本發明屬于免疫診斷技術領域，具體涉及一種熒光定量檢測抗繆勒氏管激素（amh）的免疫層析試紙條及其制備方法。
背景技術：
抗繆勒氏管激素(anti-müllerianhormone，amh)是轉化生長因子-β(tgf-β)超家族成員，是一種由2個55kdan端和2個12.5kdac端的同源二聚體組成的糖蛋白，為結合二硫鍵的非共價鍵。對于男性而言，amh激素是由睪丸支持細胞生成，始于胚胎形成，并貫穿生命始終，在胚胎發育期間，amh會引起繆勒氏管退化，形成正常的男性生殖管道。對于女性而言，amh激素是由卵泡顆粒細胞生成的，直至女性更年期，amh激素水平逐漸下降至無法檢測的水平。
研究表明：amh在調控卵泡生長和發育，維持卵巢儲備功能中發揮重要作用，amh水平與卵巢儲備功能呈明顯的正相關性。相對于傳統的預測卵巢儲備及卵巢反應性的方法（年齡及竇卵泡數目（afc），卵泡刺激素（fsh）和雌二醇（e2）等），檢測血清amh有如下優勢：（1）可更早、更靈敏低反應卵巢儲備功能的改變；（2）不受垂體促性腺激素和經期的影響，在整個月經周期中數值變化不大；（3）在監測卵巢儲備力、預測體外受精聯合胚胎移植技術（ivf）的卵巢反應性、預防卵巢過度刺激綜合癥（ohss）、多囊卵巢綜合癥（pcos）的診斷中具體其他指標不可比擬的優勢。amh是目前預測卵巢反應性、評估卵巢儲備功能的最理想的生物標志物。
目前臨床上amh的檢測方法有酶聯免疫法（elisa）、電化學發光法和化學發光法，這些方法都有各自的優點和不足。elisa法檢測步驟多、耗時長，操作過程的影響因素較多，易造成假陽性和假陰性結果。因此目前逐步被化學發光法替代，但這類方法為全封閉系統，價格昂貴，需要專門培訓儀器使用人員，維修及檢測成本高，并且不適合單人份和小批量檢測用，目前不利于amh檢測在國內的廣泛開展。
鑒于目前尚無快速、準確的定量檢測amh的方法，本發明的目的是提供一種可用于快速定量檢測amh的免疫層析試紙條，用于評估和監測女性的卵巢儲備功能，所述試劑具有操作簡單、方便快捷、經濟、準確定量等優點，更適用于在各醫療機構廣泛開展。
技術實現要素：
本發明的目的在于針對現有技術中存在的不足，提供一種操作簡單、方便快捷、經濟、測定準確的amh檢測試紙條。
為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：
一種熒光定量檢測amh的免疫層析試紙條，由樣品墊、標記墊、包被膜、吸水紙順次搭接在pvc底板上構成，所述的標記墊和所述的樣品墊相接，所述的包被膜和所述的標記墊相接，所述的吸水紙和所述的包被膜相接；所述標記墊上噴涂有熒光微球標記的amh單克隆抗體和熒光微球標記的親和素；所述包被膜包含檢測線和質控線，所述檢測線包被有與所述熒光微球標記的amh單克隆抗體處于不同表位的另一種amh單克隆抗體，所述質控線包被有特異性識別親和素的兔抗親和素抗體。
優選地，所述熒光微球標記的amh單克隆抗體的濃度為0.1~1.0mg/ml，稀釋比例為5%~20%。所述熒光微球標記的親和素的濃度為0.1~1.0mg/ml，稀釋比例為0.5%~5%。所述含熒光微球標記的amh單克隆抗體和熒光微球標記的親和素的標記墊處理液的噴量為3~6μl/cm。
優選地，所述熒光微球的粒徑為100~500nm。所述熒光微球的激發波長為310~550nm，發射波長為340~620nm。
優選地，所述包被膜檢測線上包被的amh單克隆抗體的濃度為0.5~2mg/ml，噴量0.1~0.2μl/mm。所述質控線上包被的兔抗親和素抗體的濃度為0.5~2mg/ml，噴量0.1~0.2μl/mm。
本發明還提供一種熒光定量檢測amh的免疫層析試紙條的方法，包括以下步驟：
（1）熒光微球標記蛋白的制備
取一定量的熒光微球，10000~15000rpm第一次離心5~15分鐘，第一次離心分離得到的沉淀物用10~100mmph6.0~7.0磷酸鹽緩沖液調節濃度為0.1%~1%，并超聲分散；加入終濃度為0.1~5mg/ml的碳二亞胺（edc），混勻，再加入終濃度為0.1~5mg/ml的n-羥基琥珀酰亞胺（nhs），混勻；室溫孵育20~40分鐘后10000~15000rpm第二次離心5~15分鐘，第二次離心分離得到的沉淀物用10~100mmph6.0~7.0磷酸鹽緩沖液溶解。將復溶后的熒光微球超聲分散，按照0.1~1.0mg/ml熒光微球的比例分別加入amh單克隆抗體和親和素，混勻后室溫旋轉混合反應1.5~3小時，10000~15000rpm第三次離心5~15分鐘，第三次離心分離得到的沉淀物用含10~40mm乙醇胺和0.05%-1%酪蛋白的tris-hcl（10~40mm，ph7.0-8.0）復溶，超聲分散后旋轉混合反應0.5~1小時。10000~15000rpm第四次離心5~15分鐘，第四次離心分離得到的沉淀物用微球保存液復溶，2~8℃保存。
（2）樣品墊的預處理
將樣品墊用封閉液浸泡5分鐘后，置于濕度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥12~24h后于2~30℃密封保存；所述封閉液含0.1~1%的tris，0.1~1%的tween20，0.1~1%的酪蛋白，0.1~2%的peg20000，0.005~0.05%的鼠抗人紅細胞。
（3）標記墊的制備
將熒光微球標記的amh單克隆抗體和熒光微球標記的親和素分別按5%~20%和0.5%~5%的稀釋比例用標記墊處理液噴涂在標記墊上，噴量為3~6μl/cm。所述標記墊處理液中含有0.2~2%的酪蛋白，5%~20%的蔗糖，0.1~1%的tween-20，0.1~0.5%的pvp40，0.02~0.05%的proclin300，0.01~0.05m、ph7.4的pbs緩沖液。將制備好的標記墊置于濕度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥12~24h后于2~30℃密封保存。
（4）包被膜的制備
分別將另一amh單克隆抗體和兔抗親和素用包被緩沖液調節濃度為0.5~2mg/ml，將amh單克隆抗體噴到包被膜（3）上的檢測線，將兔抗親和素抗體噴到包被膜（3）上的質控線，所述amh單克隆抗體和兔抗親和素抗體的用量按膜包被液量均為0.1~0.2μl/mm，檢測線和質控線間隔4~8mm，濕度＜20%的40~50℃的烘箱，干燥24~72h后于2~30℃密封保存，備用。
在底板上順次相互搭接地黏貼樣品墊、標記墊、包被膜和吸水紙得到試紙板，按照切割要求切割成3~4mm寬度的試紙條。
本發明所述的amh的免疫層析試紙條的檢測原理是雙抗體夾心法，樣本墊中的amh抗原在層析作用下與標記墊上熒光微球標記的amh抗體結合形成復合物，該復合物在層析作用下移動至包被膜的檢測線，在包被膜檢測線上包被有識別amh抗原另一表位的抗體，形成雙抗體夾心復合物，復合物聚集在包被膜的檢測線處，受到光源激發釋放出相應波長的發射光，樣本中抗原濃度越高，檢測線發射光的強度越高，通過熒光檢測系統將光信號轉化為數字信號，以濃度點為橫坐標，檢測線信號值比質控線信號值（t/c）為縱坐標繪制標準曲線，從而可準確定量的計算出樣本中amh的濃度。
本發明與現有技術相比，有如下優點：
本發明檢測線和質控線采用獨立的反應系統，互不干擾和影響，并采用t/c值的方式進行定標，保證了測試結果的準確度。
本發明采用熒光免疫層析法，該檢測方法靈敏度高、操作簡單、成本低。可檢測血液樣本中濃度低至0.1ng/ml的抗繆勒氏管激素，使用的檢測儀無需專業操作人員，15分鐘即可得到檢測結果。
本發明將熒光免疫層析技術引入amh的檢測中，結合熒光檢測儀，實現amh的單人份定量檢測，為臨床使用提供了極大的便利。
附圖說明
圖1為本發明的熒光定量檢測amh免疫層析試紙條的結構示意圖；
附圖標記：1、樣品墊；2、標記墊；3、包被膜；4、吸水紙；5、檢測線；6、質控線；7、底板。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進一步詳細描述，應當理解為，以下實施例是為了方便本領域技術人員對本發明方案的理解，但不作為對本發明的限定。
實施例1
amh熒光免疫層析試紙條的制備：
（1）熒光微球標記蛋白的制備
取0.1ml10%熒光微球，15000rpm第一次離心15分鐘，沉淀物用50mmph6.5磷酸鹽緩沖液調節濃度為1%，并超聲分散；加入終濃度為2mg/ml的碳二亞胺（edc），混勻，再加入終濃度為5mg/ml的n-羥基琥珀酰亞胺（nhs），混勻；室溫孵育20分鐘后15000rpm第二次離心15分鐘，沉淀物用50mmph6.5磷酸鹽緩沖液溶解。將復溶后的熒光微球超聲分散，并分兩管分別加入0.2mgamh單克隆抗體和0.1mg親和素，混勻后室溫旋轉混合反應2小時，15000rpm第三次離心15分鐘，沉淀物用含30mm乙醇胺和0.5%酪蛋白的tris-hcl（20mm，ph8.0）復溶，超聲分散后旋轉混合反應1小時，15000rpm第四次離心15分鐘，沉淀用微球保存液復溶，2~8℃保存。
（2）樣品墊的預處理
將樣品墊用封閉液浸泡5分鐘后，置于濕度＜20%的50℃的烘箱，干燥12h后于20~30℃密封保存。所述封閉液含0.1%的tris，1%的tween20，0.5%的酪蛋白，1%的peg20000，0.01%的鼠抗人紅細胞。
（3）標記墊的制備
將熒光微球標記的amh單克隆抗體和熒光微球標記的親和素分別按10%和1%的稀釋比例用標記墊處理液噴涂在標記墊上，噴量為4μl/cm，所述標記墊處理液中含有0.5%的酪蛋白，5%的蔗糖，1%的tween-20，0.5%的pvp40，0.03%的proclin300，0.05m、ph7.4的pbs緩沖液。將制備好的標記墊置于濕度＜20%的50℃的烘箱，干燥24h后于20~30℃密封保存。
（4）包被膜的制備
分別將另一amh單克隆抗體和兔抗親和素用包被緩沖液調節濃度為1.0mg/ml，將amh單克隆抗體噴到包被膜（3）上的檢測線，將兔抗親和素噴到包被膜（3）上的質控線（6），所述amh單克隆抗體和兔抗親和素的用量按膜包被液量均為0.1μl/mm，檢測線（5）和質控線（6）間隔4mm，濕度＜20%的50℃的烘箱，干燥72h后于20~30℃密封保存，備用。
（5）在底板上順次相互搭接地黏貼樣品墊（1）、標記墊（2）、包被膜（3）和吸水紙（4）得到試紙板，按照切割要求切割成4mm寬度的試紙條。
實施例2
熒光免疫層析定量檢測血樣中抗繆勒氏管激素（amh）的濃度
（1）標準曲線繪制
將amh抗原用陰性血漿配制成25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、1.0ng/ml、0.5ng/ml、0.1ng/ml、0ng/ml，用同一批次的試劑，每個濃度點測試6次。以檢測線（t帶）、質控線（c帶）的熒光強度比值為縱坐標，amh參考品濃度為橫坐標，建立方程并擬合成標準曲線，將標曲信息用燒錄軟件寫到id芯片中。
（2）樣品的檢測：
從試劑盒中取出檢測條，撕開鋁箔袋包裝后，平放檢測條，平衡5分鐘，取100μl樣本加入加樣孔中，室溫避光反應15分鐘。將id芯片插入熒光檢測儀，將檢測卡插入熒光儀插卡口，點擊“測試”，儀器通過分析軟件自動計算出待測樣本中amh的濃度。
（3）與深圳市亞輝龍抗繆勒氏管激素檢測試劑盒（化學發光法）檢測的相關性比較。
采用本發明的試紙條與亞輝龍抗繆勒氏管激素檢測試劑盒對40例人血清樣本進行檢測，測定結果顯示，在本試紙條檢測范圍內（0.1~25ng/ml），兩種試劑的相關性r2＞0.95（y=1.042x+0.692）。
實施例3
請參照圖1，一種熒光定量檢測amh的免疫層析試紙條，所述的免疫層析試紙條包括有pvc底板7，所述的pcv底板7上依次設有樣品墊1、標記墊2、包被膜3、吸水紙4，所述的標記墊2和所述的樣品墊1相接，所述的包被膜3和所述的標記墊2相接，所述的吸水紙4和所述的包被膜3相接；所述標記墊2上噴涂有熒光微球標記的amh單克隆抗體和熒光微球標記的親和素；所述包被膜3上設有檢測線5和質控線6，檢測線5和質控線6間隔4~8mm，所述檢測線5包被有與所述熒光微球標記的amh單克隆抗體處于不同表位的另一種amh單克隆抗體，所述質控線6包被有特異性識別親和素的兔抗親和素抗體。
目前市面上amh的檢測僅有適合醫院檢驗科用于批量檢測的酶聯免疫法（elisa）、化學發光（clia）、電化學發光法，還沒有適合單人份、快速檢測、即時出結果的檢測試劑。本專利所述amh檢測試劑在高靈敏檢測amh的同時又能大大縮短檢測時間，為臨床檢驗及使用帶來極大方便，更適合臨床科室操作。