一種測定生鮮乳樣品中的多種霉菌毒素含量的方法與流程

本發明涉及食品檢驗檢疫領域，更特別地，涉及一種測定生鮮乳樣品中的多種霉菌毒素含量的方法。

背景技術：

牛奶已成為人們生活的必需品，尤其嬰幼兒牛奶是母乳的最佳替代品，但霉菌毒素已成為牛奶的主要質量安全風險因子之一，嚴重威脅人類健康。霉菌毒素在牛奶加工過程中，無論是巴氏殺菌還是高溫殺菌均無法降解霉菌毒素，霉菌毒素可以完整殘留至奶產品中，因此，牛奶中霉菌毒素越來越受到人們的廣泛關注。

目前，監測牛奶中霉菌毒素污染狀況的方法主要為酶聯免疫吸附法，該方法廣泛應用于霉菌毒素分析檢測，但由于假陽性和不能精確定量等缺點限制了其進一步應用。因此，基于薄層色譜法、氣相色譜、高壓液相色譜等技術的定量檢測方法已經建立，但這些方法只能檢測一種或一類霉菌毒素，已不能滿足現代奶業中霉菌毒素的監測和科研需求。

因此，需要一種新的測定生鮮乳中的多種霉菌毒素的方法。

技術實現要素：

為解決以上問題，本發明提供了一種測定生鮮乳樣品中的多種霉菌毒素含量的方法，其包括以下步驟：

s1：從所述生鮮乳樣品中提取霉菌毒素提取物；

s2：對所述霉菌毒素提取物進行液相色譜分離，得到洗脫級分；

s3：使用三重四極桿質譜儀對所述洗脫級分進行質譜鑒定，確定霉菌毒素的種類和含量。

本發明采用三重四極桿質譜儀，其比單四級桿質譜儀精度更高，可更好地分離目標化合物和干擾雜質；從而提供可靠、準確的數據。本方法通過三重四極桿質譜儀的多反應監測掃描方式采集各霉菌毒素的特征母離子及其子離子信息,結合保留時間和離子豐度比進行定性和定量分析。

優選地，所述多種霉菌毒素為以下霉菌毒素中的多種：黃曲霉毒素m2、黃曲霉毒素m1、黃曲霉毒素g2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素b1、β-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素b和赭曲霉毒素a。

優選地，s1中使用體積分數為5-10％的乙腈水溶液從所述生鮮乳樣品中提取所述霉菌毒素提取物。體積分數為5-10％的乙腈水溶液可有效提取所有14種霉菌毒素，提取率超過純水和體積分數20％的乙腈水溶液。

進一步地，s1包括以下步驟：

s11：取生鮮乳樣品，4500rpm離心后進行中速濾紙過濾；

s12：將s11中過濾得到的濾液與所述乙腈水溶液混勻；

s13：使s13得到的混合溶液通過三合一多毒素抗體親和柱(黃曲霉毒素,赭曲霉毒素，玉米赤霉烯酮類毒素抗體)，并用甲醇洗脫，吹干，得到霉菌毒素殘渣；

s14：用體積分數10％的甲醇水溶液溶解所述霉菌毒素殘渣，用0.22μm的濾膜過濾，得到所述霉菌毒素提取物。

優選地，s2中液相色譜使用kinetexc18色譜柱。

優選地，所述三重四極桿質譜儀采取mrm模式定量。

優選地，還設置有不含霉菌毒素的生鮮乳作為陰性對照。

附圖說明

圖1為14種霉菌毒素的總離子流色譜圖；

圖2為使用不同的提取溶劑提取霉菌毒素得到的14種霉菌毒素的回收率統計圖。

具體實施方式

以下結合實例對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。

1.生鮮乳中霉菌毒素的提取

取100g添加有14種霉菌毒素的生鮮乳，4500rpm離心10min后，中速濾紙過濾。稱取20.0g濾液，加入20ml10％乙腈水溶液(體積比)，搖勻后通過3合一多毒素免疫親和柱。完成后，用20ml超純水清洗親和柱。擠干親和柱中水分后，使用3ml甲醇洗脫，40℃用氮氣吹干洗脫液。使用1.0ml10％甲醇水溶液(體積比)溶解殘渣，過0.22μmptfe濾膜，待液相色譜測試。所述14種霉菌毒素分別為黃曲霉毒素m2、黃曲霉毒素m1、黃曲霉毒素g2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素b1、β-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素b和赭曲霉毒素a。

以不含霉菌毒素的生鮮乳為對照。

2.液相色譜

將上述處理得到的樣品進行液相色譜測定，條件如下：

1)色譜柱：kinetexc18,100*2.1mm(i.d.),1.7μm，或相當者；

2)流動相：流動相a：水溶液(含0.01％甲酸(v/v)、0.1mm甲酸銨)；流動相b：甲醇。梯度洗脫程序見表1；流速：300μl/min；

柱溫：40℃；

進樣量：10μl。

表1液相色譜的梯度洗脫程序

3.質譜

離子源：電噴霧電離正負離子模式(esi±)；

掃描模式：多反應監測(mrm)；

霧化氣流速：3l/min；

dl溫度：300℃；

加熱模塊溫：500℃；

干燥氣流速：20l/min；

mrm參數：見表2

表214種霉菌毒素的mrm參數

*為定量離子

4.測定

根據樣液中被測化合物的含量情況，選定濃度接近的標準工作溶液進行分析。按濃度由小到大的順序依次分析混合基質標準工作溶液，得到混合基質標準工作溶液濃度與峰面積的工作曲線。混合基質標準工作溶液和樣液中待測化合物的響應值均應在儀器的檢測線性范圍內。對混合基質標準工作溶液和樣液等體積進樣測定。

5.結果計算與表述

采用外標法定量，按以下公式計算殘留量。計算結果需扣除空白值。

式中：

x—試樣中被測組分殘留量，單位為微克每千克(μg/kg)；

c—從標準工作曲線得到的被測組分溶液濃度，單位為納克每毫升(ng/ml)；

v—樣品溶液最終定容體積，單位為毫升(ml)；

m—最終樣品溶液所代表的試樣質量，單位為克(g)。

6.測定低限

生鮮乳中赭曲霉毒素b，黃曲霉毒素b2，黃曲霉毒素b1的測定低限為0.005μg/kg；赭曲霉毒素a，黃曲霉毒素g2，黃曲霉毒素g1，黃曲霉毒素m2，黃曲霉毒素m1的測定低限為0.01μg/kg；玉米赤霉酮，玉米赤霉烯酮，α-玉米赤霉烯醇，β-玉米赤霉烯醇，α-玉米赤霉醇，β-玉米赤霉醇的測定低限為0.05μg/kg。

7.回收率

回收率可指示方法的提取效率。14種霉菌毒素在生鮮乳中的添加濃度及回收率如表3所示，從表中可知，本發明的方法能夠檢測到這14種霉菌毒素，并進行定量。

表314種霉菌毒素在生鮮乳中的添加濃度及回收率

8.不同提取溶劑對回收率的影響

對生鮮乳分別使用以下溶劑提取霉菌毒素：不提取、純水、體積分數5％的乙腈水溶液、10％乙腈水溶液和20％乙腈水溶液。得到的提取物進行液相色譜和質譜檢測，圖1為14種霉菌毒素的總離子流色譜圖，得到的回收率如圖2所示，從圖中可知，使用5％和10％的乙腈水溶液對這14種霉菌毒素的提取效率都比較高。

以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。