本發明屬生物檢測技術領域，更具體地說，本發明涉及一種快速高效的檢測生物樣本中eets的新方法。
背景技術：
腦內富含脂肪酸，特別是不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids,pufas)；主要有三種：分別花生四烯酸(arachidonicacid,ara)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid,dha)和二十碳五烯酸(eicosapentaenicacid,epa)。ara是細胞膜的重要組成部分，也是類花生四烯酸的主要前體；細胞膜上的ara與磷脂結合，簡稱脂化(esterified)。當膜受體與配體結合后，激活磷脂酶a2(pla2)，引起ara脫脂化而形成游離的ara；在多種代謝酶的作用下，游離的ara生成具有多種生物活性的類花生四烯酸(eicosanoids)。
花生四烯酸(arachidonicacid,ara)的代謝產物具有廣泛的生理功能，其信號通路在很多神經性疾病中發生改變，如疼痛、阿爾茨海默病(alzheimer’sdisease)、抑郁癥等。但生物樣品的成分復雜、基質干擾大，并且環氧花生四烯酸(epoxyeicosatrienoicacids，eets)在血漿和腦組織中極其不穩定。因此，建立高效、靈敏的生物樣品ara代謝產物分析方法對于很多神經性疾病的精準診斷和治療具有重要的科學意義。
ara代謝主要有三條途徑：環加氧酶(cox)、脂氧合酶(lox)和細胞色素p450(cyp)途徑。類花生四烯酸與炎癥有密切關系，因此，ara-cox、ara-lox代謝途徑的酶、受體以及代謝產物等作為靶點被廣泛用于抗炎藥物的研發，包括各種cox抑制劑、lox抑制劑等。cyp途徑分為：ω-水解途徑(ω-hydroxylases)和環氧花生四烯酸(epoxyeicosatrienoicacids，eets)生成途徑(后者簡稱ara-eets代謝途徑)(請參見圖1)。對ara-eets代謝途徑的研究始于1980年，直到1996年發現eets是一類內皮細胞源性的血管舒張因子后，對ara-eets代謝途徑的研究才引起學界的廣泛興趣。
ara在cyp2j/c的作用下生成eets；環氧化物水解酶(seh)將一個水分子插入eets的環氧基團，生成相應的、低活性的二羥基二十碳三烯酸(dhet)。eets有四個異構體：5,6-、8,9-、11,12-、14,15-eet；eets具有多種相似的生物活性，如抗炎、抗血小板聚集、舒張血管、促進血液干細胞移植體的生長等等，但四個異構體存在組織分布、生物學特性的個體差異。
提高生物樣本中ara代謝產物的檢測精準性，可從采用精準的檢測儀器和改變樣品的前處理程序兩方面著手；在相同實驗設備的條件下，完善樣品的前處理方法可以提高生物樣本中ara代謝產物的檢測精準性。國內外最常見的生物樣品前處理方法有以下幾種，它們各自的優缺點如下：
1、沉淀蛋白法：通過沉淀蛋白質可以將待測的化合物釋放出來，起到提取和純化待測物的目的，可用于測定化合物的濃度。其優點是操作簡便易行、效率高、省時省力、節約成本，目標物回收率較高，可以減少樣品的乳化現象，另外還可以保護儀器，延長使用命。缺點：與液液萃取相比，該法僅除去了蛋白質，內源性雜質并沒有除去；且運用該方法處理后的樣品，目標物會被稀釋，濃度降低，對儀器的靈敏度要求更高；另外，此法所得樣品不能用光譜法檢測。
2、液液萃取法：液-液萃取(lle)是在液體混合物中加入與其不相混溶(或稍相混溶)的溶劑，利用組分在溶劑中的不同溶解度而達到分離或提取目的，又稱溶劑萃取或抽提。其優點是應用范圍廣、經該方法處理后樣品純度較高，基質效應小。缺點是需要大量使用有機溶劑，而大部分有機溶劑有毒，存在乳化現象，也難以實現自動化；此外，與沉淀蛋白法相比，lle步驟較多，易產生損耗，萃取率不高。
固相萃取法：固相萃取法(spe)是用固體物質作為萃取劑，采用高效、高選擇性的固定相，進行萃取的樣品預處理技術。其優點是安全性高、選擇性好、分析速度快、回收率高、自動化程度高、操作簡單而應用廣；且溶劑用量少，不易產生乳化。但缺點是操作步驟多，效率低；柱子截面積小，流量低，易堵塞；易產生縫隙，降低提取效率；重復性較差；且前處理成本高。
鑒于此，迫切需要一種簡單高效、操作簡單、重復性好的檢測生物樣本中eets的新方法。
技術實現要素：
本發明的目的在于：克服現有生物樣本中花生四烯酸代謝產物—環氧花生四烯酸(eets)的檢測方法中存在的缺陷，提供一種樣品萃取溶劑及應用該樣品萃取溶劑實現檢測生物樣本中環氧花生四烯酸的方法。
為了實現上述發明目的，本發明提供了一種樣品萃取溶劑，其包括甲醇、乙腈、乙酸和11,12-eet-d11。
優選，所述的樣品萃取溶劑包括甲醇、乙腈、乙酸和11,12-eet-d11，其中按體積比，甲醇：乙腈：乙酸＝1:1:0.04％，11,12-eet-d11的終濃度為20ppb。
本發明樣品萃取溶劑可以用于快速檢測腦組織中的eets，具體檢測方法包括如下步驟：
(1)取生物樣品，加入pbs溶液并制成勻漿；
(2)在勻漿中加入seh抑制劑反式-4-{4-[3-(4-三氟甲氧基-苯基)-脲基]-環己氧基}-苯甲酸，再加入等比例加入樣品萃取溶劑，震蕩離心后沉淀；
(3)離心取上清過濾，濾液作為待測樣品；
(4)將待測樣品通過thermofisherscientificturboflow在線樣品前處理系統和超高效液相色譜串聯質譜儀進行檢測，即可得出腦組織中eets的濃度；
其中，步驟(2)所述樣品萃取溶劑包括甲醇、乙腈、乙酸和11,12-eet-d11。
優選，所述的樣品萃取溶劑包括甲醇、乙腈、乙酸和11,12-eet-d11，其中按體積比，甲醇：乙腈：乙酸＝1:1:0.04％，11,12-eet-d11的終濃度為20ppb。
作為本發明快速檢測腦組織eets的方法的一種改進，步驟(1)中，所述pbs溶液的加入量為10μl/mg生物樣品。
作為本發明快速檢測腦組織eets的方法的一種改進，步驟(2)中，所述seh抑制劑反式-4-{4-[3-(4-三氟甲氧基-苯基)-脲基]-環己氧基}-苯甲酸的終濃度為0.8nmol/l。
作為本發明快速檢測腦組織eets的方法的一種改進，步驟(2)中，所述震蕩時間為10min，所述離心的條件為5000rpm離心1min。
作為本發明快速檢測腦組織eets的方法的一種改進，步驟(2)中，所述沉淀溫度為-20℃，沉淀時間為1.5h。
作為本發明快速檢測腦組織eets的方法的一種改進，步驟(3)中，所述離心的條件為4℃、14000rpm離心10min。
作為本發明快速檢測腦組織eets的方法的一種改進，步驟(3)中，所述過濾是使用0.22μm微孔濾膜過濾。
相對于現有技術，本發明樣品萃取溶劑及其在花生四烯酸代謝產物檢測中的應用具有如下有益效果：
(1)本發明樣品萃取溶劑應用于花生四烯酸代謝產物的沉淀蛋白法檢測中，具有eets提取效率高、防止eets被氧化、減緩eets轉化為dhet的速度等優點。
(2)本發明快速檢測腦組織eets的方法在沉淀蛋白法的基礎上，優化了前處理過程，具有定量準確、快速高效、操作簡單、重復性好等優點，對神經精神疾病等醫學研究具有重要意義。
附圖說明
下面結合附圖和具體實施方式，對本發明快速檢測腦組織eets的新方法及其有益效果進行詳細說明。
圖1為ara-eets代謝途徑示意圖。
具體實施方式
為了使本發明的目的、技術方案和有益技術效果更加清晰，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解的是，本說明書中描述的實施例僅僅是為了解釋本發明，并非為了限定本發明，實施例的參數、比例等可因地制宜做出選擇而對結果并無實質性影響。
實施例1
樣品前處理：
(1)取新鮮腦組織樣品，稱濕重，按10μl/mg比例加入pbs液，用均質器充分勻漿(6500rpm,1min)，立取勻漿液到1.5ml離心管中，加入seh抑制劑反式-4-{4-[3-(4-三氟甲氧基-苯基)-脲基]-環己氧基}-苯甲酸(4μl/100μl，終濃度0.8nmol/l)，得到待處理樣品。
(2)沉淀蛋白：在步驟(1)的待處理樣品中等比例(1：1)加入終濃度為20ng/ml(20ppb)的樣品萃取溶劑，震蕩10min，4℃5000rpm離心1分鐘，置于–20°冰箱沉淀蛋白1.5小時，取出后4℃14000rpm離心10分鐘，取上清，0.22μm微孔濾膜過濾，放入進樣小瓶中待測(按下述uplc-ms/ms條件、色譜條件和質譜條件進行分析)。
其中，20ng/ml的樣品萃取溶劑的組分為甲醇：乙腈：乙酸＝1:1:0.04％(v/v/v)，該溶劑中還含有終濃度為20ppb的內標(11,12-eet-d11)。
含有終濃度為20ppb內標的樣品萃取溶劑的配制方法如下：
(1)10ml甲醇、10ml乙腈、8μl乙酸混勻于50ml離心管管中，保存于–20℃冰箱中備用。其中10ml甲醇中含有終濃度為40ppb的內標(11,12-eet-d11)。
(2)含有終濃度為40ppb內標的10ml甲醇溶液配制方法如下：9.6ml的甲醇溶液中加入400μl終濃度為1ppm的內標(11,12-eet-d11)，混勻，定容為10ml，–20℃冰箱中備用。
(3)終濃度為1ppm的內標(11,12-eet-d11)配制方法如下：990μl甲醇溶液中加入10μleet內標11,12-eet-d11的原液(100ppm)，混勻，定容為1ml，置于–80℃冰箱保存。
上述實驗試劑中，eet標準品，(5,6-、8,9-、11,12-、14,15-eet)與內標(11,12-eet-d11)購自caymanchemical公司，質譜級的甲醇、乙腈、異丙醇均購自德國默克公司(merckkgaa)，質譜級的甲酸、乙酸來自于美國賽默飛世爾科技公司(thermofisherscientificcorp.usa)，雙蒸水為屈臣氏蒸餾水。
uplc-ms/ms條件：
使用儀器：thermofisherscientificturboflow在線樣品前處理系統和thermofisherscientifictsqquantivatm三重四極桿液相色譜串聯質譜儀，tracefinder3.3數據處理系統(thermofisherscientificcorp.usa)，法國bertinprecellys24生物樣品均質器(bertinprecellys24-dual,bertintechnologies)。
色譜條件：分析柱：watersacquityuplcbehc18column(2.1×150mm,1.7μm).預柱：美國賽默飛世爾turboflowcyclonepcolumns(0.5×50mm)；流動相：0.02％乙酸水(a)、乙腈(b)、乙腈：異丙醇＝1:1(c)；流速：0.30ml/min；柱溫：40℃；自動進樣器溫度：4℃；進樣量：20μl；梯度洗脫程序請參見表1。
質譜條件：質譜采用選擇反應監測掃描方式和負離子監測模式進行樣品分析。eet和eet內標的電噴霧電壓均為+2000v，-2500v；毛細管溫度：350℃；離子化溫度均為：300℃；鞘氣流速：55arb；輔助氣流速：12arb；其他主要質譜條件請參見表2；掃描時間為10min。
表1梯度洗脫程序
表2eet和其內標主要質譜條件，q2代表定量子離子
結果發現，按上述方法進行前處理后再測定腦小鼠腦組織內eets，其eets的提取效率得到了很大的提高，具體參數為：絕對回收率為97.71％、14,15-eet峰面積為1038，14,15-eet(ng/g)為3.15。
實驗例2沉淀蛋白所用溶劑的選擇
甲醇、乙睛、丙酮和乙醇是沉淀蛋白常用的有機溶劑，本發明檢測方法經實驗考察:分別采用六種溶劑(等比例的甲醇:異丙醇，等比例的甲醇:異丙醇加0.04％乙酸、等比例的甲醇:乙腈、等比例的甲醇乙腈加0.04％乙酸、純乙腈、純乙腈加0.04％乙酸)，用蛋白沉淀法提取小鼠腦組織(皮層)的eets(具體操作方法參照實施例1，只是樣品萃取溶劑的配方不同而已)，比較六種樣品萃取溶劑對小鼠腦組織內eets濃度的提取效率，發現當甲醇：乙腈＝1:1混合，并在其中加入0.04％乙酸時，對腦組織沉淀蛋白法效果最佳，這是因為乙酸的加入具有防止eets被氧化，減緩eets轉化為dhets的效率，提高eets的提取效率的效果。故最優選采用此比例配置，結果請參見表3(其中，絕對回收率低于70％的溶劑不再計算目標物峰面積與含量)。
表3不同溶劑對小鼠腦組織內eets的提取效率
實驗例3
實施例1色譜質譜條件測定所配制的eets標準溶液，以11,12-eet-d11為內標，終濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml，以待測物的濃度為橫坐標，待測物與內標峰面積的比值為縱坐標，用加權最小溢乘法(w＝1/x)進行回歸運算各被測物質的線性相關系數均大于0.99，結果請參見表4。
表4表性化合物的線性關系及定量限
實驗例4準確度、精密度、基質效應和回收率
以腦前額葉皮質樣本為代表，在樣品處理前加入0.2、2、20ng/ml3個濃度的混合標準溶液(5,6-，8,9-，11,12-，14,15-eet四種eets標準品混合液)，每個濃度平行制備3個樣品，以相對回收率和rsd來表征方法的準確度和日內精密度；日間精密度的評價是在5個工作日內分別制備3個濃度的樣品，計算其rsd值。結果由表5可見，待測物質的回收率在80.7～100.6％之間，方法重復性在可接受的范圍內(rsd<15％)。
由于空白生物樣品無法得到，本實驗例通過比較相同量的內標在實際組織與純溶劑中的峰面積之比考察是否有離子增強或抑制效應。結果顯示，內標在相應保留時間出峰，且響應信號沒有明顯的增強或減弱，說明不存在明顯的基質效應影響(結果請參見表5)。
表5代表性化合物的回收率、基質效應以及日間精密度
實施例5
c57bl6/j小鼠不同腦區腦組織eets測定：
1)8-10周齡成年c57bl6/j小鼠8只，10％水合氯醛腹腔注射350mg/kg麻醉，斷頭、取腦，分別分離前額葉皮層(mpfc)、皮層(cerebralcortex)、海馬(hippocampus)、紋狀體(striatum)、伏隔核(nac)。
2)取新鮮腦組織樣品20mg，稱濕重，按10μl/mg比例加入pbs液200μl，用均質器充分勻漿1min(6500rpm)，立取勻漿液200μl到1.5ml離心管中，加入seh抑制劑反式-4-{4-[3-(4-三氟甲氧基-苯基)-脲基]-環己氧基}-苯甲酸8μl(4μl/100μl，終濃0.8nmol/l)，待處理。
3)沉淀蛋白：在步驟2)的200μl待處理的腦組織樣品中加入終濃度為20ng/ml的樣品萃取溶劑(同實施例1)200μl，震蕩10min(4500rpm)，4℃5000rpm離心1分鐘，置于–20°冰箱沉淀蛋白1.5小時，取出后4℃14000rpm離心10分鐘，取上清200μl，0.22μm微孔濾膜過濾，放入進樣小瓶中待測。
4)采用thermofisherscientificturboflow在線樣品前處理系統和thermofisherscientifictsqquantivatm三重四極桿液相色譜串聯質譜儀進行檢測。檢測結果如表6所示。
表6不同腦區組織的eets濃度結果如下(n＝8.
該表格是不同腦區里eets濃度結果，其中樣本量等于8，濃度結果用平均值±標準差表示。
根據上述說明書的揭示和教導，本發明所屬領域的技術人員還可以對上述實施方式進行適當的變更和修改。因此，本發明并不局限于上面揭示和描述的具體實施方式，對本發明的一些修改和變更也應當落入本發明的權利要求的保護范圍內。此外，盡管本說明書中使用了一些特定的術語，但這些術語只是為了方便說明，并不對本發明構成任何限制。