基因重組腺病毒載體疫中病毒含量測定 方法，可以更靈敏、更特異的檢測到該疫苗中的活病毒的含量，從而彌補現有技術的不足。
[0005] 本發明首先提供一種用于檢測豬瘟病毒的熒光免疫檢測試劑盒，包含有如下的組 分：
[0006] 1) -抗：用于檢測CSFV的單因子血清抗體；
[0007] 2)二抗：FITC標記的山羊抗兔IgG;
[0008] 3)陽性對照樣品：豬瘟兔化弱毒株（C株）；
[0009] 4)固定液：按丙酮與甲醇體積比1 :1配置固定液；
[0010] 5)PBS洗液：Nacl8. 0g/L;Kcl0? 2g/L;Na2HP043. 58g/L;KH2P040 . 24g/L。
[0011] 其中兔抗CSFV蛋白的單因子血清抗體，其制備方法如下：將CSFV基因重組腺病毒 載體疫苗強化免疫SPF兔后，用豬瘟兔化弱毒株進行攻毒，選擇攻毒后無反應熱的SPF兔采 集血清制備的。
[0012] 上述的試劑盒用于檢測豬瘟病毒基因重組腺病毒載體疫苗中的病毒含量；其一種 具體操作步驟如下：通過將豬瘟病毒基因重組腺病毒載體疫苗進行連續10倍梯度稀釋，在 培養板每孔逐滴取1〇〇U1稀釋的疫苗液接種于在5%C02、37°C孵育2?3小時的HEK293 細胞上，繼續培養48小時后，利用構建的檢測CSFV的熒光免疫檢測試劑盒進行間接免疫熒 光檢測，通過計算顯微鏡下視野中陽性（出現綠色熒光）細胞的平均個數計算疫苗中的病 毒含量。
[0013] 其中計算病毒含量的方法如下：
[0014] 1)計算顯微鏡下視野中陽性細胞的平均個數。選擇一個梯度，此梯度視野中有 5-50個陽性細胞，隨機選擇至少5個區域計數；
[0015] 2)計算24孔板中每孔視野數；
[0016] 對于多數顯微鏡，標準10X目鏡與10X物鏡所觀察到的視野直徑為1. 8_，因此： 每個視野的面積=3. 14X(D/2)2= 3. 14X0. 9 2= 2. 54mm2;對于一個標準24孔板，培養面 積為 2. 0cm2,因此：每孔視野數=2. 0cm2/2. 54mm2 = 2. 0cm2/2. 54XlCT2cm2= 79 ;
[0017] 3)按疫苗病毒滴度（IFU/ml)=(平均陽性細胞數/每孔視野數）X(稀釋比例）/ (0.lml)進行計算疫苗中病毒含量。
[0018] 本發明通過構建CSFV的熒光免疫試劑盒，將豬瘟病毒基因重組腺病毒載體疫苗 接種HEK293細胞，采用間接免疫熒光檢測技術（IFA)進行該疫苗病毒含量檢測。本發明方 法能夠具體檢測到豬瘟活病毒粒子感染的單個細胞（出現特異性綠色熒光），通過計算活 病毒粒子感染單個細胞（出現特異性綠色熒光）的數目來評價新型豬瘟病毒基因重組腺病 毒載體疫苗中病毒的含量，具有靈敏度高、特異性強和重復性好的特點。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合實施例對本發明的方法進行詳細的描述。
[0020] 實施例1 :用于檢測CSFV的熒光免疫試劑盒的構建
[0021] 1. 1針對CSFV單因子血清抗體的制備方法
[0022] 用于檢測CSFV的熒光免疫試劑盒主要成分為兔抗CSFV蛋白的單因子血清抗體， 是將云南農大構建、青島易邦生物工程有限公司技術中心繁殖保存的重組豬瘟病毒基因腺 病毒載體疫苗頸部皮下注射免疫7只3??兔，每只11111(3.95\10 61'(：105(|/只）；14(1后用進 行第二次免疫，lml/只；再經14d后第三次免疫（方法同第二次），其中3只未免疫SPF兔 作為陰性對照組。第三次免疫后l〇d，用豬瘟兔化弱毒耳靜脈注射lml進行攻毒，攻毒后72 小時之內未出現稽留熱反應（而對照兔出現稽留熱反應），將7只免疫兔心臟采血致死，析 出的血清-20°C保存。其制備出的抗體能夠與CSFV發生特異性反應。以此單因子血清構 建的CSFV的熒光免疫檢測試劑盒，可以檢測豬瘟病毒基因重組腺病毒載體疫苗中的抗原， 判定該疫苗的病毒含量，也可以檢測臨床上CSFV感染豬病料組織中的抗原，判定是否感染 CSFV，其特異性強、靈敏度高、可重復性好且檢測速度快，與以往的RT-PCR、實時熒光定量 PCR及動物回歸試驗檢測方法相比，利用該試劑盒通過IFA檢測更方便、更準確。
[0023] 1. 2間接免疫熒光（IFA)鑒定單因子血清
[0024] 1. 2. 1選取狀態良好的HEK293細胞（商品化專門用來繁殖豬瘟病毒基因重組腺 病毒載體疫苗），使用完全培養基重懸細胞，制備成2. 5X105/ml的細胞懸液，24孔板中接 入lml，37°C5%C02培養2?3小時。
[0025] 1. 2. 2將該疫苗（3. 95X106TCID5Q/ml)按10_2接種比例加入HEK293細胞中， 37°C5%C02 感染 2 天。
[0026] 1. 2. 3輕輕去除培養液，沿24孔板側壁緩緩加入-