一種基于磁微粒化學發光法檢測κ游離輕鏈的試劑盒及其制備和檢測方法與流程

本發明涉及檢測試劑盒，具體的涉及一種基于磁微粒化學發光法檢測κ游離輕鏈的試劑盒及其制備和檢測方法。

背景技術：

1、免疫球蛋白分子均由兩條相同的重鏈(h鏈)和兩條相同的輕鏈(l鏈)通過二硫鍵連接形成，兩條相同的輕鏈分為κ(kappa)型和λ(lambda)型，可以標記帶有輕鏈的b淋巴細胞、漿細胞和免疫母細胞。正常情況下輕鏈和重鏈的分泌是平衡的，二者可以結合形成完整的免疫球蛋白分子。淋巴b細胞在發育成熟的過程中，其基因結構需要不斷的重排組合，其合成的免疫球蛋白重鏈有幾種不同的類型，但輕鏈都為κ或λ，正常人體淋巴結中表達不同輕鏈的b細胞數κ：λ約為2：1。

2、正常漿細胞和反應性漿細胞增多癥系多克隆性，既有κ鏈漿細胞也有λ鏈漿細胞，κ/λ比值在正常范圍內。當多發性骨髓瘤(mm)發生時，會過量產生一種單克隆免疫球蛋白輕鏈并同時抑制另一種輕鏈的生成，異常漿細胞分泌單一類型的免疫球蛋白從而使κ/λ比值失去平衡，比值的升高或降低分別提示患κ或λ型多發性骨髓瘤的可能。多發性骨髓瘤中有一輕鏈占絕對優勢，提示漿細胞存在單克隆性增生。但對于同時含有κ和λ的雙克隆多發性骨髓瘤和反應性漿細胞增多癥無法區分，需要結合其它免疫指標進行鑒別。綜上κ/λ比值的失衡是區分發性骨髓瘤漿細胞單克隆性增生和b細胞淋巴瘤等其他疾病的重要指標。

3、目前κ游離輕鏈檢測多采用電泳法、免疫固定電泳法、膠乳比濁法和膠乳增強法，但此類方法檢測范圍窄，靈敏度低，且受結合輕鏈影響較大，已不能滿足逐漸增長的臨床檢驗需求。

4、化學發光法是近年來得到廣泛應用的一種檢測方法，已成熟用于檢測血液或體液標本中的蛋白及小分子物質，能夠得到靈敏度更高，檢測范圍更寬的結果。但采用常規化學發光法制得的κ游離輕鏈檢測試劑，與膠乳比濁法的試劑相比，檢測范圍和靈敏度只有小范圍改變，沒有達到數量級的提升，傳統方式的化學發光法檢測κ游離輕鏈仍然受樣本中結合輕鏈和λ游離輕鏈的干擾影響，造成靈敏度和檢測范圍無法提高，準確度不滿足要求的問題。

技術實現思路

1、本發明的目的在于克服現有技術中化學發光法檢測κ游離輕鏈時靈敏度和檢測范圍無法提高的缺陷，提供了一種基于磁微粒化學發光法檢測κ游離輕鏈的試劑盒及其制備和檢測方法。

2、為了實現以上目的及其他目的，本發明是通過以下技術方案實現的：

3、首先，本發明提供了一種基于磁微粒化學發光法檢測κ游離輕鏈的試劑盒，包括κ游離輕鏈抗體1包被的磁珠，發光物標記的κ游離輕鏈抗體2以及反應緩沖液，所述反應緩沖液包括抗干擾劑1、抗干擾劑2以及λ游離輕鏈抗體。

4、在一實施例中，所述抗干擾劑1為protein?a蛋白。

5、在臨床樣本中，免疫球蛋白根據重鏈定義類型(iga、igg、igm、igd、ige)，重鏈與κ或λ型輕鏈相結合，樣本中大多數輕鏈為結合型，成為完整的免疫球蛋白，只有少數的游離輕鏈，大量存在的結合型輕鏈會直接影響游離輕鏈的檢測，protein?a蛋白是金黃色葡萄球菌表面的蛋白，可與樣本中igg、iga、igm和ige等免疫球蛋白分子結合，封閉結合型輕鏈的位點，造成空間位阻，從而降低干擾。

6、在一實施例中，所述抗干擾劑2為protein?g蛋白。

7、免疫球蛋白中igg是最常見的類型，igg分為igg1、igg2、igg3、igg4四種亞型，所述protein?g蛋白是g族鏈球菌的細胞表面蛋白，所述protein?g蛋白可以更廣泛、更強地、與4種亞型的igg結合，進一步加強對免疫球蛋白的封閉，降低對檢測游離輕所述protein?g蛋白鏈的干擾。

8、在一實施例中，所述λ游離輕鏈抗體為λ游離輕鏈多克隆抗體。

9、臨床樣本中除κ游離輕鏈還存在λ游離輕鏈，兩者為結構類似物，大部分片段基本一致，而特異性的κ游離輕鏈單克隆抗體捕獲抗原時，依然會不同程度地受到λ游離輕鏈的干擾，造成背景值升高，異常跳值的問題，λ游離輕鏈多克隆抗體能結合抗原表面更多的位點，對λ游離輕鏈全方位包裹，直接減小干擾。

10、在一實施例中，所述λ游離輕鏈多克隆抗體來源于小鼠(mouse)、大鼠(rat)、兔、羊或山羊，優選地為大鼠(rat)。

11、在一實施例中，所述抗干擾劑1、抗干擾劑2和λ游離輕鏈抗體的質量比為(1～10)：

12、(1～4)：1。

13、在一實施例中，所述反應緩沖液還包括1.2g/l磷酸二氫鈉，7.2g/l十二水合磷酸氫二鈉，9.0g/l氯化鈉，5.0g/l牛血清白蛋白，10.0g/l蔗糖，1ml吐溫20，500μl曲拉通x-100，1ml防腐劑proclin300。所述反應緩沖液的ph值為6～8。

14、在一實施例中，所述κ游離輕鏈抗體1包被的磁珠濃度為0.1～0.3mg/ml，優選為0.2mg/ml；所述κ游離輕鏈抗體1包被的磁珠包括κ游離輕鏈抗體1、磁珠、活化劑、封閉劑和組分保存液，所述κ游離輕鏈抗體1與磁珠的偶聯比例為10～30μg/mg，優選為20μg/mg。

15、進一步的，所述κ游離輕鏈抗體1為κ游離輕鏈單克隆抗體，所述κ游離輕鏈單克隆抗體來源于小鼠(mouse)、大鼠(rat)、兔、羊或山羊，優選為大鼠(rat)。

16、進一步的，所述磁珠為羧基磁珠、鏈霉親和素磁珠、甲苯磺酰基磁珠，優選為羧基磁珠；所述羧基磁珠粒徑為1～3μm，優選為2.8μm。

17、進一步的，所述活化劑為1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(edc)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(edc)和n-羥基丁二酰亞胺(nhs)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(edc)和n-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-nhs)，優選為edc和sulfo-nhs。

18、進一步的，所述封閉劑為牛血清白蛋白和db1130試劑。

19、進一步的，所述組分保存液ph值為6～8，包括0.4g/l磷酸氫二鉀，2.4g/l十二水合磷酸氫二鈉，0.4g/l氯化鉀，9.0g/l氯化鈉，0.2g氯化鎂，0.1g氯化鈣，20g/l牛血清白蛋白，0.1％曲拉通x-100，0.1％?krovin360。

20、在一實施例中，所述發光物標記的κ游離輕鏈抗體2包括κ游離輕鏈抗體2、發光標記物、終止劑和組分保存液，所述發光物標記的κ游離輕鏈抗體2的濃度為1～4μg/ml，優選為2.5μg/ml；所述發光標記物與κ游離輕鏈抗體2標記比為1：(5～30)，優選為1：20。

21、進一步的，所述κ游離輕鏈抗體2為κ游離輕鏈單克隆抗體，所述κ游離輕鏈單克隆抗體來源于小鼠(mouse)、大鼠-(rat)、兔、羊或山羊，優選地為大鼠(rat)。

22、進一步的，所述發光標記物為吖啶鹽、堿性磷酸酶或者過氧化氫酶，優為吖啶鹽；所述吖啶鹽可以是nsp-dmae-nhs、dmae-nhs或者nsp-sa-nhs，優選為nsp-dmae-nhs。

23、進一步的，所述終止劑為tris，甘氨酸，賴氨酸，組氨酸，優選為甘氨酸。

24、進一步的，所述組分保存液為包括0.4g/l磷酸氫二鉀，2.4g/l十二水合磷酸氫二鈉，0.4g/l氯化鉀，9.0g/l氯化鈉，0.2g氯化鎂，0.1g氯化鈣，20g/l牛血清白蛋白，0.1％曲拉通x-100，0.1％?krovin360。

25、此外，所述基于磁微粒化學發光法檢測κ游離輕鏈的試劑盒還可以包括κ游離輕鏈校準品、清洗液、底物液a和底物液b。

26、在一實施例中，所述清洗液的ph值為9.5，包括：0.02m?tris-hcl、9.0g/l氯化鈉、0.2％吐溫20和0.1％?krovin950；所述底物液a包括0.05m硝酸和0.5％雙氧水；所述底物液b包括0.1m氫氧化鈉、0.5％十六烷基三甲基溴化銨和0.1％吐溫20。

27、其次，本發明還提供了一種基于磁微粒化學發光法檢測κ游離輕鏈的試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

28、步驟s1，制備κ游離輕鏈抗體1包被的磁珠：將純化后的κ游離輕鏈抗體1與活化后的磁珠進行偶聯，制備獲得κ游離輕鏈抗體1包被的磁珠；

29、步驟s2，制備發光物標記的κ游離輕鏈抗體2：用發光標記物標記純化后的κ游離輕鏈抗體2后，再進行純化，制備獲得發光物標記的κ游離輕鏈抗體2；

30、步驟s3，制備反應緩沖液：取磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、氯化鈉、牛血清白蛋白、蔗糖，加入純化攪拌溶解后加入吐溫20、曲拉通x-100以及防腐劑proclin300；調節ph后定容，加入λ游離輕鏈多克隆抗體、protein?a蛋白以及protein?g蛋白，制備獲得反應緩沖液；

31、步驟s4，制備κ游離輕鏈校準品、清洗液、底物液a以及底物液b。

32、最后，本發明提供了一種基于磁微粒化學發光法檢測κ游離輕鏈的試劑盒的檢測方法，采用一步半法檢測，包括步驟：

33、采用全自動化學發光儀一步半法檢測，吸取待測臨床樣本或校準品加入反應管中，加入反應緩沖液，混勻后溫育反應，再依次加入κ游離輕鏈抗體1包被的磁珠和發光物標記的κ游離輕鏈抗體2，混勻后繼續溫育反應，反應結束后去除上清液和未參與反應多余的發光標記物，在反應管中加入底物液a，混勻后加入底物液b，在加入的同時立即采集發光信號，采集2s后停止，計算得到相對發光值。

34、綜上所述，本發明提供的基于磁微粒化學發光法檢測κ游離輕鏈的試劑盒通過反應緩沖液的添加，采用化學發光法檢測κ游離輕鏈時，可以排除干擾影響，并且其檢測靈敏度、線性范圍、穩定性以及準確性等方面均顯著提高。