本發明涉及植物同化銨鹽的無機氮同位素分餾值的測定方法，屬于作物生產技術領域。
技術背景
氮是植物生長發育過程中的必需元素，是構成蛋白質、核酸、酶、葉綠素等的重要組成成分。大多數植物吸收利用的無機氮主要是硝酸鹽和銨鹽。植物吸收硝酸鹽需要經過還原后才能被植物同化，而銨鹽可直接被植物同化。通常每還原1分子硝酸鹽需要花費15分子atp，而同化1分子銨鹽僅需5分子atp。因此，從植物的能量花費角度考慮，植物吸收利用銨鹽會比較節省能量。然而大多數植物在銨鹽作為單獨氮源培養時通常長勢不好，生長發育受到抑制。而硝酸鹽和銨鹽共同存在時，植物生長發育最好。因此，在對植物進行氮管理時，需要合理確定硝酸鹽和銨鹽的用量。在硝酸鹽和銨鹽共存下，使植物利用較多的銨鹽是比較明智的策略。植物利用銨鹽份額與銨鹽的供應有關，銨鹽供應越多，植物利用銨鹽的份額就越大。但是銨鹽濃度過高時，雖然植物的銨鹽份額很高，但此時就發生銨的無效循環，并最終導致能量的浪費。而硝酸鹽和銨鹽供應下，植物同化銨鹽的能力較強，且利用銨鹽份額也就較高，無疑是很優的狀態。
植物在同化硝酸鹽和銨鹽時都會發生穩定氮同位素分餾，通常情況下，植物的氮同化能力越強，發生的穩定氮同位素分餾值就越小。因此，可以通過穩定氮同位素分餾值來確定植物的氮同化能力。然而，在野外種植或水培種植植物的硝酸鹽和銨鹽的氮同化既發生在葉片又發生在根部，因此很難通過測定葉片或根部的穩定氮同位素值來判斷植物同化銨鹽的能力。
穩定氮同位素技術目前已廣泛應用到生態學等領域，穩定氮同位素被用作氮源的指示劑來研究生物圈的氮循環。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是：提供一種測定植物同化銨鹽的無機氮同位素分餾值的方法，以填補或因在單銨下無法生長的植物或在混合氮源下生長的植物的同化銨鹽的無機氮同位素分餾值測定的空白。本發明的技術方案：
它包含以下步驟：
第一，通過植物組織培養技術獲得同一基因型的無性系組培苗，通過調節培養基的激素比例使組培苗處于增殖階段，形成無根的無性系組培苗；
第二，通過同位素質譜儀測定用于配置植物組織培養的培養基中的硝酸鹽的穩定氮同位素比值，篩選出穩定氮同位素值差值大于10‰的兩種硝酸鹽，其穩定氮同位素值分別為δ15n01和δ15n02；分別將這兩種硝酸鹽作為唯一氮源配置培養基；
第三，將上述無性系組培苗分別培養在上述穩定氮同位素值不同的兩種硝酸鹽作為唯一氮源的培養基中；
第四，待組培苗經過5周培養后，分別測定上述兩種硝酸鹽作為唯一氮源的培養基培養下的組培苗葉片的穩定氮同位素值，其葉片穩定氮同位素值分別記為δ15nn1和δ15nn2；
第五，選用銨鹽配置植物組織培養的培養基，保證其穩定氮同位素值δ15na與δ15n01或δ15n02的差值均大于10‰；然后將銨鹽分別與上述穩定氮同位素值不同的兩種硝酸鹽組成混合氮源，配置兩種不同的混合氮源培養基；
第六，同樣，另取無性系組培苗，將其分別培養在上述兩種不同的混合氮源培養基上；
第七，同樣，組培苗經過5周培養后，測定上述兩種混合氮源培養下組培苗葉片穩定氮同位素值，銨鹽與穩定氮同位素值為δ15n01的硝酸鹽組成的混合氮源培養下的組培苗葉片穩定氮同位素值記為δ15nn1mix，銨鹽與穩定氮同位素值為δ15n02的硝酸鹽組成的混合氮源培養下的組培苗葉片穩定氮同位素值記為δ15nn2mix；
第八，將δ15nn1、δ15nn2、δ15nn1mix和δ15nn2mix代入方程：
第九，將組培苗利用硝酸鹽的份額fb代入方程：
第十，依據δ15na-t和δ15na求出組培苗同化銨鹽發生的穩定氮同位素分餾值δ15na，δ15na＝δ15na-δ15na-t；δ15na也即是待測植物同化銨鹽發生的穩定氮同位素分餾值。
本發明優點
1)本發明可以測定或因在單銨下無法生長的植物或在混合氮源下生長的植物的同化銨鹽的無機氮同位素分餾值。
2)本發明通過雙向穩定氮同位素標記培養技術，在測定植物同化銨鹽的無機氮分餾值的同時也測定出植物硝酸鹽和銨鹽的利用份額，根據植物同化銨鹽的無機氮同位素分餾值及銨鹽利用份額，可以評價不同條件下的銨氮同化能力，以便有效管理植物的氮肥使用，避免氮源的浪費和氮肥過多施用對環境的危害。
3)本方法為優質組培苗的培養基篩選提供了技術支持，即選擇組培苗銨鹽利用份額較高，同時同化銨鹽發生穩定氮同位素分餾值較小的培養基。
4)本方法利用同一基因型的無性系組培苗開展培養實驗，測定的同位素誤差小，因此測定的結果更為可靠。
5)本方法采用的步驟少，計算簡單。
在植物組織培養的增殖階段，可以通過調節細胞分裂素和生長素的濃度比例來確保組培苗在整個增殖階段不產生根，這樣硝酸鹽和銨鹽的同化就僅發生在葉片。因此，就可通過測定葉片穩定氮同位素值來確定組培苗同化銨鹽發生的無機氮同位素分餾值，在結合組培苗銨鹽的利用份額，就可為植物的有效氮管理提供指導依據。本發明測定組培苗的硝酸鹽和銨鹽的利用份額是通過雙向氮同位素標記培養法。首先用兩種穩定氮同位素差值大于10‰的硝酸鹽同時培養組培苗，然后，在分別用這兩種硝酸鹽與同一種銨鹽同時培養組培苗，保證銨鹽的穩定氮同位素值與這兩種硝酸鹽的穩定氮同位素值差值均大于10‰。最后就可求得組培苗分別利用硝酸鹽和銨鹽的份額。知道組培苗利用硝酸鹽和銨鹽的份額后，也就可確定組培苗同化銨鹽發生的穩定氮同位素分餾值。
發明原理
穩定氮同位素技術目前已被廣泛用著氮源的指示劑來研究生物圈的氮循環。自然界中氮元素的兩種穩定氮同位素為14n和15n，穩定氮同位素值通常用δ15n(‰)表示，自然界中δ15n的變化為-10‰～+20‰。培養在不同氮源下的植物的葉片氮同位素值能很好地反映氮源的穩定氮同位素值的特征。因此，通過質量平衡原理和同位素混合模型就可定量判別植物體內不同的無機氮源。
組培苗在同化硝酸鹽和銨鹽時都會存在一定的氮同位素分餾。在混合氮源條件下培養的組培苗葉片的穩定氮同位素值是同化硝酸鹽和銨鹽發生氮同位素分餾后的穩定氮同位素值混合的結果。因此，要計算出硝酸鹽和銨鹽的利用份額，就得準確知道混合氮源培養下組培苗同化硝酸鹽和銨鹽發生氮同位素分餾后的穩定氮同位素值。由于銨鹽作為單獨氮源時，有些組培苗不能正常生長，例如十字花科植物的組培苗。因此，選用兩種穩定氮同位素值差值大于10‰的硝酸鹽作為單獨氮源同時培養組培苗。測定組培苗分別在這兩種穩定氮同位素值不同的硝酸鹽培養下的組培苗葉片穩定氮同位素值。然后，將篩選出的銨鹽分別和兩種穩定氮同位素值不同的硝酸鹽組成混合氮源同時培養組培苗，銨鹽的穩定氮同位素值與兩種硝酸鹽的穩定氮同位素值的差值均大于10‰。分別測定兩種混合氮源培養下組培苗葉片的穩定氮同位素值。最后通過兩端元混合模型來計算出組培苗分別利用硝酸鹽和銨鹽的份額。
兩端元的同位素混合模型表示為：
δ15nn1mix＝fbδ15nn1+faδ15na-t(1)
δ15nn2mix＝fbδ15nn2+faδ15na-t(2)
fa＝1-fb(3)
這里的δ15nn1和δ15nn2分別為組培苗在穩定氮同位素值差值大于10‰的兩種硝酸鹽培養下的葉片穩定氮同位素值，δ15na-t為混合氮源培養下組培苗同化銨鹽發生氮同位素分餾后的穩定氮同位素值。δ15nn1mix是穩定氮同位素值為δ15n01的硝酸鹽與銨鹽組成混合氮源培養下的組培苗葉片的穩定氮同位素值。δ15nn2mix是穩定氮同位素值為δ15n02的硝酸鹽與銨鹽組成混合氮源培養下的組培苗葉片的穩定氮同位素值。fb為硝酸鹽的利用份額，fa為銨鹽的利用份額。
聯立方程(1)(2)和(3)，求解得到：
而植物組培苗在混合氮源培養下同化銨鹽發生的穩定氮同位素分餾值(δ15na)即為δ15na與δ15na-t的差值，具體表述如方程(6)所示：
δ15na＝δ15na-δ15na-t(6)
根據計算得到的硝酸鹽和銨鹽利用份額，同時結合各培養條件下組培苗同化銨鹽發生的穩定氮同位素分餾值，就可篩選出合適的培養基。
最后，根據不同氮條件下組培苗同化銨鹽的無機氮同位素分餾值及銨鹽利用份額，就可對植物進行有效的氮管理。
具體實施方式
本發明的實施例：它包括以下步驟：
第一步驟，通過植物組織培養技術獲得同一基因型的無性系組培苗，通過調節培養基的激素比例使組培苗處于增殖階段，形成無根的無性系組培苗；
第二步驟：通過同位素質譜儀測定用于配置植物組織培養的培養基中的硝酸鹽的穩定氮同位素比值，篩選出兩種穩定氮同位素值差值大于10‰的兩種硝酸鹽，其穩定氮同位素值分別為δ15n01和δ15n02；分別將這兩種穩定氮同位素值不同的硝酸鹽作為唯一氮源配置合適濃度的培養基；
第三步驟，將上述無性系組培苗分別培養在上述兩種穩定氮同位素值不同的硝酸鹽作為唯一氮源的培養基中；
第四步驟，待組培苗經過5周培養后，分別測定上述兩種硝酸鹽作為唯一氮源的培養基培養下的組培苗葉片的穩定氮同位素值，其葉片穩定氮同位素值分別記為δ15nn1和δ15nn2；
第五步驟，選用穩定氮同位素值合適的用于配置植物組織培養的培養基的銨鹽，保證其穩定氮同位素值δ15na與δ15n01或δ15n02的差值均大于10‰；然后將銨鹽分別與上述穩定氮同位素值不同的兩種硝酸鹽組成混合氮源，配置兩種不同的混合氮源培養基；
第六步驟，同樣，另取無性系組培苗，將其分別培養在上述兩種不同的混合氮源培養基上；
第七步驟，同樣，組培苗經過5周培養后，測定上述兩種混合氮源培養下組培苗葉片穩定氮同位素值，銨鹽與穩定氮同位素值為δ15n01的硝酸鹽組成的混合氮源培養下的組培苗葉片穩定氮同位素值記為δ15nn1mix，銨鹽與穩定氮同位素值為δ15n02的硝酸鹽組成的混合氮源培養下的組培苗葉片穩定氮同位素值記為δ15nn2mix；
第八步驟，將δ15nn1、δ15nn2、δ15nn1mix和δ15nn2mix代入方程：
第九步驟，將組培苗利用硝酸鹽的份額fb代入方程：
第十步驟，依據δ15na-t和δ15na求出組培苗同化銨鹽發生的穩定氮同位素分餾值δ15na，δ15na＝δ15na-δ15na-t；δ15na也即是待測植物同化銨鹽發生的穩定氮同位素分餾值。
實施例：諸葛菜同化銨鹽的無機氮同位素分餾值
培養材料：無性系諸葛菜組培苗
培養基配方為：ms+6-ba2.0mg/l+naa0.1mg/l，30g/l蔗糖，瓊脂：7.5g/l，ph值：5.8，培養室溫度：25±2℃。光周期：12h/d，光照強度：50μmol·m-2·s-1，兩種硝酸鹽的穩定氮同位素值分別為：δ15n01＝8.08‰，δ15n02＝22.67‰。銨鹽的穩定氮同位素值為：δ15na＝-2.64‰。分別用δ15n01和δ15n02的硝酸鹽配置濃度為10mm、20mm和40mm的培養基，諸葛菜組培苗在上述培養基中培養5周后，分別測定其葉片的穩定氮同位素值。由于諸葛菜組培苗在用δ15n01的硝酸鹽配置濃度為10mm、20mm和40mm的培養基培養下的葉片穩定氮同位素值差異不顯著，且在用δ15n02的硝酸鹽配置濃度為10mm、20mm和40mm的培養基培養下的葉片穩定氮同位素值也差異不顯著。因此，在穩定氮同位素值為δ15n01的硝酸鹽培養下的諸葛菜組培苗葉片穩定氮同位素值δ15n1即假定為在硝酸鹽濃度為10mm、20mm和40mm培養下的諸葛菜組培苗葉片的穩定氮同位素值的平均值，即δ15n1＝5.71‰(n＝9)，同理得δ15n2＝17.02‰(n＝9)。
實驗1無機氮濃度梯度(硝酸鹽濃度是銨鹽濃度的2倍)下諸葛菜組培苗的硝酸鹽和銨鹽利用份額
實施效果如下：
按照本發明的方法，將銨鹽分別與穩定氮同位素值為δ15n01和δ15n02的硝酸鹽組成混合氮源，配置混合氮源的濃度梯度為低氮、中氮、對照和高氮的培養基。將無性系諸葛菜組培苗分別培養在上述四種無機氮濃度梯度下，經過5周培養后，諸葛菜組培苗在穩定氮同位素值為δ15n01的硝酸鹽與銨鹽組成混合氮源培養下的葉片穩定氮同位素值δ15nn1mix和在穩定氮同位素值為δ15n02的硝酸鹽與銨鹽組成混合氮源培養下的葉片穩定氮同位素值δ15nn2mix如表1所示：
表1無機氮濃度梯度下諸葛菜組培苗葉片穩定氮同位素值
注：n＝3。
從表1可以看出，在銨鹽分別與兩種穩定氮同位素值不同的硝酸鹽組成的混合氮源濃度梯度下，諸葛菜組培苗葉片的穩定氮同位素值δ15nn1mix和δ15nn2mix均隨著混合氮源濃度的增加而逐漸降低，但在高氮濃度梯度下出現回升。根據表1的δ15nn1mix和δ15nn2mix，結合δ15n1和δ15n2，利用方程
表2無機氮濃度梯度下諸葛菜組培苗的硝酸鹽利用份額(fb)，銨鹽利用份額(fa＝1-fb)和δ15na-t
注：n＝3。
從表2可以看出，隨著混合氮源濃度的增加，諸葛菜組培苗利用硝酸鹽的份額逐漸降低，但在高氮時硝酸鹽的利用份額呈現回升趨勢，而銨鹽的利用份額隨著混合氮濃度的增加不斷增大，在高氮時銨鹽的利用份額出現下降趨勢。諸葛菜組培苗同化銨鹽發生氮同位素分餾后的穩定氮同位素值在中氮處理下最大。
此外，知道諸葛菜組培苗在混合氮源培養下同化銨鹽發生氮同位素分餾后的穩定氮同位素值，我們就可以確定諸葛菜組培苗同化銨鹽發生的穩定氮同位素分餾值，通過方程δ15na＝δ15na-δ15na-t即可求得諸葛菜組培苗同化銨鹽發生的氮同位素分餾值(δ15na)，計算結果如表3所示：
表3無機氮濃度梯度下諸葛菜組培苗同化銨鹽發生的穩定氮同位素分餾值δ15na
注：n＝3。
從表3可知，諸葛菜組培苗在低氮和高氮兩個處理下同化銨鹽發生的氮同位素分餾值較大，而在中氮處理下同化銨鹽發生的氮同位素分餾值最小。通常情況下，植物的氮同化能力越強，發生的穩定氮同位素分餾值就越小。因此，在中氮處理下，諸葛菜組培苗同化銨鹽的能力最強。
實驗2銨鹽濃度恒定，硝酸鹽濃度處理下諸葛菜組培苗的硝酸鹽和銨鹽利用份額
實施效果如下：
按照本發明的方法，將銨鹽分別與穩定氮同位素值為δ15n01和δ15n02的硝酸鹽組成混合氮源，在配置培養基時，保證培養基的銨鹽濃度都為20mm，然后設置硝酸鹽的濃度分別為5mm、10mm、20mm和40mm。這樣培養基的氮濃度就分別是25mm、30mm、40mm和60mm。將無性系諸葛菜組培苗分別培養在上述四種混合氮源濃度梯度下，經過5周培養后，分別測定在δ15n01的硝酸鹽與銨鹽組成混合氮源培養下的諸葛菜組培苗葉片穩定氮同位素值δ15nn1mix和在穩定氮同位素值為δ15n02的硝酸鹽與銨鹽組成混合氮源培養下的諸葛菜組培苗葉片穩定氮同位素值δ15nn2mix。測定結果如表4所示：
表4硝酸鹽處理下諸葛菜組培苗葉片的穩定氮同位素值
注：培養基中的銨鹽都為20mm。n＝3。
從表4可知，在培養基中銨鹽濃度都為20mm的情況下，增加硝酸鹽的濃度，諸葛菜組培苗分別在銨鹽與兩種穩定氮同位素值差距較大的硝酸鹽組成混合氮源培養下的葉片的穩定氮同位素值都在逐漸偏正，且都在最高硝酸鹽濃度下有最大穩定氮同位素值。根據表4的δ15nn1mix和δ15nn2mix，結合δ15n1和δ15n2，利用方程
表5硝酸鹽處理下諸葛菜組培苗的硝酸鹽利用份額(fb)，銨鹽利用份額(fa＝1-fb)和δ15na-t
注：培養基中的銨鹽都為20mm。n＝3。
從表5可以看出，在培養基中銨鹽濃度都為20mm的情況下，硝酸鹽的濃度從5mm增加10mm時諸葛菜組培苗硝酸鹽的利用份額出現一個較大的增長，但后續繼續增加硝酸鹽的濃度并沒有提升諸葛菜組培苗的硝酸鹽利用份額。而在各處理下諸葛菜組培苗的銨鹽利用份額均較高，銨鹽的利用份額最小值都為0.68。而諸葛菜組培苗同化銨鹽發生氮同位素分餾后的穩定氮同位素值則隨著硝酸鹽濃度的增加而逐漸增大。
此外，知道諸葛菜組培苗在混合氮源下同化銨鹽發生氮同位素分餾后的穩定氮同位素值，我們就可以確定諸葛菜組培苗同化銨鹽發生的穩定氮同位素分餾值，通過方程δ15na＝δ15na-δ15na-t即可求得諸葛菜組培苗同化銨鹽發生的氮同位素分餾值(δ15na)，計算結果如表6所示：
表6硝酸鹽處理下諸葛菜組培苗同化銨鹽發生的穩定氮同位素分餾值δ15na
注：培養基中的銨鹽都為20mm。n＝3。
從表6可知，諸葛菜組培苗同化銨鹽發生的穩定氮同位素分餾值隨著硝酸鹽濃度的增加而逐漸減少。通常情況下，植物的氮同化能力越強，發生的穩定氮同位素分餾值就越小。因此，在最高硝酸鹽濃度下，諸葛菜組培苗同化銨鹽的能力最強。
實驗3硝酸鹽濃度恒定，銨鹽濃度處理下諸葛菜組培苗的硝酸鹽和銨鹽利用份額
實施效果如下：
按照本發明的方法，將銨鹽分別與穩定氮同位素值為δ15n01和δ15n02的硝酸鹽組成混合氮源，在配置培養基時，保證培養基的硝酸鹽濃度都為20mm，然后設置銨鹽的濃度分別為0.5mm、1mm、2.5mm、5mm、10mm和40mm。這樣培養基的氮濃度就分別是20.5mm、21mm、22.5mm、25mm、30mm和60mm。將無性系諸葛菜組培苗分別培養在上述六種混合氮源濃度梯度下，經過5周培養后，分別測定諸葛菜組培苗在δ15n01的硝酸鹽與銨鹽組成混合氮源培養下的葉片穩定氮同位素值δ15nn1mix和在穩定氮同位素值為δ15n02的硝酸鹽與銨鹽組成混合氮源培養下葉片穩定氮同位素值δ15nn2mix。測定結果如表7所示：
表7銨鹽處理下諸葛菜組培苗葉片的穩定氮同位素值
注：培養基中的硝酸鹽都為20mm。n＝3。
從表7可知，在培養基中硝酸鹽濃度都為20mm的情況下，增加銨鹽的濃度，諸葛菜組培苗分別在銨鹽與兩種穩定氮同位素值差距較大的硝酸鹽組成混合氮源培養下的葉片穩定氮同位素值都在逐漸減小，且都在最高銨鹽濃度下有最小的穩定氮同位素值。由于培養基中硝酸鹽的濃度都為20mm，而諸葛菜組培苗在20mm穩定氮同位素值為δ15n01的硝酸鹽培養下的葉片穩定氮同位素值δ15n1＝5.81‰(n＝3)；在20mm穩定氮同位素值為δ15n02的硝酸鹽培養下的葉片穩定氮同位素值δ15n2＝17.19‰(n＝3)。因此，根據表7的δ15nn1mix和δ15nn2mix，利用方程
表8銨鹽處理下諸葛菜組培苗的硝酸鹽利用份額(fb)，銨鹽利用份額(fa＝1-fb)和δ15na-t
注：培養基中的硝酸鹽都為20mm。n＝3。
從表8可知，在培養基硝酸鹽濃度都為20mm的情況下，增加銨鹽的濃度使得諸葛菜組培苗銨鹽的利用份額逐漸增大，而硝酸鹽的利用份額則逐漸降低。銨鹽的濃度從2.5mm增加到5mm時，諸葛菜組培苗的銨鹽利用份額出現非常明顯的增幅。而諸葛菜組培苗同化銨鹽發生氮同位素分餾后的穩定氮同位素值在最低和最高銨鹽濃度下較小，其它銨鹽濃度下變化不大。
此外，知道諸葛菜組培苗在混合氮源培養下同化銨鹽發生氮同位素分餾后的穩定氮同位素值，我們就可以確定諸葛菜組培苗同化銨鹽發生的穩定氮同位素分餾值，通過方程δ15na＝δ15na-δ15na-t即可求得諸葛菜組培苗同化銨鹽發生的氮同位素分餾值(δ15na)，計算結果如表9所示：
表9硝酸鹽處理下諸葛菜組培苗同化銨鹽發生的穩定氮同位素分餾值δ15na
注：培養基中的硝酸鹽都為20mm。n＝3。
從表9可知，諸葛菜組培苗同化銨鹽發生的穩定氮同位素分餾值在最低和最高銨鹽濃度下較大，而在10mm銨鹽時，諸葛菜組培苗同化銨鹽發生的穩定氮同位素值分餾值最小。通常情況下，植物的氮同化能力越強，發生的穩定氮同位素分餾值就越小。因此，在10mm銨鹽時，諸葛菜組培苗的銨鹽同化能力是最強的。
綜上所述，在進行培養基氮源優化時，既要考慮組培苗銨鹽的利用份額，同時也要考慮組培苗銨鹽的同化能力。比較3個實驗，我們發現在無機氮濃度處理下，中氮處理條件下的銨鹽利用份額和銨鹽同化能力都較高；而在銨鹽濃度恒定，增加硝酸鹽濃度的處理下，諸葛菜組培苗在20mm銨鹽和40mm硝酸鹽處理下有較好的銨鹽利用份額和銨鹽同化能力；而在硝酸鹽濃度恒定下，增加銨鹽濃度的處理下，諸葛菜組培苗在20mm硝酸鹽和10mm銨鹽處理下有較好的銨鹽利用份額和銨鹽同化能力。因此，在進行植物的有效氮管理時，銨鹽的使用濃度和利用份額的關系以及植物同化銨鹽的無機氮同位素分餾值應重點考慮。