一種利用pH示差法測定紫色菊花花青素苷含量從而確定最佳采收期的方法與流程

本發(fā)明屬于菊花栽培和工業(yè)提取花青素苷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用ph示差法測定紫色菊花花青素苷含量從而確定最佳采收期的方法。

背景技術(shù)：

菊花，多年生草本植物，其頭狀花序色澤艷麗，富含黃酮類化合物、三萜類化合物和揮發(fā)油等多種有效成分，具有重要的觀賞、食用、茶用和藥用價值?；ㄇ嗨剀?，屬黃酮類化合物，是植物主要的呈色物質(zhì)，能夠清除自由基，具有抗氧化作用，在食品、保健、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域的應用日趨受到人們的關(guān)注。在所有色系的菊花品種中，紫色系菊花花瓣中花青素苷含量最高，從紫色菊花花瓣中工業(yè)化提取花青素苷對于延伸菊花產(chǎn)業(yè)鏈，提高菊花產(chǎn)業(yè)的總效益具有重要的意義。

有關(guān)紫色菊花花瓣中花青素苷的研究，目前主要集中在花青素苷的提取方面，有關(guān)其花青素苷的含量檢測方法的研究目前報道較少。已有紫色菊花花青素苷的檢測，常用單一ph下的分光光度法和高效液相色譜法兩種方法進行，由于菊花花青素提取過程中所得到的浸提液成分復雜，難免會有干擾物影響單一ph下的分光光度法對花青素苷含量的檢測；用高效液相色譜法檢測花青素苷的含量，則存在所需儀器設(shè)備較為昂貴的局限性。ph示差法能夠有效減少干擾物對花青素苷含量檢測的影響，且設(shè)備費用投入較小。目前，使用ph示差法檢測花青素苷含量的研究逐漸增多，但在紫色菊花花青素苷檢測方面目前報道較少，有關(guān)檢測方法中的相關(guān)參數(shù)目前仍不清楚。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了一種利用ph示差法測定紫色菊花花青素苷含量從而確定最佳采收期的方法，該方法利用ph示差法確定檢測紫色菊花花青素苷含量的相關(guān)參數(shù)，對檢測波長、ph和平衡時間進行篩選，通過測定花青素苷含量及計算單花序花青素苷含量的變化確定出紫色菊花的最佳采收時期，為工業(yè)提取花青素苷提供技術(shù)支持。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案，一種利用ph示差法測定紫色菊花花青素苷含量從而確定最佳采收期的方法，其特征在于具體步驟為：

（1）紫色菊花樣品的采集；

（2）花青素苷浸提液的制備；

（3）紫色菊花樣品中花青素苷的浸提；

（4）ph示差法條件參數(shù)檢測波長、ph及平衡時間的確定；

（5）紫色菊花花青素苷含量的測定；

（6）確定紫色菊花最佳采收期。

進一步優(yōu)選，步驟（1）的具體過程為：從紫色菊花開花進程選取4個取樣時期分別取菊花頭狀花序，將菊花頭狀花序鼓風干燥72h后準確稱取0.2g菊花花瓣樣品作為待測樣品。

進一步優(yōu)選，步驟（2）的具體過程為：將體積分數(shù)為80%的乙醇溶液與摩爾濃度為0.1mol/l的鹽酸溶液以1:2的體積比混合均勻配制成花青素苷浸提液。

進一步優(yōu)選，步驟（3）的具體過程為：將準確稱取的0.2g待測樣品剪至1cm置于10ml的離心管中，再添加10ml花青素苷浸提液，在室溫下浸提24h后濾去花瓣，花青素苷濾液用于花青素苷含量的測定，浸提過程中用雙層黑色塑料袋遮光以防止花青素苷的降解，并且每隔2-3h充分攪拌1次。

進一步優(yōu)選，步驟（4）的具體過程為：

檢測波長的確定，利用紫外-可見分光光度計對矢車菊色素-3-o-葡萄糖苷標準品和花青素苷濾液在200-800nm范圍內(nèi)進行全波段掃描，在可見光區(qū)內(nèi)，矢車菊色素-3-o-葡萄糖苷的最大吸收峰在511nm附近，花青素苷濾液中花青素苷的最大吸收峰在515nm附近，二者吸收峰相近，因此，確定515nm為花青素苷濾液中花青素苷的最大吸收波長，參考矢車菊色素-3-o-葡萄糖苷中的相關(guān)參數(shù)來計算花青素苷濾液中花青素苷的含量；

ph的確定，先將花青素苷濾液稀釋4倍，再分別準確量取稀釋后的花青素苷濾液1ml于9個試管中，然后分別加入ph為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0的緩沖液9ml，以浸提液調(diào)零，測定最大吸收波長下的吸光度，花青素苷濾液中花青素苷在ph1.0和ph4.5處的吸光度值的差值最大，并且在此兩處的ph附近吸光度值變化較小，所以選擇在ph1.0和ph4.5條件下測定花青素苷濾液中的花青素苷含量；

平衡時間的確定，先將花青素苷濾液用浸提液稀釋4倍，然后取0.5ml稀釋后的花青素苷濾液加入4.5mlph1.0的緩沖溶液，記錄樣品溶液與緩沖溶液混合后的時間，以浸提液調(diào)零，室溫下設(shè)置平衡時間在0-150min，每隔15min測一次最大吸收波長下的吸光度，用同樣的方法測ph4.5的緩沖溶液下樣品的平衡時間，在ph1.0的緩沖溶液中，花青素苷的吸光度值隨時間的延長而逐漸增加，在60min后趨于穩(wěn)定，在ph4.5的緩沖溶液中，花青素苷的吸光度值隨時間的延長而逐漸減少，在105min后趨于穩(wěn)定，根據(jù)兩者的數(shù)據(jù)進行綜合考慮，平衡時間選擇為105min。

進一步優(yōu)選，步驟（5）的具體過程為：將花青素苷濾液用浸提液稀釋4倍，然后取1ml稀釋后的花青素苷濾液加入ph1.0的緩沖溶液定容至10ml，室溫下平衡105min，以浸提液調(diào)零，分別在最大吸收波長和700nm處測定吸光度值，然后用同樣的方法測定花青素苷濾液在ph4.5的緩沖溶液中最大吸收波長和700nm處的吸光度值，然后代入公式（1）計算紫色菊花花青素苷含量，

x=?t*v*f*m*1000/ε*m（1）

其中x為紫色菊花花青素苷含量，mg/g；v為稀釋體積，l；f為稀釋倍數(shù)；m=449.2；ε=26900；?t為吸光度值，?t=(aλmax-a700nm)ph1.0-(aλmax-a700nm)ph4.5；m為樣品質(zhì)量，g。

進一步優(yōu)選，步驟（6）的具體過程為：綜合所測得的紫色菊花花青素苷含量和計算得到的單花序花青素苷含量，篩選出紫色菊花花青素苷含量較高且不同取樣批次間均勻度高，同時單花序花青素苷含量也較高的采樣時期，從而確定紫色菊花的最佳采收時期。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：

1、能夠有效減少干擾物對紫色菊花花青素苷含量檢測的影響；

2、設(shè)備費用投入較少，方便操作簡單快捷，為測定紫色菊花花青素苷含量提供了方便，能夠有效紫色菊花的最佳采收時期，為工業(yè)化提取紫色菊花花青素苷提供了技術(shù)支持。

附圖說明

圖1是紫色菊花4個取樣時期的頭狀花序形態(tài)圖；

圖2是矢車菊色素-3-o-葡萄糖苷光譜圖；

圖3是紫色菊花‘紅五九’花青素苷光譜圖；

圖4是紫色菊花‘紅五九’在不同ph下的吸光度值；

圖5是紫色菊花‘紅五九’吸光度值隨時間的變化曲線（ph1.0和ph4.5）。

具體實施方式

以下通過實施例對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進一步詳細說明，但不應該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

實施例

樣品采集

本試驗以紫色菊花品種‘紅五九’為供試材料，按行距60cm、株距40cm種植在生物園地菊花圃，自然生長。在菊花根部萌蘗嫩莖長至15-20cm時（4月20日）采集10cm健壯頂芽，留頂部兩片微張開葉片，其余葉片均去除，然后在沙床上扦插育苗，至6月1日幼苗具10-12條8cm以上長度的根時開始移栽定植。從中挑選12株生長健壯且株型相似的菊花作為實驗對象。隨菊花開花進程選取4個取樣時期（見圖1），在各時期取菊花頭狀花序，用于形態(tài)和生理指標的檢測。各時期形態(tài)特征如下：

ii期：花序最外層花瓣展開至豎立狀態(tài)（開花初期）；

iii期：花序最外層花瓣展開至45°張角（盛花前期）；

iv期：花序最外層花瓣完全伸展，中間管狀花集中部分全為黃色（盛花中期）；

v期：花序最外層花瓣完全伸展，中間管狀花區(qū)域外圍一、二圈黃色消失且雌蕊“y”形柱頭突出（盛花后期）。

菊花外輪第一輪花瓣長度和干重均采用直接測量和直接稱重法測定。具體操作步驟為：取樣后，將從菊花圃采回來的新鮮花瓣先用濕紗布擦去表面灰塵，再用吸水紙吸干表面水分，記錄花朵數(shù)，選擇代表型花朵測量并記錄第一輪花瓣的長度。將所有花瓣從花序上取下，在40℃下鼓風干燥72h后稱量花序花瓣干重，單花序花瓣干重由當次采集多朵花序總干重除以花序數(shù)求得。最后將材料收集置于黑色塑料布中，陰涼通風處存放，用于后續(xù)花青素苷含量的檢測。

‘紅五九’花瓣花青素苷浸提液的配制

準確量取400ml無水乙醇用雙蒸水定容于500ml的容量瓶中配制成體積分數(shù)為80%的乙醇溶液；準確量取8.33ml的濃鹽酸用雙蒸水定容于1000ml容量瓶中配制成摩爾濃度為0.1mol/l的鹽酸溶液；再將體積分數(shù)為80%的乙醇溶液與摩爾濃度為0.1mol/l的鹽酸溶液以1:2的體積比混合均勻配制成花青素苷浸提液。

‘紅五九’花瓣花青素苷的浸提

準確稱取0.2g不同時期采收的處理后的菊花花瓣樣品，將稱量好的菊花花瓣剪至1cm左右置于10ml的離心管中，添加10ml花青素苷浸提液，在室溫下浸提24h后濾去花瓣，花青素苷濾液用于花青素苷含量的測定，浸提過程中用雙層黑色塑料袋遮光，防止花青素苷降解，并且每隔2-3h充分搖勻1次。

ph示差法相關(guān)條件的確定

測定波長的選擇：先用矢車菊色素-3-o-葡萄糖苷的標準品，用ph1.0的緩沖液配制成溶液，稀釋合適倍數(shù)后，在波長200-800nm范圍內(nèi)進行全波段光譜掃描，確定其最大測定吸收波長?？瞻讓φ沼媒嵋?。參考同種方法對‘紅五九’的濾液進行200-800nm全波段光譜掃描，確定其最大吸收波長。

ph的選定：由于花青素苷僅在ph小于7的酸性條件下穩(wěn)定，因此先將‘紅五九’花瓣濾液稀釋4倍，再分別準確量取稀釋后的濾液1ml于9個試管中，再分別加入ph為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0的緩沖液9ml，以浸提液調(diào)零，測定最大吸收波長下的吸光度，根據(jù)吸光度的變化選擇合適的ph花青素含量測定參照ph示差法進行。

平衡時間的確定：改變花青素苷的溶液條件后，花青素苷的結(jié)構(gòu)形式需要經(jīng)過一定時間才能達到動態(tài)平衡。先將花青素苷濾液用浸提液稀釋4倍，然后取0.5ml樣品稀釋液再加入4.5mlph1.0的緩沖溶液，記錄樣品溶液與緩沖溶液混合后的時間，以浸提液調(diào)零，室溫下設(shè)置平衡時間在0-150min之內(nèi)，每隔15min測一次最大吸收波長下的吸光度。用同樣的方法測ph4.5的緩沖溶液下樣品的平衡時間。

花青素苷含量的測定：將花青素苷濾液用浸提液稀釋4倍，然后取1ml樣品稀釋液再加入ph1.0的緩沖溶液定容至10ml，室溫下平衡后，以浸提液調(diào)零，分別在最大吸收波長和700nm處測定吸光度值。然后用同樣的方法測定濾液在ph4.5的緩沖溶液中最大吸收波長和700nm處的吸光度值，按公式（1）計算花青素苷含量。

x=?t*v*f*m*1000/ε*m（1）

其中x為紫色菊花花青素苷含量，mg/g；v為稀釋體積，l；f為稀釋倍數(shù)；m=449.2；ε=26900；?t為吸光度值，?t=(aλmax-a700nm)ph1.0-(aλmax-a700nm)ph4.5；m為樣品質(zhì)量，g。

利用上述ph示差法測定紫色菊花品種‘紅五九’花青素苷相關(guān)條件及花青素苷含量結(jié)果如下：

測定波長的選擇利用紫外-可見分光光度計對矢車菊色素-3-o-葡萄糖苷標準品和‘紅五九’濾液在200-800nm范圍內(nèi)進行全波段掃描。在可見光區(qū)內(nèi)，矢車菊色素-3-o-葡萄糖苷（見圖2）的最大吸收峰在511nm附近，‘紅五九’濾液中花青素苷（見圖3）的最大吸收峰在515nm附近，二者吸收峰相近，因此，確定515nm為‘紅五九’中花青素苷的最大吸收波長，參考矢車菊色素-3-o-葡萄糖苷中的相關(guān)參數(shù)來計算‘紅五九’中花青素苷的含量。

ph的選定由圖4可知，‘紅五九’中的花青素苷在ph1.0和ph4.5處的吸光度的差值最大，并且在此兩處的ph附近吸光度值變化較小，所以選擇在ph1.0和ph4.5條件下測定‘紅五九’的花青素苷的含量。

平衡時間的確定圖5反映了在ph1.0和ph4.5緩沖溶液處理下，花青素苷提取液的吸光度值在不同時間下的變化情況。結(jié)果表明，在ph1.0的緩沖溶液中，花青素苷的吸光度值隨時間的延長而逐漸增加，在60min后趨于穩(wěn)定。在ph4.5的緩沖溶液中，花青素苷的吸光度值隨時間的延長而逐漸減少，在105min后趨于穩(wěn)定。因此，根據(jù)兩者的數(shù)據(jù)進行綜合考慮，平衡時間選擇為105min。

如表1所示，將上述4個采收狀態(tài)下‘紅五九’頭狀花序花瓣花青素苷含量和單花序花青素苷含量的變化結(jié)果進行比較可知，在不同開花狀態(tài)下采收，隨著采收期的推遲，采收具體時間后移，外輪第一輪花瓣長度逐漸增大且在不同批次間的差異逐漸減??；單花序花瓣平均干重隨采收期的推遲逐漸增加，在各個采收狀態(tài)下隨取樣具體日期的推遲逐漸減少；花青素苷含量在ii期、iii期和v期采收時，不同批次樣品均存在顯著差異，在iv期采收時不同批次樣品無顯著差異且數(shù)值較高；單花序花青素苷含量隨采收期的推遲逐漸增加，且隨具體采收日期的推遲均逐漸減少。綜上可知，在iv期采收時，可獲得花青素苷含量較高且不同取樣批次間均勻度高的樣品，同時單花序花青素苷含量也較高。因此，確定iv期菊花品種‘紅五九’工業(yè)提取花青素苷最佳采收期。

表1不同采收期‘紅五九’取樣時間、形態(tài)和生理指標變化比較

以上實施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點，本行業(yè)的技術(shù)人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進均落入本發(fā)明保護的范圍內(nèi)。