一種集成提取電極的體電化學傳感器及其制備方法

本發明涉及葡萄糖監測，尤其是涉及一種集成提取電極的體電化學傳感器及其制備方法。

背景技術：

1、糖尿病是一種威脅人類健康和生命的世界性慢性病，隨著人們生活水平的提高，糖尿病發病率逐年升高。據國際糖尿病聯盟統計，2021年全球糖尿病患者人數已達5.37億，其中中國糖尿病患者人數約1.41億，對糖尿病的預防與治療刻不容緩。

2、目前主流的血糖測量方法仍然是有創測量，患者通常采用手指采血測量血糖濃度。這種測量方式不僅會給患者帶來痛苦，而且做不到連續血糖測量，容易丟失血糖變化的關鍵信息。為了實現無創或微創的連續血糖監測，人們嘗試了多種方法，例如體外進行光學檢測的無創手段，使用植入式傳感器直接測量皮下葡萄糖的微創手段，對汗液、唾液或淚液等體液進行檢測從而推算血糖濃度的無創或微創測量手段。然而，這些辦法都存在著一些局限性導致仍停留在研究階段，暫時無法實用化。

3、有研究發現，組織間質液中的葡萄糖濃度與血糖濃度具有高度相關性，因此可以通過檢測組織液中葡萄糖濃度來反映血糖濃度的大小及變化。檢測方法有植入式直接檢測和透皮抽取組織液檢測兩種方式。而透皮抽取檢測相對于植入式檢測來說由于更安全和便捷而得到了廣泛的研究。對于細胞間質液的透皮抽取存在較多的方法，包括紅外光法、超聲法、微針法、反離子電滲法等。其中基于反離子電滲法的細胞間質液透皮提取因為其結構簡單，易于集成而得到廣泛應用。

4、當前已有較多的基于反離子電滲法提取組織液結合電化學傳感器進行血糖監測的研究，但是結構多為“柔性基底+電極+含酶催化水凝膠”等多層結構，各層結構的機械形變系數不同，當傳感器隨皮膚發生形變時，各層形變量不同，易導致固定化酶的水凝膠破裂而產生酶泄漏，同時水凝膠隨體液累積易發生溶脹而導致酶泄露，酶泄露在影響傳感器準確性的同時也會降低其使用壽命。

5、傳統的面傳感器通常將酶固定在工作電極表面，電極面積小，固定酶載量低，而酶會不斷失活，且載量低意味著較短時間內即會失活達到傳感器所需的酶量極限，即較短的傳感器使用壽命，而且葡萄糖低催化分解速率會導致相鄰兩次檢測之間相互干擾。另一方面，傳統的面傳感器柔性基底通常不透氣或透氣性較差，體液容易累積進而橫向流失，隨之不斷流失的葡萄糖將導致測量準確性越來越低，較短時間內突破準確性要求區間，導致傳感器使用壽命短。

技術實現思路

1、本發明所要解決的技術問題在于提供一種集成提取電極的體電化學傳感器。

2、本發明所要解決的另一技術問題在于提供上述集成提取電極的體電化學傳感器的制備方法。

3、本發明所要解決的另一技術問題在于提供上述集成提取電極的體電化學傳感器的應用。

4、本發明采用的技術方案是：

5、一種集成提取電極的體電化學傳感器，包括葡萄糖傳感器工作電極(2)、葡萄糖參比電極(3)、輔助電極(4)、提取電極(5)、提取對電極(6)和隔離層(7)，在隔離層(7)一側所述葡萄糖傳感器工作電極(2)、葡萄糖參比電極(3)以及輔助電極(4)和提取電極(5)并列排布在含酶水凝膠中并位于同一平面，且提取電極(5)靠近工作電極(2)設置，所述提取對電極(6)在隔離層(7)另一側不含酶水凝膠中且也在該同一平面上。

6、上述集成提取電極的體電化學傳感器中：

7、葡萄糖傳感器工作電極(2)用于測量葡萄糖濃度；

8、葡萄糖參比電極(3)用于在不同濃度的環境中保持相對穩定電位；

9、輔助電極(4)用于與工作電極形成檢測回路；

10、提取電極(5)用于通過反離子電滲法透皮抽取組織液；

11、提取對電極(6)用于與提取電極對皮膚共同施加電壓；

12、隔離層(7)用于將提取電極與提取對電極絕緣隔離開。

13、上述集成提取電極的體電化學傳感器的電極形狀可以任意變化以適用不同的應用場景，需要保證工作電極(2)、參比電極(3)、輔助點擊(4)、提取電極(5)和提取對電極(6)排布在含酶水凝膠中的同一平面，提取電極(5)應靠近工作電極(2)，提取對電極(6)需要在絕緣隔離材料的另一側的不含酶水凝膠中并同樣在同一平面。

14、優選的，上述集成提取電極的體電化學傳感器，所述含酶水凝膠為兩性離子水凝膠框架包埋已吸附葡萄糖氧化酶(gox)的al2o3膠體顆粒并摻雜鉑納米顆粒(ptnps)。

15、優選的，上述集成提取電極的體電化學傳感器，所述含酶水凝膠是由下述方法制備得到的：

16、1)以al2o3納米顆粒乳濁液為乳化劑，加入葡萄糖氧化酶溶液，采用冰水浴法，振蕩制備負載酶的納米顆粒固定化酶溶液；

17、2)將甜菜堿單體溶于羧基化纖維素納米纖維溶液中，加入交聯劑后將溶液在冰水浴條件下進行超聲，再將交聯催化劑和熱引發劑加入溶液中，置于冰水浴中攪拌得到兩性離子聚合物溶液；

18、3)在步驟2)中得到的兩性離子聚合物溶液中加入鉑納米顆粒溶液，將溶液在冰水浴條件下混合均勻；

19、4)將納米顆粒固定化酶溶液加入步驟3)得到的兩性離子混合物溶液中，置于冰水浴中攪拌混合得到水凝膠溶液。

20、優選的，上述集成提取電極的體電化學傳感器，所述步驟1)中al2o3納米顆粒乳濁液濃度為0.1～5mg/ml，酶溶液濃度為10～50mg/ml；所述冰水浴溫度為-10～0℃，搖床振蕩轉速為100～200r/min，振蕩時間為15～45min。

21、優選的，上述集成提取電極的體電化學傳感器，所述步驟1)中al2o3納米顆粒乳濁液和酶溶液的體積比為1:1。

22、優選的，上述集成提取電極的體電化學傳感器，所述步驟2)中羧基化纖維素納米纖維溶液為質量分數1％～10％羧基化纖維素納米纖維溶液，所述甜菜堿單體為甜菜堿單體活性物含量為94％～98％的粉末；所述交聯劑為亞甲基雙丙烯酰胺，催化交聯劑為四甲基乙二胺，熱引發劑為過硫酸銨；所述超聲時間為30～60min，冰水浴溫度為-10～0℃，攪拌速度為300～450rpm，攪拌時間為3～15min。

23、優選的，上述集成提取電極的體電化學傳感器，所述甜菜堿單體為磺酸甜菜堿或磷酸酯甜菜堿。

24、優選的，上述集成提取電極的體電化學傳感器，所述步驟3)中金屬納米顆粒和兩性離子聚合物溶液的體積比為0.01～0.05：1，所述冰水浴溫度為-10～0℃。

25、優選的，上述集成提取電極的體電化學傳感器，所述步驟4)中納米顆粒固定化酶溶液和兩性離子混合溶液的體積比為0.1-10：1，所述冰水浴溫度為-10～0℃，攪拌速度為300～450rpm，攪拌時間為3～15min；所述熱水浴溫度為30～40℃，聚合時間為24～36h。

26、上述各混合物的配比均可以按比例增加或縮減。

27、優選的，上述集成提取電極的體電化學傳感器，所述隔離層(7)選擇生物兼容性好的柔性絕緣材料聚二甲基硅氧烷(pdms)。

28、優選的，上述集成提取電極的體電化學傳感器，所述葡萄糖傳感器工作電極(2)形狀為圓形，輔助電極(4)形狀為以工作電極為圓心的一部分圓弧，參比電極(3)形狀為以工作電極為圓心的另一部分圓弧，所述輔助電極(4)與參比電極(3)不互相連接，且輔助電極(4)與參比電極(3)嵌套在工作電極(2)外。

29、優選的，上述集成提取電極的體電化學傳感器，所述提取電極(5)形狀為半徑大于輔助電極(4)的圓弧，嵌套在輔助電極(4)外，提取對電極(6)為圓形，所述提取電極(5)與提取對電極(6)的面積相等。

30、優選的，上述集成提取電極的體電化學傳感器，所述葡萄糖傳感器工作電極(2)和輔助電極(4)的材料是碳。

31、優選的，上述集成提取電極的體電化學傳感器，所述葡萄糖傳感器參比電極(3)的材料是ag/agcl。

32、優選的，上述集成提取電極的體電化學傳感器，所述提取電極(5)和提取對電極(6)的材料是ag/agcl。

33、優選的，上述集成提取電極的體電化學傳感器，所述工作電極(2)、參比電極(3)和輔助電極(4)分別通過三根導線(9a、9b、9c)連接至檢測器，提取電極(5)通過和提取對電極(6)分別通過兩根導線(9d、9e)連接至提取電路，所述導線是含有絕緣外層的金屬，如金、銀、鉑或銅等。

34、上述集成提取電極的體電化學傳感器的制備方法，由絲網印刷、轉印、澆注三種方法結合加工而成，具體加工步驟如下：

35、a)利用絲網印刷工藝，將碳漿料印刷到pet(聚對苯二甲酸乙二醇酯)薄膜基底上，并用120℃的溫度燒結1h，形成工作電極和輔助電極；

36、b)利用絲網印刷工藝將ag/agcl漿料印刷到已印刷碳電極的pet薄膜基底上，并用120℃的溫度燒結1h，形成參比電極、提取電極和提取對電極；

37、c)利用3d打印加工出水凝膠澆注模具，將水凝膠溶液澆注到模具中，在不高于37℃的條件下固化后，形成厚約500μm的膜，作為傳感器的柔性基底，分別用含酶水凝膠溶液與不含酶水凝膠溶液澆注出含酶水凝膠基底和不含酶水凝膠基底；

38、d)將燒結后的工作電極、參比電極以及輔助電極和提取電極轉印到含酶水凝膠基底上，提取對電極轉印至不含酶水凝膠基底上；

39、e)利用環氧膠將各上述電極與導線連接；

40、f)將含酶水凝膠溶液澆注到已完成轉印的含酶水凝膠基底上，將不含酶水凝膠溶液澆注到已完成轉印的不含酶水凝膠基底上，之后在不高于37℃的條件下固化，形成厚約500μm的封裝層；

41、g)采用等離子體處理pdms表面后與含酶水凝膠及不含酶水凝膠鍵合，使兩塊水凝膠連接，pdms表面作為隔離層，得到集成提取電極的體電化學葡萄糖酶傳感器。

42、優選的，上述集成提取電極的體電化學傳感器的制備方法，所述水凝膠澆注模具為中部設有隔層的矩形容器。

43、本發明的有益效果是：

44、所述集成提取電極的體電化學傳感器，將提取電極、提取對電極和葡萄糖傳感器三電極共同集成在水凝膠中形成“水凝膠包裹電極”整體結構，該結構以含酶/鉑納米顆粒(ptnps)催化水凝膠同時作為柔性基底層和封裝層，構造大體積催化反應和電子傳遞空間，將電極包裹其中，使ptnps和工作電極一起組成有效工作電極體，形成自帶反應池的體電化學葡萄糖酶傳感器，使傳感器的有效工作電極空間由工作電極表面擴展到了整個水凝膠空間；傳感器制備結合澆注、絲網印刷和轉印三種方法，用絲網印刷加工所需電極，通過澆注方法形成水凝膠基底與封裝層，通過轉印方式將電極轉印到水凝膠基底上，最后用水凝膠封裝，形成“水凝膠包裹電極”整體結構，同時集成提取電極以應用反離子電滲透皮提取組織間液，可實現組織液透皮提取與檢測一體化，具有酶載量高且不容易發生酶泄露、大工作電極比表面積、高電子遷移率、高溶解氧環境的優點，有效的解決了連續檢測過程中相鄰兩次檢測之間干擾的問題，對低濃度葡萄糖檢測具有高靈敏度，可以通過反離子電滲法透皮提取人體的組織液并在原位實現連續血糖監測，是一種長壽命抗干擾高靈敏度表皮葡萄糖傳感器。