PCT熒光微球免疫層析檢測試劑卡及其制備方法與流程

本發明公開了一種檢測卡，具體涉及一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡，本發明還是涉及該pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡的制備方法。
背景技術：
：降鈣素原（procalcitonin,pct）是一個小分子蛋白，分子量約為13kda，通常由甲狀腺的c細胞產生。pct現已被看作是伴隨有全身性炎癥和敗血癥的主要標志物。pct由calc-1基因編碼，是降鈣素的前體。pct來源于降鈣素原前體，后者由141個氨基酸組成，去除信號肽（1-25位氨基酸）后得到含有116個氨基酸殘基的pct，pct經過連續的裂解，最終形成三個分子，分別是n端片段（n端pct，57個氨基酸殘基），降鈣素（32個氨基酸殘基）和抗鈣素（21個氨基酸殘基）。1993年，有報道發現pct水平在細菌系統感染患者中有所升高（1）。經證實，與炎癥相關的pct并非由甲狀腺c細胞產生，而是由所有薄壁組織和已分化類細胞產生（2-4）。pct是一種很理想的細菌感染標志物，因為它在正常人中濃度非常低，而病毒性感染只會使pct濃度略微升高。此外，pct更重要的診斷價值在于它的濃度與炎癥的嚴重程度密切相關。除了炎癥或敗血癥能引起pct升高外，手術、多處創傷、高溫休克、燒傷和心源性休克有時同樣可以導致pct濃度的升高。此外，多項研究已證實心臟手術或心臟移植后pct水平監測的重要性，pct的改變可以用來鑒別急性排斥反應和由細菌或者真菌引起的感染。在正常及健康的個體中，其血清濃度極低，僅為10-50pg/ml，一般方法檢測不到。在全身性細菌、真菌及寄生蟲感染，系統炎癥反應綜合癥、敗血癥、急慢性肺炎、急性胰腺炎、活動性肝炎、創傷等患者的血清pct水平異常增高，其濃度比正常水平大幾倍甚至上萬倍；其在病毒感染，自身免疫性疾病，器官移植排除反應等患者血清中的濃度不增高或輕微增高。這現象決定了pct的高度特異性，因此可用于此類疾病的鑒別診斷，在全身性細菌感染和膿毒癥輔助鑒別診斷、預后判斷、療效觀察等方面有很高的臨床價值，可廣泛用于icu病房、血液科、外科、內科、器官移植科、治療實驗室等。目前pct在醫院和血液系統廣泛使用標記免疫分析技術是放射免疫分析(ria)和酶免疫分析(eia)，但在實際應用中存在以下缺陷：放射免疫分析的放射性核素污染；酶聯免疫的酶的活性容易失活，酶的大分子標記容易影響被標記物的空間結構。免疫層析(lateralflowimmunoassay，lfia)技術是近幾年來國內外興起的一種快速診斷技術。lfia以硝酸纖維素膜(nc膜)為載體，先將特異的抗體(抗原)固定于nc膜的某一區帶，當膜條一端滴加樣品(尿液或血清)后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體(抗原)的區域時，樣品中相應的抗原(抗體)即與該抗體發生特異性結合，用免疫膠體金等染色可使該區域顯示一定的顏色，從而實現特異性的免疫診斷。目前的lfia快速檢測試劑盒多以膠體金、彩色乳膠顆粒或者熒光素作為標記物。基于膠體金標記技術開發的快速檢測產品，存在靈敏度低、主要應用于定性或者半定量、批間差異較大等問題；基于彩色乳膠顆粒雖然批間差異有所改善，但靈敏度依然較低，也只能說明定性或半定量；基于熒光素標記技術的免疫層析靈敏度得到很大提高，能進行定量檢測，但是由于樣本中含有較高的熒光本底信號，且stock位移較小，會對檢測產生較大的影響。時間分辨熒光(time-resolvedfluorescence，trf)是一種非同位素熒光標記物，與普通熒光相比，具有stock位移大，熒光壽命長等特點，可以有效的避免樣品中的本底熒光，以及激發光等雜散光的影響，因此相比普通的熒光具有更高的靈敏度和抗干擾能力。中國專利zl201610031801.3公開了一種時間分辨熒光定量檢測pct的試劑盒，但是該試劑盒對熒光微球抗體復合物制備要求高，-80℃低溫和需要凍干，檢測靈敏度低，僅0.1ng/ml，并且只能僅檢測血清，檢測時間長，需要20分鐘。技術實現要素：針對上述問題，本發明的目的是提供一種操作方便，可以同時檢測出低濃度和高濃度的pct抗原，并且檢測結果可靠的pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡。本發明的另外一個目的是提供上述檢測試劑卡的制備方法。為此，本發明提供的第一個技術方案是這樣的：一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡，包括底板，所述的底板上依次銜接有樣品墊、結合墊、包被膜和吸收墊，所述的結合墊噴涂有兩種不同粒徑熒光微球標記的pct抗體，以及熒光微球標記的雞igy；所述的包被膜t線位置包被有抗pct抗體，c線位置包被有羊抗雞igy。作為本發明的進一步優選，上述的一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡，所述的兩種不同粒徑熒光微球是粒徑為100nm熒光微球和300nm熒光微球。作為本發明的進一步優選，上述的一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡，所述的粒徑為100nm熒光微球和300nm熒光微球的比重為5:1~7:1。本發明提供的后一個技術方案為：一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡的制備方法，在底板上依次銜接有pvc底板、樣品墊、結合墊、硝酸纖維膜和吸水紙，所述的結合墊采用下述方法依次制得的：1）制備100nm熒光微球標記抗pct抗體在1ml0.1mph6.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸中加入100nm粒徑的熒光微球和抗pct抗體，兩者比重為1:5~1:20；加入10mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液，室溫反應30min，16000rpm離心30min，去上清，加入保存液，超聲混勻；2）制備300nm熒光微球標記抗pct抗體在1ml0.1mph6.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸中加入300nm粒徑的熒光微球和抗pct抗體，兩者比重為1:10~1:50；加入10mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液，室溫反應30min，16000rpm離心30min，去上清，加入保存液，超聲混勻；3）制備熒光微球標記雞igy抗體在1ml0.1mph6.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸中加入熒光微球和雞igy，兩者比重為1:5~1:20；加入10mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液，室溫反應30min。16000rpm離心30min，去上清，加入保存液，超聲混勻；4）將上述步驟1）和步驟2）所制備的100nm、300nm粒徑熒光微球按重量比5:1~7:1混合，混合后離心去上清，用添加了0.1%sds、1%bsa和0.5%peg20000的0.1m3-(n-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸復溶，得混合標記液，混合后的標記液與步驟3）熒光微球標記雞igy抗體按照重量比20:1混合，用噴金劃膜儀噴至聚酯纖維素膜上，噴量為3μl/cm，放入37℃烘箱，干燥8小時。進一步的，上述的一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡的制備方法，所述的包被膜的制備方法是反應膜上t線位置包被的是抗pct抗體，c線位置包被的是羊抗雞igy。進一步的，上述的一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡的制備方法，所述的樣品墊的制備方法將樣品墊裁成20mm×300mm的大小，浸泡在樣品墊緩沖液中，1小時之后取出，于室溫干燥16-18小時；所述的樣品墊緩沖液配方如下：2%山梨糖、0.5%s9和0.1mg/ml兔抗人紅細胞抗體溶解于0.2mpbph7.4緩沖液中。進一步的，上述的一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡的制備方法，所述的熒光微球的固含量1%。進一步的，上述的一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡的制備方法，所述的保存液為：10%蔗糖、1.5%bsa溶解于0.1mgly-naoh溶液中。與現有技術相比，本發明提供的pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡具有如下優點：本發明提供的技術方案具體檢測時將稀釋后的樣品（血清、血漿、全血）加入樣品墊時，樣品依次透過樣品墊，結合墊，在毛細管作用樣品將沿著試劑條向吸收墊的方向移動。當樣品中含有高濃度pct時，樣品中的pct可同時與偶聯兩種粒徑（100nm和300nm）熒光微球的抗pct單克隆抗體和包被在nc膜上抗pct單克隆抗體發生特異結合，在t1處形成雙抗體夾心結構，此時在t線處的熒光強度為兩種粒徑熒光微球的總和。當樣品中pct的濃度低時，樣品中的pct主要與偶聯300nm粒徑的熒光微球的抗pct單克隆抗體和包被在nc膜上抗pct單克隆抗體發生特異結合，在t處形成雙抗體夾心結構，此時在t線處的熒光強度為300nm粒徑熒光微球的熒光；有效解決了粒徑小的熒光微球能檢測出高濃度的pct抗原而在低濃度時無法檢測，粒徑大的熒光微球能檢測出低濃度的抗原，而在高濃度出無法檢測，本發明提供的技術方案選擇兩種粒徑微球可以同時檢測出低濃度和高濃度的pct抗原，檢測靈敏度高。附圖說明圖1是本發明提供的pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡結構示意圖。圖2是本發明提供的pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡檢測曲線圖。具體實施方式下面結合具體實施方式，對本發明的權利要求做進一步的限定，但是不構成對本發明的任何限制。實施例1本發明提供的一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡，參閱圖1，包括底板1，所述的底板1上依次銜接有樣品墊2、結合墊3、包被膜4和吸收墊5，所述的結合墊3噴涂有粒徑為100nm熒光微球標記的pct抗體和300nm熒光微球標記的pct抗體，以及熒光微球標記的雞igy；所述的粒徑為100nm熒光微球和300nm熒光微球的比重為5:1~7:1；所述的包被膜t線位置包被有抗pct抗體，c線位置包被有羊抗雞igy。上述的pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡的制備方法：（1）樣品墊的制備方法樣品墊的緩沖液配方如下：2%山梨糖、0.5%s9和0.1mg/ml兔抗人紅細胞抗體溶解于0.2mpb（ph7.4）緩沖液中。（2）結合墊的制備方法100nm熒光微球標記抗pct抗體的步驟在1ml0.1mph6.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸中加入100nm粒徑的熒光微球（固含量1%）和抗pct抗體，兩者比重為1:5~1:20；加入10mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc）溶液，室溫反應30min，16000rpm離心30min，去上清，加入保存液，超聲混勻。300nm熒光微球標記抗pct抗體的步驟在1ml0.1mph6.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸中加入300nm粒徑的熒光微球（固含量1%）和抗pct抗體，兩者比重為1:10~1:50；加入10mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc）溶液，室溫反應30min。16000rpm離心30min，去上清，加入保存液，超聲混勻。所述的熒光微球標記雞igy抗體的步驟為：在1ml0.1mph6.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸中加入熒光微球（固含量1%）和雞igy，兩者比重為1:5~1:20；加入10mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc）溶液，室溫反應30min。16000rpm離心30min，去上清，加入保存液，超聲混勻。所述的保存液為：10%蔗糖、1.5%bsa溶解于0.1mgly-naoh溶液中。將所制備的100nm、300nm粒徑熒光微球按重量比5:1~7:1混合（優選6:1），混合后離心去上清，用添加了0.1%sds、1%bsa和0.5%peg20000的0.1m3-(n-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸復溶，得混合標記液，混合后的標記液與步驟3）熒光微球標記雞igy抗體按照重量比20:1混合，用噴金劃膜儀噴至聚酯纖維素膜上，噴量為3μl/cm，放入37℃烘箱，干燥8小時。（3）包被膜的制備方法為：在檢測線t線將0.01m的pbs（ph7.4含1%的葡萄糖）將抗pct抗體稀釋至1mg/ml，進行畫膜，畫膜參數為1μl/cm。在檢測線c線將0.01m的pbs（ph7.4含1%的葡萄糖）將羊抗雞igy抗體稀釋至1mg/ml，進行畫膜，畫膜參數為1μl/cm，再在37℃烘箱干燥，干燥時間16h。上述的pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡的組裝方法如下：各組件在底板上的排列順序依次為吸收墊--硝酸纖維素膜--結合墊--樣品墊①吸收墊的粘貼：將底板平鋪于工作臺面上；揭開底板上緣吸收墊粘貼處的保護膜，將吸收墊粘附于其上，均勻、輕微滾動式推進，以加強粘合力，并防止產生氣泡，吸收墊覆蓋在硝酸纖維素膜上2mm。②結合墊粘貼：將結合墊裁為寬15mm×長300mm，揭開硝酸纖維素膜下緣結合墊粘貼處的保護膜，將結合墊粘附于其上，方法同吸收墊，結合墊覆蓋在硝酸纖維素膜上2mm。③樣品墊的粘貼：將樣品墊粘附于結合墊下部，方法同吸收墊。樣品墊覆蓋在結合墊上2mm。④試紙條切割：將粘貼好的底板放入切條機中，切成4mm寬的試紙條。⑤裝卡與入袋：將每一試紙條裝入塑料卡內，將每一試劑卡置于鋁膜袋中，并加入1g干燥劑1包，熱合封口。pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡的具體使用方法：打開儀器，插入與試劑批號相同的芯片；使用時除去試劑卡外包裝，取出試劑卡，水平放置；精確吸取稀釋后75μl血清/血漿，或100μl全血樣品，加入到檢測卡的加樣孔中，然后開始計時；待室溫反應10min后，將檢測卡放入到儀器的卡槽中；點擊儀器上的“測試”按鍵，儀器將開始測試，并顯示結果；點擊“打印”，可打印檢測結果報告。本發明型pct的檢測原理如下：將樣品（血清、血漿、全血）加入樣品孔時，樣品依次透過樣品墊，結合墊，在毛細管作用樣品將沿著試劑條向吸收墊的方向移動。當樣品中含有高濃度pct時，樣品中的pct可同時與偶聯兩種粒徑（100nm和300nm）熒光微球的抗pct單克隆抗體和包被在nc膜上抗pct單克隆抗體發生特異結合，在t處形成雙抗體夾心結構。此時在t線處的熒光強度為兩種粒徑熒光微球的總和。當樣品中pct的濃度低時，樣品中的pct主要與偶聯300nm粒徑的熒光微球的抗pct單克隆抗體和包被在nc膜上抗pct單克隆抗體發生特異結合，在t處形成雙抗體夾心結構,此時在t線處的熒光強度為300nm粒徑熒光微球的熒光。這樣有效避免了在粒徑小的熒光微球能檢測出高濃度的pct抗原而在低濃度時無法檢測，粒徑大的熒光微球能檢測出低濃度的抗原，而在高濃度出無法檢測。選擇一定比例的兩種粒徑微球可以同時檢測出低濃度和高濃度的pct抗原。為了證明本發明提供的技術方案的效果，下述試驗例將pct校準品，稀釋濃度至0.05ng/ml、0.5ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的樣本，使用移液器取75μl的樣本加入加樣孔中，靜置10分鐘后放入熒光檢測儀中讀值。每個樣本濃度檢測三次，取平均值后以樣本濃度值對檢測值作圖，參閱圖2。標準品0ng/ml0.05ng/ml0.5ng/ml5ng/ml50ng/ml100ng/ml檢測t/c值0.0250.0450.171.0210.319.8為了更好的說明本發明型的有益效果，下面給出采用本發明型提供的檢測試劑與傳統的酶聯免疫分析法、膠體金法、熒光免疫層析法在檢測pct時的結果對比實驗。檢測方法專利公開號檢測限化學發光cn106093416a0.05ng/ml膠體金免疫層析cn106093431a0.1ng/ml膠乳增強免疫比濁cn102759631b0.2ng/ml熒光免疫層析cn104714033b0.1ng/ml本發明提供的方法0.05ng/ml上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁12