與唐氏綜合征相關的母血標志物及應用的制作方法

本發明涉及生物醫學領域，具體涉及與唐氏綜合征相關的母血標志物及應用。

背景技術：

出生前診斷干預是降低唐氏綜合征(down’ssyndrome，ds)出生缺陷的重要手段，因此探索新的特異性無創性產前診斷指標具有非常重要的意義。唐氏綜合征額外的1條21號染色體可導致某些基因增強表達和某些正常基因過表達，造成一些重要的生化代謝不平衡，這些表達差異的特異性蛋白質可以通過胎盤屏障進入母體血液。

同位素標記相對和絕對定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，itraq)技術是由absciex公司研發的一種體外同種同位素標記的相對與絕對定量技術。itraq技術利用多種同位素試劑標記蛋白多肽n末端或賴氨酸側鏈基團，經高精度質譜儀串聯分析，可同時比較多達8種樣品之間的蛋白表達量，是近年來定量蛋白質組學常用的高通量篩選技術。itraq技術在差異蛋白質種類和數量方面以及實驗結果的可靠性和重復性方面，比傳統的蛋白質組學方法更具優勢，它不僅可以發現胞漿蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白，還可檢測出低豐度蛋白、弱堿性蛋白、分子量小于10kd或大于200kd的蛋白，能實現對任何類型蛋白質的準確鑒定，尤其適用于血清或血漿生化標志物的篩選。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是如何輔助診斷胎兒唐氏綜合征。

為解決上述技術問題，本發明首先提供了用于檢測tβ10蛋白的物質、和/或、用于檢測ero1l蛋白的物質、和/或、用于檢測nap1l1蛋白的物質、和/或、用于檢測ogdhl蛋白的物質在制備輔助診斷胎兒唐氏綜合征的產品中的應用。所述產品可為試劑盒。

用于檢測tβ10蛋白的物質、和/或、用于檢測ero1l蛋白的物質、和/或、用于檢測nap1l1蛋白的物質、和/或、用于檢測ogdhl蛋白的物質在輔助診斷胎兒唐氏綜合征中的應用也屬于本發明的保護范圍。

上述應用中，所述“用于檢測ogdhl蛋白的物質”可為檢測所述ogdhl蛋白的濃度的物質。所述“用于檢測nap1l1蛋白的物質”可為檢測所述nap1l1蛋白的濃度的物質。所述“用于檢測tβ10蛋白的物質”可為檢測所述tβ10蛋白的濃度的物質。所述“用于檢測ero1l蛋白的物質”可為檢測所述ero1l蛋白的濃度的物質。

上述應用中，所述ogdhl蛋白可為a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白質；

a2)在a1)的n端或/和c端連接標簽得到的融合蛋白質；

a3)將a1)或a2)所示的蛋白質經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質。

上述應用中，所述nap1l1蛋白可為b1)或b2)或b3)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質；

b2)在b1)的n端或/和c端連接標簽得到的融合蛋白質；

b3)將b1)或b2)所示的蛋白質經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質。

上述應用中，所述tβ10蛋白可為c1)或c2)或c3)：

c1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白質；

c2)在c1)的n端或/和c端連接標簽得到的融合蛋白質；

c3)將c1)或c2)所示的蛋白質經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質。

上述應用中，所述ero1l蛋白可為d1)或d2)或d3)：

d1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白質；

d2)在d1)的n端或/和c端連接標簽得到的融合蛋白質；

d3)將d1)或d2)所示的蛋白質經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質。

為解決上述技術問題，本發明還提供了一種輔助診斷腹胎兒唐氏綜合征的產品。

本發明所提供的輔助診斷腹胎兒唐氏綜合征的產品，包括用于檢測tβ10蛋白的物質、和/或、用于檢測ero1l蛋白的物質、和/或、用于檢測nap1l1蛋白的物質、和/或、用于檢測ogdhl蛋白的物質。所述產品可為試劑盒。

上述產品中，所述“用于檢測ogdhl蛋白的物質”可為檢測所述ogdhl蛋白的濃度的物質。所述“用于檢測nap1l1蛋白的物質”可為檢測所述nap1l1蛋白的濃度的物質。所述“用于檢測tβ10蛋白的物質”可為檢測所述tβ10蛋白的濃度的物質。所述“用于檢測ero1l蛋白的物質”可為檢測所述ero1l蛋白的濃度的物質。

上述產品中，所述產品還可包括記載有判斷標準甲的載體和/或記載有判斷標準乙的載體和/或記載有判斷標準丙的載體和/或記載有判斷標準丁的載體；

所述判斷標準丙可為：如果待測母體血漿中所述tβ10蛋白的濃度大于對照血漿中所述tβ10蛋白的濃度，則所述待測母體的胎兒為或疑似為唐氏綜合征；如果待測母體血漿中所述tβ10蛋白的濃度在對照血漿中所述tβ10蛋白的濃度以下，則所述待測母體的胎兒不為或疑似不為唐氏綜合征；

所述判斷標準丁可為：如果待測母體血漿中所述ero1l蛋白的濃度大于對照血漿中所述ero1l蛋白的濃度，則所述待測母體的胎兒為或疑似為唐氏綜合征；如果待測母體血漿中所述ero1l蛋白的濃度在對照血漿中所述ero1l蛋白的濃度以下，則所述待測母體的胎兒不為或疑似不為唐氏綜合征；

所述判斷標準乙可為：如果待測母體血漿中所述nap1l1蛋白的濃度大于對照血漿中所述nap1l1蛋白的濃度，則所述待測母體的胎兒為或疑似為唐氏綜合征；如果待測母體血漿中所述nap1l1蛋白的濃度在對照血漿中所述nap1l1蛋白的濃度以下，則所述待測母體的胎兒不為或疑似不為唐氏綜合征；

所述判斷標準甲可為：如果待測母體血漿中所述ogdhl蛋白的濃度大于對照血漿中所述ogdhl蛋白的濃度，則所述待測母體的胎兒為或疑似為唐氏綜合征；如果待測母體血漿中所述ogdhl蛋白的濃度在對照血漿中所述ogdhl蛋白的濃度以下，則所述待測母體的胎兒不為或疑似不為唐氏綜合征；

所述對照血漿可為健康胎兒母體和/或非唐氏綜合征胎兒母體的血漿。

上述產品中，所述ogdhl蛋白可為a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白質；

a2)在a1)的n端或/和c端連接標簽得到的融合蛋白質；

a3)將a1)或a2)所示的蛋白質經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質。

上述產品中，所述nap1l1蛋白可為b1)或b2)或b3)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質；

b2)在b1)的n端或/和c端連接標簽得到的融合蛋白質；

b3)將b1)或b2)所示的蛋白質經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質。

上述產品中，所述tβ10蛋白可為c1)或c2)或c3)：

c1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白質；

c2)在c1)的n端或/和c端連接標簽得到的融合蛋白質；

c3)將c1)或c2)所示的蛋白質經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質。

上述產品中，所述ero1l蛋白可為d1)或d2)或d3)：

d1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白質；

d2)在d1)的n端或/和c端連接標簽得到的融合蛋白質；

d3)將d1)或d2)所示的蛋白質經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質。

所述tβ10蛋白和/或所述ero1l蛋白和/或所述nap1l1蛋白和/或所述ogdhl蛋白作為母血標志物在開發診斷腹唐氏綜合征的試劑中的應用也屬于本發明的保護范圍。

上文中，所述ogdhl蛋白的geneid號為55753。所述nap1l1蛋白的geneid號為4673。所述tβ10蛋白geneid號為9168。所述ero1l蛋白geneid號為30001。

上文中，所述檢測ogdhl蛋白的濃度具體可為檢測母體外周血的血漿中的ogdhl蛋白的濃度。所述檢測nap1l1蛋白的濃度具體可為檢測母體外周血的血漿中的nap1l1蛋白的濃度。所述檢測tβ10蛋白的濃度具體可為檢測母體外周血的血漿中的tβ10蛋白的濃度。所述檢測ero1l蛋白的濃度具體可為檢測母體外周血的血漿中的ero1l蛋白的濃度。

實驗證明，本發明的發明人通過從胎兒蛋白整體水平篩選的唐氏綜合征母血標志物，即tβ10蛋白和/或ero1l蛋白和/或nap1l1蛋白和/或ogdhl蛋白，可用于無創性產前篩查診斷唐氏綜合征，以解決目前唐篩使用的非特異性母血標志物篩查效率低的狀況，具有重要的應用價值。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。

下述實施例中的各個實驗均是在患者的知情同意的前提下進行的，且均簽署知情同意書，并經深圳市人民醫院倫理委員會批準后進行實驗。

實施例1、ds胎兒的候選特異性標記蛋白的獲得

以確診為唐氏綜合征的胎兒(以下簡稱ds胎兒)6例作為ds組，同時以健康胎兒6例作為對照組。先運用itraq技術和串聯質譜分析對ds胎兒和健康胎兒臍帶血的血漿全基因組蛋白進行鑒定、比較和相對定量分析，得到胎兒“全蛋白質組信息”；然后運用在線工具wego(webgeneontologyannotationplot，網址為http://wego.genomics.org.cn)分析，將所有的蛋白質劃分為分子功能、生物過程和細胞組成；最后對所有蛋白進行go富集分析，通過比較ds胎兒和健康胎兒臍帶血血漿中蛋白表達的差異，結合蛋白的臨床意義，得到ds胎兒的候選特異性標記蛋白。具體步驟如下：

1、分別取6例ds胎兒(發育至18-22周)的臍帶血2ml，置于肝素抗凝管中，然后2000×g離心15min，收集血漿。

2、完成步驟1后，分別提取血漿中的總蛋白并檢測總蛋白的濃度。

3、完成步驟2后，取各個樣本的血漿(均含100μg總蛋白)，混合；然后使用proteominer蛋白富集試劑盒(bio-rad公司的產品)去除高豐度蛋白；最后加入適量胰蛋白酶消化，得到消化液。

4、完成步驟3后，取消化液，使用itraq試劑盒(abi公司的產品)進行itraq116同位素標記，得到標記樣本甲。

5、按照上述步驟1-4，將“ds胎兒(發育至18-22周)”替換為“健康胎兒(發育至18-22周)”，將“itraq116同位素標記”替換為“itraq114同位素標記”，其它步驟均不變，得到標記樣本乙。

6、完成步驟4和5后，將標記樣本甲和標記樣本乙混合，先進行多維液相色譜分離，然后maldi-tof/tof質譜鑒定，計算蛋白質相對定量按平均報告離子比值(itraq116/itraq114)。

7、完成步驟6后，通過在線工具wego的數據庫查詢，建立唐氏綜合征蛋白組數據庫；通過scaffold定量分析，獲得唐氏綜合征疾病差異的蛋白組圖譜。

以多肽大于1和95％可信區間作為閾值，有506種蛋白質表達上調或者下調，排除高豐度蛋白，平均報告離子比值(itraq116/itraq114)差異在1.5倍以上顯著差異的蛋白質有18種(表1)。其中11種蛋白質與健康胎兒比較表達上調，7種蛋白質與健康胎兒比較表達下調。這18種蛋白質即為ds胎兒的候選特異性標記蛋白。

表1

實施例2、ds胎兒的候選特異性標記蛋白在母體外周血中的westernblot驗證

兔抗人ogdhl抗體、兔抗人nap1l1抗體、兔抗人tβ10抗體和兔抗人ero1l抗體均為abcam公司的產品，產品目錄號分別為ab100928、ab178687、ab14338和ab81959。

以8例孕ds胎兒的孕婦作為ds組，同時以8例孕健康胎兒的孕婦作為對照組。

1、分別取8例孕ds胎兒的孕婦外周血5ml和8例孕健康胎兒的孕婦外周血5ml，置于肝素抗凝管中，然后2000×g離心15min，收集血漿。

2、完成步驟1后，分別提取血漿中的總蛋白。

3、將步驟1得到的總蛋白分別進行westernblot，采用兔抗人ogdhl抗體作為一抗檢測ogdhl，采用兔抗人nap1l1抗體作為一抗檢測nap1l1，采用兔抗人tβ10抗體作為一抗檢測tβ10，采用兔抗人ero1l抗體作為一抗檢測ero1l。采用圖像分析軟件image-proplus對各個蛋白的條帶進行光密度測定，比較ds組與對照組的iod(integrateopticaldensity)值。

8例孕ds胎兒的孕婦外周血的westernblot驗證結果見圖1。

8例孕健康胎兒的孕婦外周血的westernblot驗證結果見圖2。

結果表明，ogdhl、nap1l1、tβ10和ero1l在孕ds胎兒的孕婦外周血中的表達量均顯著高于孕健康胎兒的孕婦外周血，即ogdhl、nap1l1、tβ10和ero1l在孕ds胎兒的孕婦外周血中的表達量分別為孕健康胎兒的孕婦外周血中的表達量的1.527倍、2.188倍、14.776倍和11.100倍。這一實驗結果與ogdhl、nap1l1、tβ10和ero1l在ds胎兒臍帶血中的表達量顯著高于健康胎兒臍帶血中的表達量完全一致。

結果表明，母體外周血中ogdhl、nap1l1、tβ10和ero1l的濃度均與胎兒唐氏綜合征與否有密切聯系，可輔助診斷胎兒是否患有唐氏綜合征。因此，ogdhl、nap1l1、tβ10和ero1l均為與唐氏綜合征相關的母血標志物。

<110>深圳市人民醫院

<120>與唐氏綜合征相關的母血標志物及應用

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