一種基于磁微?；瘜W(xué)發(fā)光的癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子6測(cè)定試劑盒及其制備方法

所本發(fā)明涉及檢測(cè)，特別涉及一種基于磁微?；瘜W(xué)發(fā)光的癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子6測(cè)定試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子6(carcinoembryonic?antigen-related?celladhesionmolecule?6，ceacam6)是免疫球蛋白細(xì)胞黏附分子癌胚抗原家族成員之一。

2、ceacam6通過糖基磷脂酰肌醇(glycosyl?phosphatidylinositol,gpi)連接在細(xì)胞膜上，編碼的蛋白含344個(gè)氨基酸殘基。ceacam6參與調(diào)控細(xì)胞進(jìn)程，如細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖、血管生成以及腫瘤發(fā)生。ceacam6在腫瘤中高表達(dá)，參與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷徙和侵襲，抑制其凋亡。ceacam6是許多侵襲性腫瘤的重要生物學(xué)標(biāo)記，ceacam6在輔助診斷膽管癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌以及肺癌等腫瘤及監(jiān)測(cè)其發(fā)展過程具有潛在應(yīng)用價(jià)值。最新研究發(fā)現(xiàn)，luad-lm(肺癌軟腦膜轉(zhuǎn)移)患者的腦脊液中ceacam6水平顯著高于正常人群。血清中ceacam6的水平相對(duì)于cea更能區(qū)分luad患者lm和非lm。

3、目前，ceacam6的檢測(cè)方法主要為酶聯(lián)免疫法。酶聯(lián)免疫法存在靈敏度低、操作復(fù)雜、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、標(biāo)本用量多等缺點(diǎn)。因此，尋找一種直接、快速、靈敏度高、試劑價(jià)格低廉、操作步驟簡(jiǎn)單的方法是十分必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種基于磁微粒化學(xué)發(fā)光的癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子6測(cè)定試劑盒及其制備方法，該試劑盒可以定量測(cè)定血清、血漿、全血和腦脊液中ceacam6的濃度，檢測(cè)時(shí)間短、線性范圍寬、精密度好、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、特異性好。

2、本發(fā)明一方面采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法，能夠解決酶聯(lián)免疫法存在的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、線性范圍窄、精密度差、靈敏度低等缺點(diǎn)；另一方面r3試劑和r4試劑的稀釋液含生物表面活性劑，可以增強(qiáng)試劑穩(wěn)定性同時(shí)能夠進(jìn)一步提高試劑的分散性，使試劑靈敏度提高、反應(yīng)時(shí)間縮短。

3、技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

4、第一方面，本發(fā)明提供一種基于磁微?；瘜W(xué)發(fā)光的癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子6測(cè)定試劑盒，該測(cè)定試劑盒包括：

5、r1試劑：鏈霉親和素包被的磁性微?；騝eacam6單克隆抗體包被的磁性微粒，

6、r3試劑：吖啶酯或堿性磷酸酶或三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記的ceacam6單克隆抗體，所述r3試劑溶于稀釋液中，及

7、r4試劑：稀釋液，當(dāng)r1試劑為鏈霉親和素包被的磁性微粒時(shí)，所述r4試劑中還包括生物素標(biāo)記的ceacam6單克隆抗體，其中，

8、所述r3試劑溶于稀釋液中，所述稀釋液為包含生物表面活性劑的檸檬酸緩沖液。

9、本發(fā)明中r3試劑和r4試劑用到的稀釋液采用生物表面活性劑或其與和常規(guī)表面活性劑的組合，是因?yàn)樯锉砻婊钚詣┚哂腥榛?、增溶和降低表面張力的作用，且可增?qiáng)試劑穩(wěn)定性，有利于進(jìn)一步提高靈敏度并縮短反應(yīng)時(shí)間。

10、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述稀釋液中還包含非離子型表面活性劑的檸檬酸緩沖液。

11、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述非離子型表面活性劑包括吐溫20、吐溫80或聚乙二醇辛基苯基醚其中的一種或兩種的組合。

12、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述生物表面活性劑包括鼠李糖脂、槐糖酯、甘露糖赤蘚糖醇脂或表面活性素中的一種或幾種。

13、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述生物表面活性劑的濃度為0.05％-0.5％w/v。

14、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述非離子型表面活性劑的濃度為0.1％-1％v/v。

15、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述r3試劑溶于稀釋液中的濃度為0.05-2.0μg/ml。

16、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述r4試劑中生物素標(biāo)記的ceacam6單克隆抗體溶于稀釋液中的濃度為0.5-4.0μg/ml。

17、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述檸檬酸緩沖液的濃度為50-100mm，ph為6.0-7.0。

18、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述檸檬酸緩沖液包含1％-2％w/v?bsa及50-250μg/ml阻斷劑。

19、進(jìn)一步可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述r3試劑溶于的稀釋液中，其中檸檬酸緩沖液包含50μg/ml阻斷劑。

20、進(jìn)一步可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述r4試劑的稀釋液中，其中檸檬酸緩沖液包含250μg/ml阻斷劑。

21、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述檸檬酸緩沖液包含0.01％-0.1％v/vproclin?300防腐劑。

22、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述r1試劑中的磁性微粒的粒徑為1.0-3.0μm。

23、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述r1試劑以0.5mg/ml-1.5mg/ml的濃度溶于緩沖液中。

24、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述測(cè)定試劑盒還包括校準(zhǔn)品及質(zhì)控品。

25、第二方面，本發(fā)明提供一種基于磁微?；瘜W(xué)發(fā)光的癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子6測(cè)定試劑盒的制備方法，該方法包括以下步驟：

26、制備r1試劑，

27、制備r3試劑，

28、制備r4試劑，其中，

29、所述r1試劑為鏈霉親和素包被的磁性微?；騝eacam6單克隆抗體包被的磁性微粒；

30、所述制備r3試劑包括：將ceacam6單克隆抗體與吖啶酯進(jìn)行偶聯(lián)獲得吖啶酯標(biāo)記的ceacam6單克隆抗體，并用稀釋液稀釋；

31、所述制備r4試劑包括：稀釋液，或當(dāng)r1試劑為鏈霉親和素包被的磁性微粒時(shí)，將ceacam6單克隆抗體與生物素進(jìn)行偶聯(lián)獲得生物素標(biāo)記的ceacam6單克隆抗體，并用稀釋液稀釋；

32、所述稀釋液為包含生物表面活性劑的檸檬酸緩沖液。

33、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述生物表面活性劑的濃度為0.05％-0.5％w/v。

34、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述生物表面活性劑包括鼠李糖脂、槐糖酯、甘露糖赤蘚糖醇脂或表面活性素中的一種或幾種。

35、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述稀釋液中還包含非離子型表面活性劑的檸檬酸緩沖液。

36、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述非離子型表面活性劑的濃度為0.1％-1％v/v。

37、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述非離子型表面活性劑包括吐溫20、吐溫80或聚乙二醇辛基苯基醚其中的一種或兩種的組合。

38、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述r3試劑用稀釋液稀釋至0.05-2.0μg/ml。

39、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述生物素標(biāo)記的ceacam6單克隆抗體用稀釋液稀釋至0.5-4.0μg/ml。

40、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述檸檬酸緩沖液的濃度為50-100mm，ph為6.0-7.0。

41、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述檸檬酸緩沖液包含1％-2％w/v?bsa及50-250μg/ml阻斷劑。

42、進(jìn)一步可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述r3試劑溶于的稀釋液中，其中檸檬酸緩沖液包含50μg/ml阻斷劑。

43、進(jìn)一步可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述r4試劑的稀釋液中，其中檸檬酸緩沖液包含250μg/ml阻斷劑。

44、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述檸檬酸緩沖液包含0.01％-0.1％v/vproclin?300防腐劑。

45、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述制備r1試劑包括：10-100mm?ph?5-6的2-嗎啉乙磺酸溶液中加入0.5-1.5mg/ml的磁性微粒、0.05-0.15mg/ml的鏈霉親和素或ceacam6單克隆抗體，及10mg/ml?1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺，制備包被鏈霉親和素或ceacam6單克隆抗體的磁性微粒，用100-200mm?tris-hcl緩沖液配制包被鏈霉親和素或ceacam6單克隆抗體的磁性微粒濃度為0.5mg/ml-1.5mg/ml。

46、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法還包括：制備校準(zhǔn)品。

47、進(jìn)一步可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述制備校準(zhǔn)品的步驟包括：用含有1％-2％w/v?bsa、0.3％-0.7％v/v甘油、0.05-0.15％v/v吐溫20、0.1％v/v?proclin?300防腐劑的50-200mm?pbs緩沖液，ph為7.0-7.5，將ceacam6抗原稀釋成校準(zhǔn)品。

48、進(jìn)一步可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述校準(zhǔn)品包括校準(zhǔn)品1、校準(zhǔn)品2，所述校準(zhǔn)品1為100.00±20.00pg/ml，所述校準(zhǔn)品2為5000±1000pg/ml。

49、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法還包括：制備質(zhì)控品。

50、進(jìn)一步可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述制備質(zhì)控品的步驟包括：用含有1％-2％w/v?bsa、10％-30％v/v新生牛血清、0.05-0.15％v/v吐溫20、0.1％v/v?proclin300防腐劑的50-200mm?pbs緩沖液，ph為7.0-7.5，將ceacam6抗原稀釋成質(zhì)控品。

51、進(jìn)一步可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述質(zhì)控品包括質(zhì)控品1、質(zhì)控品2，所述質(zhì)控品1為100.00±20.00pg/ml，所述質(zhì)控品2為5000±1000pg/ml。

52、第三方面，本發(fā)明提供一種測(cè)定試劑盒在癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子6測(cè)定中的應(yīng)用，所述測(cè)定試劑盒為如以上任意一項(xiàng)所述的測(cè)定試劑盒，或如以上任意一項(xiàng)所述的方法制備的測(cè)定試劑盒。

53、第四方面，本發(fā)明提供一種基于磁微粒化學(xué)發(fā)光的癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子6檢測(cè)方法，其包括：將待測(cè)樣品加入測(cè)定試劑盒中進(jìn)行溫育后測(cè)試，所述方法不以疾病的診斷或治療為直接目的，所述測(cè)定試劑盒為如以上任意一項(xiàng)所述的測(cè)定試劑盒，或如以上任意一項(xiàng)所述的方法制備的測(cè)定試劑盒。

54、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述測(cè)定試劑盒的空白限低于5.0pg/ml，檢出限低于5.5pg/ml。

55、進(jìn)一步可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述測(cè)定試劑盒的空白限為4.638pg/ml，檢出限為5.019pg/ml。

56、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述測(cè)定試劑盒在10min內(nèi)達(dá)到最優(yōu)信噪比。

57、進(jìn)一步可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述測(cè)定試劑盒在6min達(dá)到最優(yōu)信噪比。

58、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述測(cè)定試劑盒的總變異系數(shù)cv＜2％。

59、進(jìn)一步可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述測(cè)定試劑盒的總變異系數(shù)cv＜1.6％。

60、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述測(cè)定試劑盒的日間精密度為日間總變異系數(shù)cv＜5％。

61、進(jìn)一步可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述測(cè)定試劑盒的日間精密度為日間總變異系數(shù)cv＜3.5％。

62、可選的，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子6測(cè)定試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

63、1.吸取樣本，加入r1試劑：鏈霉親合素或ceacam6單克隆抗體包被的磁性微粒，r4試劑：生物素標(biāo)記的ceacam6單克隆抗體或稀釋液，以及r3試劑：吖啶酯或堿性磷酸酶或三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記的ceacam6單克隆抗體，溫育6min，樣本中的ceacam6與生物素標(biāo)記抗體和吖啶酯等標(biāo)記抗體形成抗原抗體夾心復(fù)合物并通過生物素與鏈霉親合素/ceacam6單克隆抗體間的反應(yīng)結(jié)合到磁性微粒上。

64、2.檢測(cè)讀數(shù)：溫育結(jié)束后，加磁場(chǎng)沉淀，去掉上清液，用清洗液清洗沉淀復(fù)合物，并吸干廢液，除去未與磁性微粒結(jié)合的物質(zhì)，再將反應(yīng)杯送入測(cè)量室中。儀器自動(dòng)泵入激發(fā)液，使復(fù)合物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，通過光電倍增器測(cè)量發(fā)光強(qiáng)度。

65、3.儀器自動(dòng)通過工作曲線計(jì)算得出檢測(cè)結(jié)果。

66、有益效果：本發(fā)明采用磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析法與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法相比，具有檢測(cè)時(shí)間短、線性范圍寬、精密度好、樣本用量小、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、特異性好等特點(diǎn)；r3試劑和r4試劑的稀釋液采用生物表面活性劑和/或常規(guī)表面活性劑的組合，進(jìn)一步提高靈敏度并縮短反應(yīng)時(shí)間。