一種石蠟病理切片組織的水凝膠支撐和脂質清除處理方法與流程

本發明涉及提高石蠟病理組織切片的檢測特異性敏感性并大幅降低抗體使用量的方法，是一種石蠟病理切片組織水凝膠支撐脂質清除的處理方法。
背景技術：
：石蠟病理組織切片是將病變的組織或臟器經過各種化學品和包埋法的處理，使之支撐硬化，在切片機上切成薄片，粘附在玻片上，加以各種染色檢測手段，供在顯微鏡下檢查，以觀察病理變化，作出病理診斷，為臨床診斷和治療提供幫助。其中，染色手段不同，可分為細胞化學染色、免疫組織化學染色和免疫熒光染色以及熒光原位雜交（fish）等。然而在石蠟病理組織切片中，組織細胞中脂質分子具有阻礙光線和大分子滲透的作用，這導致傳統方法制作的病理切片在免疫組織染色及免疫熒光染色時需耗費更多的抗體且同時信噪比較差。如果能無損傷保留細胞蛋白質及各種遺傳物質同時有效去除雙層脂質分子，從而使光線和大分子能更好滲透到組織深層，實現提高染色效果并減少抗體的使用量，提高組織石蠟病理組織切片染色的敏感性、特異性。因此如何能在去除脂質的同時保持組織結構完整性和避免生物分子信息丟失成為技術難點。clarity技術的原理是采用一種透明水凝膠替代組織中的脂類，構建起一個組織細胞骨架，支撐細胞組分中的蛋白質、神經遞質、dna、rna等物質，從而達到減少脂質分子阻礙光線和大分子滲透的目的。該技術最初的報道是運用在動物器官組織，主要是通過心臟灌流輸入動物體內，在多聚甲醛充分支撐蛋白質、核酸之后，將組織樣品升溫至37℃，誘發丙烯酰胺、甲叉-丙烯酰胺聚合，在組織內部形成水凝膠，完整保留蛋白質和核酸的定位信息，再進一步應用陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（sds）溶液清除樣品中主要的散光物質磷脂，最后通過折射率匹配，讓樣品和樣品間隙的折射率一致，從而使樣品的光學通透性大大增強。然而在石蠟病理切片組織中運用clarity技術原理進行水凝膠支撐脂質清除處理，國內外尚未見文獻報道。技術實現要素：本發明提供一種石蠟病理切片組織的水凝膠支撐和脂質清除處理方法，將clarity技術原理與傳統石蠟切片檢測方法相結合，通過支撐組織中蛋白質及各種遺傳物質并清除組織中的脂質成分，提高病理切片檢測的特異性和敏感性，并大幅降低抗體使用量。為實現上述目的，本發明的技術方案為：一種石蠟病理切片組織的水凝膠支撐和脂質清除處理方法，包括以下步驟：s1.將石蠟病理組織切片進行脫蠟，得切片；s2.將切片進行抗原修復；s3.將步驟s2所得的切片完全浸沒于水凝膠中，在0~4℃下浸泡20~40h；s4.將步驟s3處理后的切片放入第一容器中，交替充入惰性氣體/氮氣/二氧化碳和抽真空，然后在第一容器充滿氮氣的情況下，于35~40℃保溫2.5~6h，直至水凝膠凝固；s5.將步驟s4處理后的切片放入盛有清除液的第二容器中，置于搖床上，35~40℃下去除切片組織中的脂質22~30h，最后將切片取出，完成透明化處理過程。優選的，所述步驟s1包括以下子步驟：s1-1.將石蠟病理組織切片置于恒溫箱中，于55~65℃保溫30~60min；s1-2.將石蠟病理組織切片置于二甲苯中脫蠟8~15min，反復進行3次；s1-3.用不同濃度乙醇梯度水化，無水乙醇、無水乙醇、80%乙醇、70%乙醇及60%乙醇各1~5min，得切片。優選的，所述步驟s3中，水凝膠的制備方法為：質量濃度40%丙烯酰胺、質量濃度2%甲叉雙丙烯酰胺、0.1mpbs、ddh2o按體積比18~22:4~6:18~22:145~165混合，且每100ml的混合液體中還加有0.15~0.3g的va-044。更優選的，所述步驟s3中，水凝膠的制備方法為：質量濃度40%丙烯酰胺、質量濃度2%甲叉雙丙烯酰胺、0.1mpbs、ddh2o按體積比10:2.5:10:77.5混合，且每100ml的混合液體中還加有0.25g的va-044。優選的，所述步驟s4中，第一容器包括容器本體和y型氣管，所述y型氣管下端口與容器本體相連，兩個上端口分別設置有閥門，其中一個上端口與氮氣源相連，另一個上端口與真空泵相連。優選的，所述步驟s4中，交替充入惰性氣體/氮氣和抽真空的過程為：先充入惰性氣體/氮氣/二氧化碳1.5~3min，抽真空15~20min。優選的，所述步驟s5中，清除液的制備方法為：硼酸、sds和ddh2o按照重量比12~13:39~42:1000混合，并用10m的naoh溶液調節ph至8.2~8.8。優選的，所述步驟s3中，在容器充滿氮氣的情況下，于37℃保溫2.5~6h；所述步驟s4中，搖床的溫度為37℃。優選的，還包括s6.將切片通過免疫組織化學法染色或免疫熒光法染色。優選的，清除液的制備方法為硼酸、sds和ddh2o按照重量比0.62:2:50混合，并用10m的naoh溶液調節ph至8.5。以上所述的石蠟病理切片組織的水凝膠支撐和脂質清除處理方法，先對病理切片進行脫蠟，以脫除蠟質層的干擾，再對切片進行抗原修復，使被封閉的抗原重新暴露或修正過來，然后將切片浸泡在水凝膠中，并使水凝膠成型，從而用水凝膠替代了病理組織中的脂質成分，構建起一個組織細胞骨架，最后通過清除液除去細胞脂質，讓器官組織變得透明且更利于大分子滲透，從而降低抗體用量并提升成像效果。經過以上處理，有效清除了組織中的脂質成分，進而達到降低染色背景、提高靶標信號的目的，還具有減少抗體使用量、操作難度低、對設備要求低、操作容易等優勢，本發明能很好的與目前普遍應用的病理檢測手段相結合，可以增加病理切片檢測的特異性和敏感性，提高臨床病理診斷準確率，降低抗體使用量及大幅節省檢測費用。附圖說明圖1為本發明的流程示意圖。圖2為本發明中第一容器的結構示意圖。圖3a為dapi熒光染色未透明化組織切片組顯微鏡下的結果。圖3b為dapi熒光染色透明化組織切片組顯微鏡下的結果。圖中，容器本體1，第一閥門2，y型氣管3，第二閥門4。具體實施方式以下結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明的保護范圍不限于以下實施例。切片分組：選擇人正常肝臟組織石蠟病理組織切片8張，其中透明化處理組和非透明化組各四張，所述的透明化處理組即將石蠟病理切片組織進行過水凝膠固定和脂質清除處理，所述的非透明化組即為石蠟病理組織切片。石蠟病理切片組織的水凝膠固定和脂質清除處理方法包括以下步驟：s1.將石蠟病理組織切片進行脫蠟，得切片：s1-1.將石蠟病理組織切片置于恒溫箱中，于60℃下保溫烘烤30min；s1-2.將石蠟病理組織切片置于二甲苯中脫蠟10min，反復進行3次；s1-3.用不同濃度乙醇梯度水化，無水乙醇、無水乙醇、80%乙醇、70%乙醇及60%乙醇各5min，得切片。s2.將切片進行抗原修復：s2-1.將石蠟病理組織切片浸泡在盛有0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液的高壓鍋中，高壓加熱枸櫞酸鈉緩沖溶液，壓力閥開始冒氣后等待5min，停止加熱，等緩沖液冷卻后，將切片取出；s2-2.把切片用pbs漂洗5min，其中pbs指磷酸鹽緩沖液，主要包含磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉以及氯化鉀，ph=7.4。s3.將步驟s2所得的切片置于盛有水凝膠的切片盒中，完全浸沒，放入4℃冰箱，浸泡24h；其中，水凝膠100ml的配置組成見表1：表1成分40%丙烯酰胺2%甲叉雙丙烯酰胺va-0440.1mpbsddh2o用量10ml2.5ml0.25g10ml77.5ml丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺為主要成型劑；pbs指磷酸鹽緩沖液；va-044引發劑是指化學名稱為偶氮二異丁咪唑啉鹽酸鹽，縮寫為aibi，別名va-044，是一種水溶性偶氮引發劑。其作用為誘導丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺交聯聚合，形成三維網狀結構，其化學結構如式(i)所示：式(i)浸泡完后將切片取出，小心去除組織周圍多余水凝膠。s4.將步驟s3處理后的切片放入第一容器中，交替充入惰性氣體/氮氣/二氧化碳和抽真空；如圖2所示，第一容器包括容器本體1和y型氣管3，y型氣管3下端口與容器本體1相連，兩個上端口分別設置有第一閥門2和第二閥門4，其中一個上端口通過第一閥門2與氮氣源相連，另一個上端口通過第二閥門4與真空泵相連。交替充入氮氣和抽真空的過程為：打開第一閥門2，關閉第二閥門4，充入氮氣2min；關閉第一閥門2，打開第二閥門4，抽真空20min。其中，氮氣可以用惰性氣體或二氧化碳代替。然后打開第一閥門2，關閉第二閥門4，充入氮氣，在第一容器充滿氮氣的情況下，于37℃保溫3h，直至水凝膠凝固；開啟第一容器，取出切片，小心去除組織外周的水凝膠；s5.準備清除液：清除液50ml的配置組成見表2：表2然后再用10mnaoh調節ph至8.5，即得清除液。將步驟s4處理后的切片正面向上，放入盛有清除液的離心管中，置于37℃搖床上，去除切片組織中的脂質24h，最后將切片取出，完成透明化處理過程。s6.將切片通過免疫組織化學法染色或免疫熒光法染色。將dapi抗體稀釋為濃度400ug/ml的工作液。按表3中所示不同一抗的稀釋濃度將樣本分成四組表3在樣本中滴加配置好的dapi稀釋液，室溫避光孵育10min，采用pbs洗3min兩次，然后熒光顯微鏡觀察，拍照，拍照分為手動曝光組和自動曝光組：a.手動曝光組：設置參數iso100，曝光時間0.5秒，記錄各組染色后手動曝光結果，并以陽性和陰性標記。b.自動曝光組：設置參數iso100，曝光時間自動，記錄各組染色后自動曝光結果及曝光所需時間，并以陽性和陰性標記。結果見表4：表4注：表格中“+”表示陽性結果，“-”表示陰性結果該結果顯示，在手動曝光條件下抗體稀釋5倍后透明化組仍可以得到陽性結果而非透明化組檢測不到。而在自動曝光條件下，抗體稀釋125倍后仍可以檢測到陽性結果，但非透明化組在稀釋25倍時已無法檢出，且所有抗體濃度下透明化組自動曝光所需時間均小于非透明化組。結合圖3所示，圖3a為dapi熒光染色未透明化組織切片組顯微鏡下的結果，圖3b為dapi熒光染色透明化組織切片組顯微鏡下的結果，圖3a和圖3b中的組織切片均按dapi工作液（400ug/ml）的初始濃度，25倍稀釋作染，圖片采集是使用奧林巴斯熒光倒置顯微鏡進行采集（400x顯微放大，自動曝光）。由對比結果可見，透明化組的dapi染色效果提升明顯，信號與背景清晰可分，信噪比良好。在檢測組織切片中細胞組織的多肽及蛋白質等大分子物質的定性和定位觀察試驗中，由于透明化組的切片進行了脂質清除處理，使抗體更容易穿透組織及細胞膜并與組織切片中的抗原結合，從而達到降低抗體使用量的目的，根據使用抗體的不同，透明化組的切片的抗體用量僅為未透明化組的切片抗體用量的1/25~1/250。綜上所述，本實施例能無損傷的支撐組織中蛋白質等遺傳物質并有效清除了組織中的脂質成分，進而達到降低染色背景、提高靶標信號的目的，還具有減少抗體使用量、操作難度低、對設備要求低、操作容易等優勢，本發明能很好的與目前普遍應用的病理檢測手段相結合，可以增加病理切片檢測的特異性敏感性，提高臨床病理診斷準確率，大幅節省檢測費用。當前第1頁12