一種在線快速篩選和定量中藥中抗氧化活性成分的方法與流程
本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及一種既能篩選又能定量中藥中的抗氧化活性成分的方法。
背景技術：
近年來，科學家們越來越相信活性氧能夠破壞細胞的主要結構尤其是脂類和dna，然后引起細胞壞死，促進衰老甚至致癌。而抗氧化活性可清除氧自由基，從而抑制老年病，各種心腦血管疾病和神經退行性疾病，并且能預防癌癥的發生，延緩衰老。天然產物，尤其是中藥中已經被證明含有大量的抗氧化活性成分。因此，我們應該把中藥作為尋找抗氧化物的重點資源。
銀杏葉是一種具有抗氧化活性的中藥，被廣泛用于治療各種老年病。以銀杏葉提取物為主要原料制成的舒血寧注射液也同樣具有抗氧化活性，因其幾乎無副作用而常被用于治療冠心病，心絞痛和腦血管痙攣等心血管疾病。考慮到用藥的安全性，應該全面控制舒血寧注射液的質量。盡管已經有很多方法用于研究中藥中的抗氧化活性成分，如lc(s.lin,studiesonqualitycontrolofshuxueninginjections.tcmuniv.offujianmaster's(2014))，lc-ms(j.liang,adynamicmultiplereactionmonitoringmethodforthemultiplecomponentsquantificationofcomplextraditionalchinesemedicinepreparations:niuhuangshangqingpillasanexample,j.chromatogr.a,1294(2013)58-69)和gc-ms(y.hu,w.kong,x.yang,l.xie,j.wen,m.yang,gc-mscombinedwithchemometrictechniquesforthequalitycontrolandoriginaldiscriminationofcurcumaelongaerhizome:analysisofessentialoils,j.sep.sci.37(2014)404-411)，但是分析舒血寧注射液的方法卻很少。有人用lc-ms來研究舒血寧，但也只是測了其中各種活性成分的含量(j.zaiyou,w.wenquan,x.guifang,m.li,h.junling,comprehensivequalityevaluationofchishaobyhplc,nutrhosp.28(2013)1681-1687)。另一個存在的問題就是，現在已有的方法不能同時從藥理活性和含量兩方面綜合地對舒血寧進行質量評價。xiao-pingding,jinqi和yan-xuchang等人建立了一種在線hplc-dad-cl的方法結合抗氧化活性對銀杏葉進行質量控制(x.p.ding,q.jin,y.x.chang,l.l.mu,d.n.zhu,b.y.yu,p.s.xie,t.a.vanbeek,qualitycontrolofflavonoidsinginkgobilobaleavesbyhigh-performanceliquidchromatographywithdiodearraydetectionandon-lineradicalscavengingactivitydetection,j.chromatogr.a,1216(2009)2204-2210)。如果借鑒此方法來分析舒血寧注射液，會存在耗時長和有機溶劑消耗大等問題。
作為現代新興的一種分析手段，毛細管電泳(capillaryelectrophoresis，ce)因為具有易操作，分析時間段，高效和低耗的優點被廣泛應用在包括藥物分析(d.s.el,h.
自由基加入實驗是最初用于測定中藥及其制劑抗氧化活性的方法，此方法大多數通過酶標儀來實現，氧自由基主要使用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)和2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(abts+)。應用abts+來測定中藥或其制劑的抗氧化活性的方法一般都是結合紫外分光光度計的離線模式(s.h.hwang,z.wang,h.n.yoon,s.s.lim,xanthiumstrumariumasaninhibitorofα-glucosidase,proteintyrosinephosphatase1β,proteinglycationandabts+fordiabeticanditscomplication,molecules,21(2016)；x.wang,x.li,h.li,reassessmentofantioxidantactivityofbaicaleininvitro,asianj.pharm.biomed.research,1(2011)186-194)，很明顯，這種方法的操作需要一步步的進行離線反應、分離檢測，比較復雜。為了簡化操作，在線lc-abts+方法測定中藥抗氧化活性依次被報道(k.m.kalili,s.s.de,h.t.van,f.lynen,v.a.de,comprehensivetwo-dimensionalliquidchromatographycoupledtotheabtsradicalscavengingassay:apowerfulmethodfortheanalysisofphenolicantioxidants,anal.andbioanal.chem.406(2014)4233-4242；k.j.lee,n.y.song,y.c.oh,w.k.cho,j.y.ma,isolationandbioactivityanalysisofethylacetateextractfromacertegmentosumusinginvitroassayandon-linescreeninghplc-abts(+)system,j.anal.methodsinchem.2014(2014)150509；a.a.
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種在線快速篩選或/和定量中藥中的抗氧化活性成分的abts+-ce-dad方法，該法可適用于分離、篩選中藥及其注射液中的抗氧化活性成分并對樣品進行質量控制。
為了實現上述目的，本發明采用了以下技術方案：
一種在線快速篩選或/和定量中藥中的抗氧化活性成分的abts+-ce-dad方法，所述abts為2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽，所述ce為毛細管電泳儀，所述dad為二極管陣列檢測器，該法的毛細管電泳水相緩沖液的組成是為10mm～30mm磷酸鹽，0mm～10mm的β-環糊精，20mm～60mm的十二烷基硫酸鈉和體積百分比為2.5％～10％的乙腈，其中所述的磷酸鹽是通過nah2po4和na2hpo4混合得到的；所述毛細管電泳水相緩沖液的ph值為6.5～7.5；整個實驗過程中，電壓是18kv～22kv，卡盒的溫度控制在19℃～25℃；中藥樣品的檢測波長是360nm，abts+的檢測波長是405nm。
在一些實施方式中，所述毛細管電泳水相緩沖液的組成中的所述磷酸鹽選自10mm～20mm或20mm～30mm，優選20mm。
在一些實施方式中，所述毛細管電泳水相緩沖液的組成中的所述磷酸鹽是通過等摩爾量的nah2po4和na2hpo4混合得到的。
在一些實施方式中，所述毛細管電泳水相緩沖液的組成中的所述β-環糊精選自0mm～5mm或5mm～10mm，優選5mm。
在一些實施方式中，所述毛細管電泳水相緩沖液的組成中的所述十二烷基硫酸鈉選自20mm～40mm或40mm～60mm，優選40mm。
在一些實施方式中，所述毛細管電泳水相緩沖液的組成中的所述乙腈體積百分比選自2.5％～5％、5％～7.5％、7.5％～10％，優選7.5。
在一些實施方式中，所述毛細管電泳水相緩沖液的ph值選自6.5～7.0或7.0～7.5，優選7.0。
在一些實施方式中，所述電壓選自18kv～20kv或20kv～22kv，優選20kv；所述卡盒的溫度控制選自19℃～22℃或22℃～25℃，優選22℃。
在一些實施方式中，本發明在線篩選或/和測定抗氧化活性成分的毛細管電泳水相緩沖液的組成是為20mm磷酸鹽，50mm的β-環糊精，40mm的十二烷基硫酸鈉和體積百分比為7.5％的乙腈，其中所述的磷酸鹽是通過等摩爾量nah2po4和na2hpo4混合得到的；所述毛細管電泳水相緩沖液的ph值為7.0；整個實驗過程中，電壓是20kv，卡盒的溫度控制在22℃；中藥樣品的檢測波長是360nm，abts+的檢測波長是405nm；中藥樣品及abts+的進樣都是在50mbar壓力下進樣5s。
在一些實施方式中，所述中藥是舒血寧注射液。
本發明的有益效果在于：
(1)本發明建立的在線abts+-ce-dad方法可以用來從中藥注射液中篩選和定量抗氧化活性成分，并且對相應的中藥注射液進行質量控制。相關文獻庫中并沒有發現這種在線abts+-ce-dad方法分析中藥注射液，而且也是首次將abts+與ce在線結合。
(2)用本發明方法，在同一條件下可以快速測得舒血寧注射液的總抗氧化活性并且成功地確定具有抗氧化活性的成分，隨后這些活性成分的含量也可以被測定。
(3)ce在此方法中不僅是一個分離工具而且是一個可以發生反應的容器。在本發明研究過程中，對該在線abts+-ce-dad方法的方法學驗證，結果證明本次工作建立的活性整合方法可適用于分離、篩選中藥及其注射液中的抗氧化活性成分并對樣品進行質量控制。
附圖
圖1：各參數對十四個化合物峰(包括abts+)的遷移時間和分離度的作用
其中：圖1(a)為毛細管電泳水相緩沖液ph值的作用；
圖1(b)為緩沖鹽濃度的作用；
圖1(c)為十二烷基硫酸鈉(sds)濃度的作用；
圖1(d)為β-環糊精(β-cd)濃度的作用；
圖1(e)為乙腈(acn)濃度的作用；
圖1(f)為電壓的作用；
圖1(g)為溫度的作用；
其中圖中橫坐標，1為蝶豆素、2為蘆丁、3為異槲皮苷、4為槲皮素-3-o-葡萄糖基(1-2)鼠李糖苷、5為山奈酚-3-o-蕓香糖苷、6為水仙苷、7為山奈酚-7-o-β-d-葡萄糖苷、8為大波斯菊苷、9為3-o-{2-o-[6-o-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、10為槲皮素、11為3-o-{2-o-[6-o-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚、12為山奈酚、13為異鼠李素。
圖2：“abts+”與“abts+溶液在線混合舒血寧注射液”的電泳圖譜
其中：高的是“abts+”的電泳圖譜，低的是“abts+與舒血寧注射液在線混合后的”電泳圖譜。
圖3：舒血寧電泳圖譜
其中：上面是舒血寧與水在線混合的電泳圖譜，下面是舒血寧與abts+在線混合的電泳圖譜。
圖4：十三個化合物的混合標準品與舒血寧注射液的電泳圖譜
其中：上面是標準品混合物的電泳圖譜，下面是舒血寧注射液的電泳圖譜。
圖5：舒血寧注射液總的含量與總抗氧化活性的關系。
具體實施方案
下述是結合具體實施例進一步闡述本發明。但這些實施例僅限于說明本發明而不是用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件。
實施例：
1儀器和材料
1.1儀器
毛細管電泳儀：agilent7100，二極管陣列檢測器dad；未涂層石英毛細管柱：河北永年銳灃色譜器件有限公司；超純水器：millipore公司，mill-qⅱ型；高速離心機：美國sigma公司，3k15；超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司，kq-250e；萬分之一天平：德國sartorius公司，bp121s；十萬分之一天平：瑞士mettlertoledo公司，ax205；旋渦混合器：上海滬西分析儀器廠，xw-80a；超濾膜：天津市津騰實驗設備有限公司
1.2試劑
乙腈：色譜純，德國默克公司；甲醇：色譜純，德國默克公司；超純水：millipore超純水凈化系統制得；磷酸二氫鈉：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；氫氧化鈉：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉(sds)：分析純，北京索萊寶科技有限公司；β-環糊精(β-cd)：分析純，北京索萊寶科技有限公司；2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(abts)：美國sigma-aldrich公司；過硫酸鉀：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。
1.3標準品
蝶豆素，蘆丁，異槲皮苷，槲皮素-3-o-葡萄糖基(1-2)鼠李糖苷，山奈酚-3-o-蕓香糖苷，水仙苷，山奈酚-7-o-β-d-葡萄糖苷，大波斯菊苷，3-o-{2-o-[6-o-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素，3-o-{2-o-[6-o-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚均購于成都曼思特生物科技有限公司，純度大于98.0％。
1.4樣品
20批舒血寧注射液均由神威藥業提供。所有樣品經天津中醫藥大學常艷旭研究員審核確證，存放于天津中醫藥大學中醫藥研究院。
2實驗條件
2.1儀器條件
所有的實驗均在配有紫外檢測器(waldbronn，德國)的安捷倫毛細管電泳儀上實現，儀器操作和數據分析均在安捷倫化學工作站上實現。ce分離在內徑為50μm的熔融石英毛細管內進行，總長60.2cm(有效長度為52cm)(河北，銳灃)。新的毛細管應在50mbar壓力下依次用1.0mnaoh、0.1mnaoh和去離子水沖10min來活化內壁。每次運行前毛細管應在50mbar壓力下用0.1mnaoh沖2min，相應背景電解質溶液沖3min。每天最后一次分離之后，毛細管應該在50mbar壓力下用0.1mnaoh和去離子水分別沖10min。為了保證遷移時間有良好的重復性，小瓶中的背景緩沖液應該每運行兩次更換新的。
2.2實驗條件
在線篩選抗氧化活性和測定抗氧化活性的毛細管電泳水相緩沖液的組成是20mm的磷酸鹽，5mm的β-環糊精，40mm的十二烷基硫酸鈉和7.5％的乙腈；毛細管電泳水相緩沖液的ph值為7。其中，毛細管電泳水相緩沖液中磷酸鹽是通過等摩爾量的nah2po4和na2hpo4混合得到的。整個實驗過程中，電壓應用的是20kv，卡盒的溫度控制在22℃。所有的樣品進樣都是在50mbar壓力下進樣5s。檢測樣品和abts+的波長分別是360nm和405nm。
3標準品，質控樣品和樣品的制備
所有的黃酮類標準品均用甲醇溶解成2mg/ml作為儲備液，然后再用儲備液混合并稀釋成以50％甲醇為溶劑各成分濃度均為0.1mg/ml的混合標準溶液。abts和過硫酸鉀分別用去離子水溶解成濃度為9mg/ml和1.516mg/ml，然后將abts和過硫酸鉀溶液以1:2的比率混合，在室溫下避光保存20-24h以氧化充分即得abts+。得到的abts+自由基溶液在室溫避光條件下可穩定保存3-4天，用之前使用去離子水稀釋到1.5mg/ml。所有的標品在用之前都保存在4℃，除了abts+自由基溶液外的所有溶液在使用前都用0.22μm的尼龍濾器過濾。
蝶豆素，蘆丁，異槲皮苷，水仙苷，槲皮素-3-o-葡萄糖基(1-2)鼠李糖苷，山奈酚-3-o-蕓香糖苷，山奈酚-7-o-β-d-葡萄糖苷，大波斯菊苷，3-o-{2-o-[6-o-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素，3-o-{2-o-[6-o-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚的質控樣品包括低、中、高三個濃度，該質控樣品是通過稀釋特定濃度的混標至相應濃度得到的且最終的基質是50％甲醇。
4方法的建立
首先，優化毛細管電泳水相緩沖液的ph值和磷酸鹽、β-環糊精，sds和乙腈的濃度以及電壓和溫度等電泳條件來檢測分離舒血寧注射液中的成分和abts+。通過比較在線混合樣品和水與樣品溶液和abts+溶液的電泳圖譜來篩選抗氧化活性成分，具有抗氧化活性的成分峰會在第二種情況下降低。通過比較abts+分別在線混合水和稀釋后的樣品得到的電泳圖來確定總的抗氧化活性。實驗過程中，樣品和abts+均在50mbar壓力下進樣5s。
關于方法學，分別驗證了該方法的精密度、線性、24h穩定性和回收率。線性是用六個點來建立的，精密度和24h穩定性是通過測定低、中、高三個濃度的質控樣品來實現的(n＝6)。9個成分的回收率是通過加入等濃度的混標溶液于已知濃度的樣品中來實現的。上述原始樣品和加標的樣品均用已優化好的條件檢測，回收率用下面的公式來計算：回收率(％)＝(測得量-原有量)/加入量×100％。
5結果和討論
5.1ph值的作用
對于遷移時間和分離度來說，毛細管電泳水相緩沖液的ph值是至關重要的，因為ph的改變會導致電解質的遷移速率和電滲流發生改變。為了確定最優的ph值，在20mm磷酸鹽，5mmβ-cd，60mmsds和7.5％乙腈的條件下，優化了ph為6.5，7.0，7.5。正如圖1(a)中所示，總的遷移時間隨著ph從6.5升至7.5逐漸降低，而且從線的走向來看，在ph為6.5時化合物的分離度不太理想。總的遷移時間在ph7和7.5區別不大，但是對比ph7和7.5的趨勢線前幾個點可以看出，前幾個化合物在ph為7.5的分離度并不如ph為7的好。因此，選擇ph為7進行進一步的研究。
5.2緩沖鹽濃度的作用
正如我們所知，緩沖鹽是毛細管電泳水相緩沖液中不可缺少的一部分，因為在電壓的作用下它是產生電流的物質。毛細管電泳水相緩沖液中不同濃度的緩沖鹽會使樣品中的成分產生不同的遷移行為，因此，緩沖鹽的濃度需要優化。在此分別考察了ph7的磷酸鹽10mm，20mm和30mm的濃度。圖1(b)表明，隨著磷酸鹽濃度的增大，總的遷移時間也會延長。在10mm和30mm時，abts+和蘆丁不能完全分開，而20mm時分離度有所改善。因此20mm是最合適的磷酸鹽濃度。
5.3十二烷基硫酸鈉(sds)濃度的作用
在毛細管膠束電動色譜(mekc)中，sds是一種常用的添加劑，濃度超過其cmc值就可以形成膠束，因此，為了得到好的分離度非常有必要優化sds的濃度。我們研究了不同濃度的sds(20mm，40mm和60mm)對舒血寧中的多種成分分離產生的作用。通過圖1(c)，可以觀察到從20mm到60mm分析時間越來越長，并且大部分峰之間的分離度也越來越大。在20mm時，圖上各點的縱坐標沒有太大差異，也就是說各個化合物的分離度不是很理想。然而，在60mm時水仙苷和山奈酚-7-o-葡萄糖苷的分離度較40mm時有所下降。最后，40mm被作為最優的濃度進行下一步的實驗。
5.4β-環糊精(β-cd)濃度的作用
環糊精具有錐形空腔特殊結構，是一種加入到毛細管電泳水相緩沖液中可以通過改變相似分子的遷移行為從而將他們分離的物質。為了改善峰形和提高部分化合物的分離度，β-cd被加入到了毛細管電泳水相緩沖液中。固定其他條件不變，考察了0mm，5mm和10mm濃度的β-cd對舒血寧注射液中各個成分的作用。隨著β-cd濃度的增加，分析時間變短并且峰形變窄。然而，通過比較圖1(d)中的三條趨勢線可以看出，隨著β-cd濃度的增加，分離度也有所下降。考慮各種因素后，認為5mm的β-cd是分離目標化合物最好的濃度。
5.5乙腈(acn)濃度的作用
大多數的毛細管電泳水相緩沖液是水溶性的，但是相當一部分樣品中的化合物在水中的溶解性并不好。acn作為一種常用的有機添加劑，加入到毛細管電泳水相緩沖液中后可以防止分析物在電泳過程中產生沉淀。acn沒有紫外吸收，粘度也不高，因此不會對檢測的化合物產生干擾。我們選擇2.5％，5％，7.5％和10％的acn進行考察。從圖1(e)中我們可以看出，在2.5％時，樣品中的成分的分離度不太理想，另外，盡管隨著acn濃度的增加分離度有所改善，但是分析時間也延長了。并且7.5％時峰形較好，因此，7.5％被確定為最優的條件。
5.6電壓和溫度的作用
除了上述提到的因素，電壓和溫度也會對分析物的分離度和遷移時間產生影響。電壓提供了驅動力，因此，提高電壓可以減少分離時間，但是過高的電壓也會產生較多的焦耳熱。溫度主要影響毛細管電泳水相緩沖液的粘度。考察了電壓(18kv，20kv和22kv)和卡盒溫度(19℃，22℃和25℃)對化合物的分離的影響(分別見圖1(f)圖1(g))，當電壓20kv和溫度22℃時，分離度最好。
綜上所述，最終確定的對分離檢測舒血寧中各個目標化合物的最優條件是：20mm磷酸鹽(ph7.5)，40mmsds，5mmβ-cd，7.5％acn，電壓22kv，溫度22℃。
5.7方法學驗證
蝶豆素，蘆丁，異槲皮苷，槲皮素-3-o-葡萄糖基(1-2)鼠李糖苷，山奈酚-3-o-蕓香糖苷，水仙苷，山奈酚-7-o-β-d-葡萄糖苷，大波斯菊苷，3-o-{2-o-[6-o-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素，3-o-{2-o-[6-o-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚的標準曲線和線性范圍均如表1中所列。lod和loq分別是通過3倍信噪比和10倍信噪比計算得來，這些化合物的lod的范圍在0.3μg·ml-1-1.8μg·ml-1之間，loq的范圍是1μg·ml-1-6μg·ml-1。
表1.線性方程，線性范圍，lods，loqs和九個化合物的回收率(n＝6)
回收率測試結果在表1中列出，9個具有抗氧化活性化合物的平均回收率(n＝6)在96.9-104.5％之間，且rsd％值<4.49％。綜上所述，該方法用來分離和定量中藥注射液中的抗氧化活性成分是穩定，準確。
為了確定該建立的方法的可靠性，考察了精密度(包括日內和日間精密度)和準確度，結果如表2所示。所有化合物包括abts+的精密度rsd％值均在7.5％以下，準確度均在97.1-106.3％之間。結果表明，該方法可靠，準確，重復性好。
為了評價樣品中的各個成分在分析過程中的穩定性，另一個需要考察的因素是24h穩定性。結果如表2所示，可以看出所有的化合物保存在4℃下24h后的三個濃度水平的保留值分別在95.9-101.7％，97.3-100.3％和99.6-100.9％范圍內且abts+的保留值為99.6％，包括abts+在內的所有化合物的rsd值均小于6.48％。結果表明，樣品中的目標化合物在儲存和分析過程中是穩定的。
表2.日內，日間準確度和精密度，九個化合物和abts+(n＝6)的穩定性
5.8在線測定樣品的總抗氧化活性
應用此建立的在線方法，樣品的總抗氧化活性也能被測定。舒血寧注射液由于清除樣自由基的能力較強，所以樣品在與abts+在線反應之前用去離子水稀釋32倍。分別用abts+與稀釋后的樣品和等量的去離子水在線反應，測定兩種情況下abts+的峰面積(n＝3)。對比得到的電泳圖譜(如圖2所示)，可以看出abts+與稀釋了的舒血寧注射液在線反應后峰面積有所降低。相對抑制率使用以下公式計算：抑制率(％)＝(p0-p1)/p0×100％)，其中，p0是abts+與去離子水在線混合的面積，p1是abts+與稀釋后的舒血寧注射液在線混合后的面積。20批舒血寧注射液的總抗氧化活性抑制率結果如表3所示，結果顯示舒血寧注射液有抗氧化活性，且不同批次的舒血寧注射液之間稍微有些差異。因此，該建立的在線abts+-ce-dad方法可以用來測定有復雜基質的中藥注射液的總抗氧化活性。
表3.樣品中九個化合物的含量和總的抑制率(n＝3)
5.9在線篩選樣品中的抗氧化活性成分
為了篩選舒血寧注射液中的抗氧化活性成分，abts+(1.5mg/ml)和稀釋了兩倍的舒血寧注射液在50mbar壓力下相繼進樣5s(n＝3)。通過與未和abts+反應的樣品電泳圖對比，根據峰高的降低從舒血寧樣品中篩選出了九個具有抗氧化活性的成分(如圖3所示)。隨后，將樣品電泳圖與對照品的進行對比(如圖4所示)可知這九個化合物分別為蝶豆素，蘆丁，異槲皮苷，槲皮素-3-o-葡萄糖基(1-2)鼠李糖苷，山奈酚-3-o-蕓香糖苷，山奈酚-7-o-β-d-葡萄糖苷，大波斯菊苷，3-o-{2-o-[6-o-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素，3-o-{2-o-[6-o-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚。通過上述結果判斷可知，篩選出的這幾種成分是舒血寧注射液中的主要抗氧化活性成分。
5.10樣品中抗氧化活性成分的含量測定
用建立的方法分別測定20批樣品中九個抗氧化活性成分的含量，結果如表3所示。從表中可以看出，蝶豆素，蘆丁，異槲皮苷，槲皮素-3-o-葡萄糖基(1-2)鼠李糖苷，山奈酚-3-o-蕓香糖苷，水仙苷，山奈酚-7-o-β-d-葡萄糖苷，大波斯菊苷，3-o-{2-o-[6-o-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素，3-o-{2-o-[6-o-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚的含量范圍分別是0.0517-0.0669mg·ml-1，0.0586-0.0767mg·ml-1，0.0122-0.0181mg·ml-1，0.0357-0.0578mg·ml-1，0.0579-0.0925mg·ml-1，0.0070-0.0103mg·ml-1，0.0305-0.0423mg·ml-1，0.0655-0.0869mg·ml-1和0.0452-0.0831mg·ml-1。20批的樣品總的含量的平均值是0.453mg·ml-1并且rsd％為7.21％，說明20批樣品間有少許的差異。這個現象與上述不同批次樣品間的抗氧化活性有一些差異的結果相對應。
為了評價舒血寧注射液的質量，本實驗還研究了不同樣品的抗氧化活性成分總含量與抗氧化活性間的關系。如圖5所示，總的抗氧化活性與九個抗氧化活性成分總含量間有明顯的線性關系(r＝0.9456)。結果表明，舒血寧注射液的抗氧化活性主要依賴于這些活性成分的含量，因此可以通過測定這些成分的含量來評價舒血寧注射液的質量。也就是說，本次通過選擇九個抗氧化活性成分作為目標化合物來建立的在線abts+-ce-dad方法可以用來評價不同批次舒血寧注射液的質量。
6結論
眾所周知，abts+是除了dpph以外的另一個經常用來測定樣品抗氧化活性的氧自由基，但是用在線abts+-ce-dad方法來篩選抗氧化活性成分還未見報道。在本次工作中，首次將abts+與ce-dad儀器整合在一起建立篩選抗氧化活性化合物，其中選擇舒血寧注射液作為例子來驗證該建立的方法。應用該方法從舒血寧注射液中篩選出來九個抗氧化活性化合物，并成功對它們進行定量。由此可見，用該建立的在線abts+-ce-dad方法從具有復雜基質的中藥或其制劑中篩選抗氧化活性成分并進行定量時簡單、快速、準確、可靠并且環保，且可以評價不同批次的樣品間抗氧化活性能力。與傳統評價中藥制劑質量的方法相比，該在線abts+-ce-dad方法結合了樣品藥理作用來評價其質量，并且在整個實驗過程中有機試劑的消耗量都較低。總而言之，該建立的活性整合方法是一種新型的，可靠的并且強大的分析方法，不僅能篩選和定量中藥及其注射液中的抗氧化活性成分，并且能對所分析樣品進行質量控制。在未來的研究中，可考慮將該方法與質譜結合，用來確定天然產物中未知的活性化合物，或者與提高靈敏度的技術結合來檢測篩選樣品中的低含量甚至痕量化合物。
應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
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