一種普拉康唑光學異構體的分析檢測方法與流程

本發明屬于藥物分析領域，具體涉及一種普拉康唑光學異構體的分析檢測方法。

背景技術：

普拉康唑(pramiconazole，sr型)，化學名1-(4-{4-[4-({(2s,4r)-4-(2,4-二氟苯基)-4-[(1h-1,2,4-三唑-1-基)甲基]-1,3-二氧戊環-2-基}甲氧基)苯基]哌嗪-1-基}苯基)-3-(丙烷-2-基)咪唑烷酮-2-烷，是由比利時barriertherapeutics公司開發研制的一種新型三唑類抗真菌藥，目前在歐盟尚處于ⅱa期臨床試驗階段，尚未上市，具有療效確切，耐受性好，不良反應程度較輕的特點，是一種較有發展前途的廣譜抗真菌藥。

普拉康唑結構中有2個手性碳，在合成過程中可能會產生4種光學異構體，除了目標化合物普拉康唑sr型外，還有rs型異構體、rr型異構體和ss型異構體。按照研發立體異構體新藥的相關技術要求，有必要建立一套完善的分析方法對普拉康唑的光學異構體雜質進行質量控制和產品質量評價。各異構體化學結構式如下所示：

鄭曦孜提供了一種普拉康唑中四種光學異構體的hplc測定方法(中國醫藥導報，2016年4月)，但是該方法采用的是手性色譜柱(daicelchiralpakic手性柱)。眾所周知，手性色譜柱較為昂貴，且使用壽命短，使用手性色譜柱開發的液相分析方法具有較高的應用成本。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種基于普通c18色譜柱測定普拉康唑中四種光學異構體的液相分析方法，以降低色譜耗材支出，節約研發經費。

本發明通過下面的技術方案得以實現：

一種普拉康唑光學異構體的分析檢測方法，采用液相色譜法，液相色譜法的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動相為乙腈水溶液，乙腈體積百分濃度為30-50％，該乙腈水溶液中含有有效濃度的4-叔丁基環己醇，且4-叔丁基環己醇為順反異構體混合物。

優選地，所述流動相中，4-叔丁基環己醇的有效濃度指質量體積濃度為1-2g/l。

優選地，所述的分析檢測方法包括如下色譜參數：

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠(c18)色譜柱；

流動相a相：30％乙腈水溶液，4-叔丁基環己醇的質量體積濃度為1.5g/l；

流動相b相：50％乙腈水溶液，4-叔丁基環己醇的質量體積濃度為1.5g/l；

洗脫程序：0-3min，0％b相；3-5min，0％→50％b相；5-10min，50％b相；

流速：0.8-1.2ml/min；

柱溫：28-32℃；

檢測波長：208-212nm。

優選地，流速為1.0ml/min。

優選地，柱溫為30℃。

優選地，檢測波長為210nm。

優選地，十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱的規格為長250mm、內徑4.6mm、填料粒徑5μm。

優選地，所述十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱優選thermoscientific^tmacclaim^tm120c18。

本發明的優點：

使用本發明提供的方法在普通c18色譜柱上即可實現普拉康唑光學異構體的有效分離，應用成本顯著降低，可以節省大量色譜柱耗材費用。

附圖說明

圖1為普拉康唑四種光學異構體的化學結構式比較；

圖2為普拉康唑四種光學異構體混合對照品溶液的hplc色譜圖；

圖3為供試品溶液在本發明色譜條件下的色譜圖；

圖4為混合對照品溶液在對比色譜條件下的色譜圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例進一步介紹本發明的技術方案。

實施例1普拉康唑光學異構體的分離和測定

一、實驗材料

島津lc-20a高效液相色譜儀；

cpa225d電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；

色譜柱：thermoscientific^tmacclaim^tm120c18；

普拉康唑原料藥自制，普拉康唑、rs型異構體、rr型異構體和ss型異構體對照品自制(純度大于98.5％)，普拉康唑及其異構體的化學結構式如圖1所示；

4-叔丁基環己醇(cas號98-52-2，順反異構體混合物，百靈威科技，產品編號107223)；

乙腈為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

二、實驗方法和結果

1、溶液配制

對照品和供試品稀釋液：30％乙腈水溶液，4-叔丁基環己醇的質量體積濃度為1.5g/l。

對照品溶液：分別精密稱取普拉康唑4種異構體標準品各約10mg，各置于100ml量瓶中，加上述稀釋液溶解并定容至刻度，搖勻，作為濃度為100μg/ml的對照品溶液。

混合對照品溶液：將4種異構體對照品溶液等體積混合，配制成4種異構體濃度分別約為25μg/ml的混合對照品溶液。

供試品溶液：精密稱取普拉康唑樣品100mg，置于100ml量瓶中，加上述稀釋液溶解并定容至刻度，搖勻，作為濃度為1mg/ml的供試品溶液。

2、色譜條件

色譜柱：thermoscientific^tmacclaim^tm120c18；

流動相a相：30％乙腈水溶液，4-叔丁基環己醇的質量體積濃度為1.5g/l；

流動相b相：50％乙腈水溶液，4-叔丁基環己醇的質量體積濃度為1.5g/l；

洗脫程序：0-3min，0％b相；3-5min，0％→50％b相；5-10min，50％b相；

流速：1.0ml/min；

柱溫：30℃；

檢測波長：210nm。

3、分離度考察

取普拉康唑4種異構體對照品溶液、混合對照品溶液，分別進樣測定，結果表明，4種異構體的出峰順序依次為rr型異構體、sr型異構體、rs型異構體、ss異構體型，普拉康唑及其光學異構體基線達到完全分離，分離度均大于1.5，理論板數均大于10000，拖尾因子均小于1.15，溶劑峰不干擾測定。色譜圖見圖2。

4、線性試驗

分別精密稱取4種異構體對照品適量，加稀釋液溶解并搖勻稀釋，配制成約0.5、5、10、20、50、80、100、120μg/ml的系列濃度溶液，進樣測定，以峰面積對濃度作圖，進行線性回歸，分別得到4種異構體的回歸方程，線性關系良好，r²＞0.9998。

5、靈敏度考察

精密稱取4種異構體對照品各適量，加稀釋液溶解并稀釋至4種異構體峰高約為基線噪音的3倍。結果各異構體的最低檢出限均約為1.2×10^-3μg，靈敏度高。

6、加樣回收率試驗

按常規方法配制回收率測定溶液，計算各異構體的回收率，結果證明普拉康唑4種異構體的回收率均在98-102％之間(rsd＜1.5％，n＝3)，符合要求。

7、精密度和穩定性試驗

取上述混合對照品溶液和供試品溶液，分別連續進樣6次，記錄色譜圖。結果rsd均小于2.0％(n＝6)，表明本方法精密度良好。

分別取上述混合對照品溶液和供試品溶液，于室溫放置，分別于0、4、8、12、24h進樣測定，記錄色譜圖。結果普拉康唑4種異構體的峰面積在24h內的rsd均小于2.0％(n＝5)，表明混合對照品溶液室溫放置24h穩定。

8、原料中異構體含量測定

取樣品適量，按上述方法制備混合對照品溶液和供試品溶液，分別進樣測定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中如有與混合對照品溶液色譜圖中各異構體保留時間相同的雜質峰，按外標法以峰面積計算各異構體的含量。供試品溶液色譜圖如圖3所示。

rr型異構體在三批樣品中的含量分別為0.02％、0.03％、0.02％；

rs型異構體在三批樣品中的含量分別為0.03％、0.02％、0.02％；

ss型異構體在三批樣品中的含量分別為0.03％、0.02％、0.03％。

實施例2對比實施例，使用普通的乙腈水洗脫

一、實驗材料

島津lc-20a高效液相色譜儀；

cpa225d電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；

色譜柱：thermoscientific^tmacclaim^tm120c18；

普拉康唑原料藥自制，普拉康唑、rs型異構體、rr型異構體和ss型異構體對照品自制(純度大于98.5％)，普拉康唑及其異構體的化學結構式如圖1所示；

乙腈為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

二、實驗方法和結果

1、溶液配制

對照品和供試品稀釋液：30％乙腈水溶液。

對照品溶液：分別精密稱取普拉康唑4種異構體標準品各約10mg，各置于100ml量瓶中，加上述稀釋液溶解并定容至刻度，搖勻，作為濃度為100μg/ml的對照品溶液。

混合對照品溶液：將4種異構體對照品溶液等體積混合，配制成4種異構體濃度分別約為25μg/ml的混合對照品溶液。

2、色譜條件

色譜柱：thermoscientific^tmacclaim^tm120c18；

流動相a相：30％乙腈水溶液；

流動相b相：50％乙腈水溶液；

洗脫程序：0-3min，0％b相；3-5min，0％→50％b相；5-10min，50％b相；

流速：1.0ml/min；

柱溫：30℃；

檢測波長：210nm。

3、分離度考察

取普拉康唑混合對照品溶液進樣測定，結果4種異構體在該色譜條件下無法實現兩兩分離。混合對照品溶液在該色譜條件下的色譜圖見圖4。

使用本發明提供的方法在普通c18色譜柱上即可實現普拉康唑光學異構體的有效分離，應用成本顯著降低，可以節省大量色譜柱耗材費用。