本發明涉及化學分析領域,具體涉及一種含有特征物質列表的非靶代謝組學質譜檢測方法,以及液相質譜聯用的檢測方法。
背景技術:
1、液相質譜聯用技術,即將液相色譜和質譜結合起來的技術,利用此技術檢測目標物質,可以獲得目標物質的色譜保留時間、母離子質量數和強度、二級子離子的質量數和強度信息。此聯用技術通過液相色譜對多種物理化學性質不同的物質進行分離,利用質譜對質量電荷比不同的多種物質進一步的分離,并記錄多種物質各自的強度。液相質譜聯用技術關鍵點在色譜柱類型,流動相種類、液相梯度、質譜儀器類型和質譜采集模式。
2、非靶向質譜技術,基于高分辨質譜的技術,質量偏差是±15?ppm,包括數據依賴的采集(data-dependent?acquisition,dda)和數據非依賴的采集(data-independentacquisition,dia)。目前現有的非靶向技術主要采用dda模式,此模式基本原理是,儀器先采集一張一級質譜圖,在一級譜圖基礎上,根據離子信號強度降序排序,然后選擇排名前4的離子,對選擇的離子采集二級離子,即在碰撞池設置一定的碰撞能量碎裂母離子,采集完選擇離子的二級譜圖后,再采集一張一級質譜圖,以此循環往復。數據中記錄一級質譜圖和二級質譜圖。譜圖包含多種離子的質荷比和離子信號。對于高分辨的orbitrap質譜儀器,還存在正負切換采集模式,即采集一張正離子的譜圖,然后儀器電壓切換,再采集一張負離子質譜,以此循環往復。除此之外高分辨的orbitrap質譜儀器,還可以使用tms2(靶向二級質譜)技術,即提供目標物質信息,質譜在單極性模式采集目標物質的二級質譜圖。對于高分辨的四級桿飛行時間質譜儀器,只存在單極性采集模式,即在一個方法內只能對正離子或者負離子進行采集,不能正負切換。
3、靶向質譜技術,基于低分辨質譜技術,質量偏差是±1?da,包括多反應監測(multiple?reaction?monitoring,mrm)和選擇反應監測(selected?reactionmonitoring,srm),目前現有的靶向技術主要采用mrm模式,此模式的原理是,儀器的第一個四級桿選擇目標物質的母離子通過,只有和母離子質荷比偏差在1da的離子才能通過,然后第二個四級桿設置一定的碰撞能量碎裂母離子,第三個四級桿選擇目標物質的子離子通過。數據中只記錄目標物質子離子質荷比和信號強度。
4、現有技術中通常使用數據依賴采集的非靶代謝組學質譜技術。主要包括:
5、1)血漿樣本進行前處理提取代謝物,使用經典的甲醇乙腈提取方法。
6、2)數據采集使用液相質譜聯用技術,使用反相色譜體系串聯高分辨質譜。
7、3)數據采集的序列編排:正離子模式,每份樣本調取1個正負切換方法和1個dda方法;負離子模式,每份樣本調取1個正負切換方法和1個dda方法。
8、現有技術中dda模式采集ms2(二級質譜)存在隨機性,低豐度物質的ms2存在丟失,多中心血漿樣本內代謝物的檢出重現率低于50%。在公共數據庫內,來自不同儀器和不同采集方法獲得的人血漿中代謝物種類存在很大差異,物質列表不具有代表性。靶向mrm方法采用低分辨質譜儀器,此類儀器質量分離能力為±1da,質量偏差大,數據質量低。現有的靶向mrm方法檢測的峰數目低于2000個。
技術實現思路
1、本發明的目的在于針對現有技術中樣本內代謝物的檢出重現率低、代謝物種類存在很大差異的問題,提供一種含有特征物質列表的非靶代謝組學質譜檢測方法。
2、為解決上述技術問題,本發明采用如下技術方案:
3、本發明公開了一種含有特征物質列表的非靶代謝組學質譜檢測方法,包括如下步驟:
4、1)收集樣本多例,采用甲醇-乙腈溶液提取代謝物,獲得上清;
5、2)取步驟1)每例樣本上清進樣進行色譜分析,同時取所有樣本的部分上清進行混合作為質控(qc)樣本;
6、3)采用液相質譜聯用進行數據采集,包括:
7、a.對樣本分別進行親水體系分析和疏水體系分析;
8、b.對樣本進行質譜分析;
9、4)數據采集的序列編排;
10、5)數據分析;
11、6)特殊方法編輯:將樣本特征列表拆分成一個疏水體系正離子列表和一個疏水體系負離子列表,一個親水體系正離子列表和一個親水體系負離子列表,調用高分辨質譜的tms2功能模塊,分別導入樣本特征物質列表,建立一個疏水體系正離子tms2方法和一個疏水體系負離子tms2方法,一個親水體系正離子tms2方法和一個親水體系負離子tms2方法;
12、7)方法組裝:將一個新建立的正離子tms2和四個正離子dda方法組裝,將一個新建立的負離子tms2方法和四個負離子dda方法組裝,將以上方法和一級質譜ms1方法組合成為一套疏水體系方法;將一個新建立的正離子tms2方法和四個正離子dda方法組裝,將一個新建立的負離子tms2方法和四個負離子dda方法組裝,將以上方法和一級質譜ms1方法組合成為一套親水體系方法;4套方法組合成為組合采集方法;
13、8)序列編排設計:疏水體系,樣本調取1個一級質譜ms1方法,正離子模式,qc樣本調取4個疏水體系dda方法和1個tms2方法;負離子模式,qc樣本調取4個疏水dda方法和1個tms2方法;親水體系,樣本調取1個一級質譜ms1方法,正離子模式,qc樣本調取4個親水體系dda方法和1個tms2方法;負離子模式,qc樣本調取4個親水dda方法和1個tms2方法。
14、優選的,所述親水體系分析為:
15、a相為含15-30?mmol/l乙酸銨和20-40?mmol/l氨水的水溶液,b相為乙腈;流速0.5ml/min;洗脫條件為:0-0.5?min:?95%?b,1-9?min:?95%?b?至?40%?b,9-12?min:?40%?b?至95%?b。
16、優選的,所述疏水體系分析為:
17、a相為含0.01%?乙酸的水溶液,b相為異丙醇:乙腈體積比1:1的混合溶液;流速0.3ml/min,洗脫條件為:0-1?min:?1%?b,1-9?min:?1%?b至?99%?b,9.1-12?min:?1%?b。
18、優選的,所述質譜分析為:
19、正離子噴霧針電壓3.0?kv?,負離子噴霧針電壓3.0?kv;一級質譜參數,采集模式full?scan,分辨率30000-60000;二級質譜參數,采集模式dda,分辨率15000-30000。
20、優選的,所述數據采集的序列編排為:對于疏水體系,正離子模式,每份樣本調取1個疏水體系一級質譜方法,質控樣本調取4個疏水體系dda方法;負離子模式,每份樣本調取1個疏水體系一級質譜方法,質控樣本調取4個疏水dda方法。
21、優選的,所述數據采集的序列編排為:對于親水體系,正離子模式,每份樣本調取1個親水體系一級質譜方法,質控樣本調取4個親水體系dda方法;負離子模式,每份樣本調取1個親水體系一級質譜方法,質控樣本調取4個親水dda方法。
22、優選的,所述數據分析為:分析人群血漿樣本中鑒定的代謝物,統計并提取出現頻率在50%以上的物質作為血漿特征物質,導出物質列表包括物質名字,物質峰質荷比,物質色譜體系和色譜保留時間。
23、優選的,所述步驟1)中代謝物的提取步驟為:取100?μl樣品至ep管中,加入400?μl甲醇:乙腈混合溶液,混勻,超聲處理后靜置,離心收集上清液。
24、優選的,所述步驟1)中血漿樣本例數為至少3例。
25、優選的,所述樣本選自尿液、體液、組織液、血清或血漿。
26、優選的,所述步驟1)中血漿樣本例數為99例。
27、本發明采用含有特征物質列表的非靶代謝組學質譜檢測技術。通過采用液相質譜聯用進行數據采集,對數據采集的序列編排,進行數據分析以及特殊方法編輯。本發明方法對樣本內檢測到的離子數目多、采集的數據鑒定出的高頻物質數目多、數據質量高,鑒定的物質數目多,具有較高的檢測水平,適合推廣應用。