本發明涉及藥材檢測領域，且特別涉及一種龍膽瀉肝散中地黃的薄層色譜預處理方法及檢測方法。
背景技術：
龍膽瀉肝散是清代醫學家汪昂所創制的名方，載于其所著的《醫方集解》一書中，現收錄于《中華人民共和國獸藥典》2015年版二部。本藥由龍膽、地黃、車前子、當歸、黃芩等10味藥材組成，是“龍膽瀉肝湯”、“龍膽瀉肝丸”和“柴胡味瀉肝湯”三方加減化裁而得。龍膽瀉肝散的處方包括：龍膽45g、車前子30g、柴胡30g、當歸30g、梔子30g、生地黃45g、甘草15g、黃芩25g、澤瀉45g和木通20g。龍膽瀉肝散具有瀉肝膽實火、清三焦濕熱的功效，在獸藥臨床上主要用于目赤腫痛，淋濁，帶下。
2015年版《中華人民共和國獸藥典》二部中龍膽瀉肝散的質量標準僅有顯微鑒別和當歸與黃芩的薄層鑒別，很難控制其質量以保證產品的安全性、有效性與質量可控性。但現有技術中龍膽瀉肝散用地黃的薄層色譜測定的效果不理想，不能滿足需求。
技術實現要素：
本發明的第一目的在于提供一種龍膽瀉肝散中地黃的薄層色譜預處理方法，該預處理方法能夠使龍膽瀉肝散中的地黃得以較好的分離，使薄層色譜檢測結果更加明顯和準確。
本發明的另一目的在于提供一種龍膽瀉肝散中地黃的薄層色譜檢測方法，該測定方法對地黃具有優異的展開性能，硅膠薄層板上斑點的分離度較佳，檢測過程中干擾因素少，檢測結果準確。
本發明解決其技術問題是采用以下技術方案來實現的：
本發明提出一種龍膽瀉肝散中地黃的薄層色譜預處理方法，其包括以下步驟：以含有地黃的龍膽瀉肝散作為第一樣品，將第一樣品按料液比1g：10-20ml溶解于醇溶液中，過濾，濾液蒸干后加水溶解，然后用乙酸乙酯提取，收集提取液。
本發明還提出一種龍膽瀉肝散中地黃的薄層色譜檢測方法，其包括以下步驟：
以含有地黃的龍膽瀉肝散和地黃標準品分別作為第一樣品和第二樣品，取等量第一樣品和第二樣品分別作為試驗組和對照組，并進行以下處理：
按上述龍膽瀉肝散中地黃的薄層色譜預處理方法對第一樣品進行預處理，并以第二樣品代替第一樣品進行相同的預處理，取等量第一樣品的提取液和第二樣品的提取液點樣于同一硅膠薄層板，然后用展開劑展開，干燥，噴施顯色劑并加熱至硅膠薄層板上顯現斑點。
展開劑為三氯甲烷、甲醇和氨水以體積比為13-15：0.8-1.2：0.05-0.15混合后的混合溶劑。
對比試驗組和對照組的顯色斑點在硅膠薄層板上的位置。
本發明實施例的龍膽瀉肝散中地黃的薄層色譜預處理方法及檢測方法的有益效果是：預處理過程中將濾液蒸干后加入溶解，并用乙酸乙酯提取，能夠大大提高后續檢測過程中色斑的分離程度，便于觀察和記錄結果。該預處理方法能有效避免龍膽瀉肝散中其它物質對地黃檢測的影響，且經過該方式處理后能使檢測效果更加明顯，便于觀察。
以體積比為13-15：0.8-1.2：0.05-0.15的三氯甲烷、甲醇和氨水的混合溶劑作為展開劑，能針對性地對地黃所含成分進行充分展開，且能避免龍膽瀉肝散中的其它組成成分對地黃成分的展開產生影響。此檢測方法展開效果較佳，色斑分離度良好，檢測過程中干擾因素少，檢測結果準確。
具體實施方式
為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。
下面對本發明實施例的龍膽瀉肝散中地黃的薄層色譜預處理方法及檢測方法進行具體說明。
本發明實施例提供的龍膽瀉肝散中地黃的薄層色譜檢測方法，主要包含樣品預處理、展開和顯色等步驟。
薄層色譜檢測方法是色譜法中的一種，其原理為：利用混合物中各組分在某一物質中的吸附或溶解性能的不同，或和其它親和作用性能的差異，使混合物的溶液流經該種物質，進行反復的吸附或分配等作用，從而將各組份分開。
該檢測方法是一種微量、快速和簡便的色譜方法。由于各種化合物的極性不同，吸附能力不相同，在展開劑上移動，進行不同程度的解析，根據原點至主斑點中心及展開劑前沿的距離，計算比移值(rf)。
化合物的吸附能力與它們的極性成正比，具有較大極性的化合物吸附較強，因此rf值較小。在給定的條件下(吸附劑、展開劑、板層厚度等)，化合物移動的距離和展開劑移動的距離之比是一定的，即rf值是化合物的物理常數，其大小只與化合物本身的結構有關，因此可以根據rf值鑒別化合物。
此外，薄層色譜可適用小量樣品(幾到幾十微克甚至0.01μg)的分離，也可用于多達500mg樣品的分離，是近代有機化學中用于定性，定量的一種重要手段。特別適用于那些揮發性小的化合物，以及在高溫下易發生化學變化而不能用氣相色譜分析的物質。
具體地，本實施例中龍膽瀉肝散中地黃的薄層色譜預處理方法包括以下步驟：將含有地黃的龍膽瀉肝散作為第一樣品(試驗組)，然后將第一樣品溶解于醇溶液中，過濾，取濾液，以除去第一樣品中的非醇溶性物質。
作為可選地，上述第一樣品例如可按料液比1g：10-20ml溶解于醇溶液中，優選的料液比為1g：12.5ml。此優選料液比可使第一樣品中的醇溶性物質得以充分溶解，以利于檢測結果準確。因甲醇溶液價格低廉且較易夠買，故上述醇溶液優選為甲醇溶液。
進一步地，為了在減少醇用量的同時，能夠提高龍膽瀉肝散的溶解度，本實施例中在將第一樣品溶解于醇溶液中后，還將其置于超聲條件下處理，超聲時間例如可以為25-35min，優選為30min。超聲處理的功率例如可以為90-110w，頻率例如可以為35-45khz。進一步地，超聲的功率和頻率分別優選為100w和40khz，在此條件下進行超聲處理，可進一步促進第一樣品中的醇溶性物質充分溶解于醇溶液中。
將超聲后的溶液進行過濾，然后將濾液蒸干得到干物質，加水溶解上述干物質，然后再加入乙酸乙酯進行提取，收集提取液。作為可選地，加入的水的體積與干物質重量的比例可以為1g：4.5-5.5ml，水與乙酸乙酯的體積比可以為1：1-2。為了提高乙酸乙酯溶液中地黃有效成分的量，可對水溶解后的干物質進行不少于2次的提取，并合并多次提取后的乙酸乙酯提取液。在本方案中，將濾液蒸干后加水溶解并進行乙酸乙酯提取，能夠大大提高后續檢測過程中色斑的分離程度，便于觀察和記錄結果。
因后續點樣所用的提取液較少，本實施例中還可將提取液蒸干，然后再用少量甲醇溶劑，例如2ml進行溶解，得到濃度較高、體積較少的樣品溶液。經過蒸干濃縮再溶解后的樣品溶液更利于點樣和展開，以避免點樣時樣品濃度較低或較濃影響展開效果，造成拖尾或斑點分離度差的現象。
將上述提取液點樣于硅膠薄層板。硅膠為極性吸附劑，具有較大的吸附量，本實施例選擇硅膠薄層板，能針對性地分離酸性和中性物質。上述硅膠薄層板可以自行購買，也可自制。若硅膠薄層板購自市面，使用前則可以將其于110℃的條件下活化25-35min。若為自制，則盡量使硅膠薄層板表面均勻、平整、光滑、無麻點、無氣泡、無破損及污染。
較佳地，本實施例中的硅膠薄層板為硅膠g薄層板。其原因在于一般的硅膠薄層板因硅膠薄層的機械性較差，故使用時在硅膠中加入5-20％的石膏，也即上述硅膠g薄層板。石膏起粘合作用，具有較好的耐腐性特點，將其加入硅膠薄層中，能提升硅膠薄層的機械性能。
點樣可用毛細管或點樣器械將濾液點樣于上述硅膠薄層板上。點樣的好壞直接影響分離效果，本實施例中優選點樣成圓點狀或條帶狀，當點樣為圓點狀時，圓點狀的直徑優選為不大于4mm，最佳為不大于2mm，以提高后期的展開效果，避免拖尾現象。
然后，用展開劑展開。展開劑的選擇主要根據樣品的極性、溶解度和吸附劑的活性等因素綜合考慮。目前地黃的薄層鑒別所采用的展開劑組合種類多樣，但由于不同藥物中各組成成分不同，各成分在展開過程中會相互影響，因此，適用于其他藥物的地黃薄層鑒別用的展開劑的組合方式和組成比例并不能夠完全適合于龍膽瀉肝散中地黃的鑒別。
由于地黃含有較多的氨基酸、地黃素、醇類物質和有機酸。鑒于此，綜合考慮地黃成分與龍膽瀉肝散中所含的其它物質的性質，本實施例中的展開劑優選為三氯甲烷、甲醇和氨水混合后的混合溶劑。
作為可選地，上述三氯甲烷、甲醇和氨水例如可以以體積比13-15：0.8-1.2：0.05-0.15混合。優選地，三氯甲烷、甲醇和氨水以體積比14：1：0.1混合。
按上述優選體積比混合所得的展開劑能針對性的對地黃所含成分進行展開，且龍膽瀉肝散中的其它組成成分對地黃成分的展開基本無影響，展開效果較佳。
將展開劑盛放于展開容器(如展開缸或展開槽)中，將點樣后的薄層板再放入盛有展開劑的展開容器內，較佳地，薄層板浸入展開劑的深度為距原點5mm。
作為可選地，本實施例中的展開時間例如可以控制在18-22min，優選地，展開時間為20min。展開時間控制在此范圍，可避免時間過短造成斑點分離不明顯。
展開后，干燥薄層板。因需鑒別的地黃成分為無色物質，需要借助顯色劑并在加熱條件下才能顯色。因此對干燥后的薄層板噴施顯色劑并加熱至硅膠薄層板上顯現斑點。就本方案中的地黃成分，顯色劑選用香草醛硫酸溶液，較佳地，該香草醛硫酸溶液中香草醛的體積濃度可以為4.5-5.5％。作為可選地，加熱可以在不超過105℃的溫度下進行，以避免加熱溫度過高，使鑒定成分發生化學變化，生成其它物質。
根據樣品中化合物組分的極性，不同化合物在薄層板上移動的距離不同，極性強的化合物會“粘”在極性的硅膠上，在薄層板上移動的距離比較短；而非極性的物質將會在流動的溶劑相中保留較長的時間，從而在板上移動較大的距離。化合物在薄層板上的移動距離大小用rf值來表達，由此，可以根據rf值來確定化合物的類型等。
此外，本實施例中以地黃標準品作為第二樣品。
取與第一樣品等量的第二樣品(對照組)，按照上述第一樣品的處理步驟和方法，對第二樣品進行相同的處理。值得說明的是，本實施例中第一樣品和第二樣品在獲得提取液后，是取等量第一樣品的提取液和第二樣品的提取液點樣于同一硅膠薄層板，然后展開、干燥和顯色。
對比經相同處理后的試驗組和對照組在硅膠薄層板上相對應的位置是否有相同顏色的斑點。有則說明試驗組和對照組所含化合物成分一致，無則說明試驗組和對照組所含化合物成分不一致。
為了提高本檢測方法的準確性，實施例中還設置了陰性比對組，該陰性比對組為不含地黃的龍膽瀉肝散。取與第一樣品及第二樣品等量的陰性比對組，并按照上述第一樣品、第二樣品的處理步驟和方法進行相同處理。
以下結合實施例對本發明的特征和性能作進一步的詳細描述。
實施例1
以含有地黃的龍膽瀉肝散為第一樣品(試驗組)并對其進行以下處理：取1g第一樣品溶于10ml的甲醇溶液中，過濾，蒸干濾液得到干物質，加水溶解干物質，然后用乙酸乙酯提取，收集提取液。干物質、水和乙酸乙酯的量為1g：4.5ml：4.5ml。將提取液點樣于硅膠g薄層板，點樣成直徑為4mm的圓點狀，然后用體積比為13：0.8：0.05的三氯甲烷、甲醇和氨水的混合溶劑作為展開劑，對點樣后的硅膠g薄層板展開18min。展開后，干燥薄層板，并噴施香草醛的體積濃度為4.5％的香草醛硫酸溶液，然后于105℃的溫度下加熱至硅膠g薄層板上顯現斑點。
以地黃標準品作為對照組，并按照上述步驟和方法進行相同處理。對比經相同處理后的試驗組和對照組的薄層色譜相對應的位置是否有相同顏色的斑點。
實施例2
以含有地黃的龍膽瀉肝散為第一樣品(試驗組)并對其進行以下處理：取2g第一樣品溶于40ml的甲醇溶液中，于功率為90w、頻率為35khz的超聲條件下超聲25min，然后過濾。蒸干濾液得到干物質，加水溶解干物質，然后用乙酸乙酯提取，收集提取液。干物質、水和乙酸乙酯的量為1g：5.5ml：11ml。將提取液點樣于硅膠g薄層板，點樣成直徑為1.5mm的圓點狀，然后用體積比為15：1.2：0.15的三氯甲烷、甲醇和氨水的混合溶劑作為展開劑，對點樣后的硅膠g薄層板展開22min。展開后，干燥薄層板，并噴施香草醛的體積濃度為5.5％的香草醛硫酸溶液，然后于100℃的溫度下加熱至硅膠g薄層板上顯現斑點。
分別以地黃標準品和不含地黃的龍膽瀉肝散作為對照組和陰性比對組，按上述試驗組的處理步驟和方法對對照組和陰性比對組均進行相同處理。對比經相同處理后的試驗組、對照組和陰性比對組的薄層色譜相對應的位置是否有相同顏色的斑點。
實施例3
以含有地黃的龍膽瀉肝散為第一樣品(試驗組)并對其進行以下處理：取2g第一樣品溶于30ml的甲醇溶液中，于功率為110w、頻率為45khz的超聲條件下超聲35min，然后過濾。蒸干濾液得到干物質，加水溶解干物質，然后用乙酸乙酯提取經水溶解后的干物質2次，合并2次提取所得的提取液。干物質、水和乙酸乙酯的量為1g：5ml：7.5ml。將提取液點樣于硅膠g薄層板，點樣成直徑為3mm的圓點狀，然后用體積比14：1：0.1的三氯甲烷、甲醇和氨水的混合溶劑作為展開劑，對點樣后的硅膠g薄層板展開20min。展開后，干燥薄層板，并噴施香草醛的體積濃度為5％的香草醛硫酸溶液，然后于102.5℃的溫度下加熱至硅膠g薄層板上顯現斑點。
分別以地黃標準品和不含地黃的龍膽瀉肝散作為對照組和陰性比對組，按上述試驗組的處理步驟和方法對對照組和陰性比對組均進行相同處理。對比經相同處理后的試驗組、對照組和陰性比對組的薄層色譜相對應的位置是否有相同顏色的斑點。
實施例4
以含有地黃的龍膽瀉肝散為第一樣品(試驗組)并對其進行以下處理：取2g第一樣品溶于25ml的甲醇溶液中，于功率為100w、頻率為40khz的超聲條件下超聲30min，然后過濾。蒸干濾液得到干物質，加水溶解干物質，然后用乙酸乙酯提取經水溶解后的干物質3次，合并3次提取所得的提取液。干物質、水和乙酸乙酯的量為1g：5ml：7.5ml。將提取液蒸干，再用2ml甲醇溶解，得到樣品溶液。將樣品溶液點樣于硅膠g薄層板，點樣成條帶狀，然后用體積比14：1：0.1的三氯甲烷、甲醇和氨水的混合溶劑作為展開劑，對點樣后的硅膠g薄層板展開20min。展開后，干燥薄層板，并噴施香草醛的體積濃度為5％的香草醛硫酸溶液，然后于98℃的溫度下加熱至硅膠g薄層板上顯現斑點。
分別以地黃標準品和不含地黃的龍膽瀉肝散作為對照組和陰性比對組，按上述試驗組的處理步驟和方法對對照組和陰性比對組均進行相同處理。對比經相同處理后的試驗組、對照組和陰性比對組的薄層色譜相對應的位置是否有相同顏色的斑點。
實施例5
以含有地黃的龍膽瀉肝散為第一樣品(試驗組)并對其進行以下處理：取2g第一樣品溶于25ml的甲醇溶液中，于功率為100w、頻率為40khz的超聲條件下超聲30min，然后過濾。蒸干濾液得到干物質，加水溶解干物質，然后用乙酸乙酯提取經水溶解后的干物質2次，合并2次提取所得的提取液。干物質、水和乙酸乙酯的量為1g：5ml：7.5ml。將提取液蒸干，再用2ml甲醇溶解，得到樣品溶液。將樣品溶液點樣于硅膠g薄層板，點樣成直徑為2mm的圓點狀，然后用體積比14：1：0.1的三氯甲烷、甲醇和氨水的混合溶劑作為展開劑，對點樣后的硅膠g薄層板展開20min。展開后，干燥薄層板，并噴施香草醛的體積濃度為5％的香草醛硫酸溶液，然后于101℃的溫度下加熱至硅膠g薄層板上顯現斑點。
分別以地黃標準品和不含地黃的龍膽瀉肝散作為對照組和陰性比對組，按上述試驗組的處理步驟和方法對對照組和陰性比對組均進行相同處理。對比經相同處理后的試驗組、對照組和陰性比對組的薄層色譜相對應的位置是否有相同顏色的斑點。
試驗例1
按實施例1-5的方法對龍膽瀉肝散中的地黃成分進行薄層色譜檢測。實施例1-5的結果均顯示：試驗組和對照組在薄層色譜對應的位置均出現了相同顏色的斑點，且色斑分離度極佳。此外，實施例2-5的結果還顯示陰性對比組的薄層色譜在試驗組顯色斑點對應的位置未出現相同顏色的斑點，說明該陰性對比組對試驗組未產生干擾，也即說明龍膽瀉肝散中的其它組成成分對地黃成分的檢測效果無影響，驗證了本檢測方法的可行性。
試驗例2
本試驗例就實施例5中樣品的預處理方法進行改變，直接將超聲后處理后的濾液蒸干，加甲醇溶解，得到樣品溶液(也即無對蒸干后的濾液加水溶解以及用乙酸乙酯提取的步驟)，其余處理均相同。按本試驗例處理后所得結果顯示：試驗組和對照組的薄層色譜顯示斑點清晰，試驗組和對照組的色譜對應的位置，斑點重合，不便于區分；且陰性對比組的色譜在對應位置也存在干擾。
說明預處理過程中蒸干后的濾液未進行加水溶解以及用乙酸乙酯提取的步驟，會造成陰性對比組對試驗組產生干擾，也即說明龍膽瀉肝散中的其它組成成分對地黃成分的檢測效果有影響。
因此，進一步驗證了實施例5中龍膽瀉肝散中地黃的薄層色譜檢測方法的可行性。
綜上所述，本發明實施例的龍膽瀉肝散中地黃的薄層色譜預處理方法能有效避免龍膽瀉肝散中其它物質對地黃檢測的影響，且經過該方式處理后能使檢測效果更加明顯，便于觀察。此外，本發明實施例中的檢測方法對地黃具有優異的展開性能，硅膠薄層板上斑點的分離度較佳，檢測過程中干擾因素少，檢測結果準確。
以上所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發明的實施例的詳細描述并非旨在限制要求保護的本發明的范圍，而是僅僅表示本發明的選定實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。