檢測鴨坦布蘇病毒的側向流免疫層析測定產品及相關試劑與制備方法與流程

本發明涉及生物技術領域中，檢測鴨坦布蘇病毒的側向流免疫層析測定產品及相關試劑與制備方法。

背景技術：

鴨坦布蘇病毒病是黃病毒科黃病毒屬鴨坦布蘇病毒(ducktembusvirus，dtmuv)引起的以鴨死亡和蛋鴨產蛋下降為特征的新發傳染病。自2010年4月以來，在我國河北、江蘇、安徽、浙江、福建等地區產蛋鴨和種鴨群中先后出現了鴨坦布蘇病毒病，鴨群患病后4～5d左右產蛋率可從80～85迅速下降至20～30，甚至停產，發病率達60～100％，該病在中國大部分省份均有發生和流行，給養鴨業造成了嚴重的經濟損失。加強對該病檢測方法的研究，對控制鴨坦布蘇病毒病的發生，保護和促進養鴨業的健康發展，具有重要意義。

目前，dtmu的檢測主要依賴病毒分離和分子生物學檢測。病毒分離是dtmuv的傳統檢測方法，主要從病鴨的卵泡膜、腦、脾臟、肝臟等病變組織分離病毒。鴨坦布蘇病毒的快速檢測主要使用pcr方法。顏丕熙等成功建立了鴨坦布蘇病毒套式rt-pcr檢測方法；yan等根據鴨坦布蘇病毒e基因序列設計特異性引物和taqman探針，建立了快速檢測鴨坦布蘇病毒實時熒光定量rt-pcr方法；張帥等在對鴨坦布蘇病毒序列比對分析的基礎上，建立了該病毒一步式rt-pcr檢測方法；姬希文等以純化的毒株作為包被抗原，建立了檢測鴨坦布蘇病毒血清抗體的間接elisa法；郝明飛等對鴨坦布蘇病毒e基因進行了克隆表達并初步建立了快速檢測鴨坦布蘇病毒的間接elisa法。高緒慧等建立了探針檢測鴨黃病毒的地高辛標記dna的方法。這些方法過程繁多，操作復雜，檢測時間長，成本高，而且還需要專業的設備和技術人員，不適合田間樣品的檢測。目前急需一種可特異、簡便、快速檢測dtmuv的方法。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是如何檢測鴨坦布蘇病毒。

為解決上述技術問題，本發明首先提供了鴨坦布蘇病毒的免疫檢測產品，包括相互連接的樣品墊、吸收墊和具有相互分離的檢測線和質控線的包被膜，所述包被膜位于所述樣品墊和所述吸收墊之間，其特征在于：所述樣品墊上負載有熒光納米晶標記單抗，所述檢測線包被有鴨坦布蘇病毒抗體，所述質檢線包被有與所述熒光納米晶標記單抗特異結合的第二抗體；

所述熒光納米晶標記單抗為將雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體(將該單克隆抗體命名為a單抗)和氨基修飾的熒光納米晶顆粒以肽鍵共價結合形成的聚合體；

所述雜交瘤細胞在中國典型培養物保藏中心的保藏編號為cctccno：c201712。所述雜交瘤細胞是將小鼠脾細胞與nso細胞融合得到的細胞；所述小鼠脾細胞為以序列2所示的蛋白質(其名稱為蛋白質a)免疫小鼠得到的可分泌抗蛋白質a抗體的脾細胞。

所述a單抗可特異識別序列2或序列2的第21-136位所示的蛋白質與鴨坦布蘇病毒。

上述產品中，所述包被膜可為具有相互分離的所示檢測線和所述質控線的硝酸纖維素膜。

上述產品中，所述樣品墊和所述包被膜間還可含有連接墊；所述連接墊負載有熒光納米晶標記單抗。

上述產品中，所述熒光納米晶標記單抗可按照包括如下步驟的方法制備：將所述氨基修飾的熒光納米晶顆粒與所述單克隆抗體按照1：3的質量比進行反應得到以肽鍵共價結合形成的熒光納米晶顆粒與所述單克隆抗體的偶聯物。

所述氨基修飾的熒光納米晶顆粒為利用氨基硅烷修飾熒光納米晶顆粒得到的產物。

所述熒光納米晶顆粒具體可由bhhct與eucl3·6h2o制備得到。

上述產品中，所述鴨坦布蘇病毒抗體可為以序列2或序列2的第21-136位所示的蛋白質為抗原免疫動物得到的多克隆抗體或單克隆抗體。

上述產品中，所述動物可為家兔。

上述產品中，所述與所述熒光納米晶標記單抗特異結合的第二抗體可為羊抗鼠igg。

為解決上述技術問題，本發明還提供了所述雜交瘤細胞。

為解決上述技術問題，本發明還提供了所述a單抗。

為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測或輔助檢測鴨坦布蘇病毒的方法，該方法包括：

將待測樣品加至所述產品的樣品墊上，孵育5-30分鐘后根據紫外線下所述產品的檢測線是否發光確定待測樣品是否含有鴨坦布蘇病毒：如所述檢測線發紅光，待測樣品含有或候選含有鴨坦布蘇病毒；如所述檢測線不發紅光，待測樣品不含或候選不含鴨坦布蘇病毒。

上述方法中，所述孵育時間可為10-20分鐘。

為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測或輔助檢測鴨坦布蘇病毒的成套試劑，該成套試劑由所述雜交瘤細胞或所述a單抗與所述鴨坦布蘇病毒抗體組成。

為解決上述技術問題，本發明還提供了下述任一應用：

x1、所述雜交瘤細胞在制備檢測或輔助檢測鴨坦布蘇病毒產品中的應用；

x2、所述a單抗在制備檢測或輔助檢測鴨坦布蘇病毒產品中的應用；

x3、所述產品在制備檢測或輔助檢測鴨坦布蘇病毒產品中的應用；

x4、所述成套試劑在制備檢測或輔助檢測鴨坦布蘇病毒產品中的應用；

x5、所述雜交瘤細胞在檢測或輔助檢測鴨坦布蘇病毒中的應用；

x6、所述a單抗在檢測或輔助檢測鴨坦布蘇病毒中的應用；

x7、所述產品在檢測或輔助檢測鴨坦布蘇病毒中的應用；

x8、所述成套試劑在檢測或輔助檢測鴨坦布蘇病毒中的應用；

x9、所述雜交瘤細胞在制備單克隆抗體中的應用；

x10、序列2或序列2的第21-136位所示的蛋白質在制備檢測或輔助檢測鴨坦布蘇病毒產品中的應用。

本發明研制了一種特異、簡便、快速、直觀的鴨坦布蘇病毒的免疫檢測產品(檢測dtmuv的熒光納米晶試紙條)，實驗證明，本發明的鴨坦布蘇病毒的免疫檢測產品可以特異識別dtmuv，檢測鴨坦布蘇病毒的靈敏度為0.1ng/ml鴨坦布蘇病毒蛋白，重復性好，可在4℃下可以保存6個月；具有高特異性、高敏感性和高準確性，特異性達99.47％，敏感性達92.86％，準確性達98.60％。本發明的鴨坦布蘇病毒的免疫檢測產品可以檢測dtmuv抗原，檢測時間需要10-20分鐘，在紫外線下可以直接確定結果，為有效監控dtmuv的發病提供了有力的工具，并可以用于臨床診斷。

生物材料保藏說明

生物材料的分類命名：雜交瘤細胞株

生物材料的菌株編號：dtmuv-e-10a7

生物材料的保藏單位名稱：中國典型培養物保藏中心(cctcc)

生物材料的保藏單位簡稱：cctcc

生物材料的保藏單位地址：湖北省武漢市武昌區八一路299號，武漢大學保藏中心郵編：430072

生物材料的保藏日期：2017年2月24日

生物材料的保藏中心登記入冊編號：cctccno：c201712

附圖說明

圖1為純化前后蛋白質a的檢測結果。

圖2為a單抗的sds-page電泳檢測結果。

圖3為在不同抗體濃度下的質檢線與檢測線發生目的反應后在紫外下的亮度。其中質控線為質檢線；1為羊抗鼠igg抗體的濃度為0.8mg/ml，2為羊抗鼠igg抗體的濃度為1mg/ml；3為a單抗的濃度為0.8mg/ml，4為a單抗的濃度為1mg/ml。

圖4為熒光納米晶試紙條的結構。

圖5為熒光納米晶試紙條a的特異性檢測結果。其中，1為陰性血清，2為pbs，3為dtmuv，4為dpv，5為dhv，6為ndv，7為aiv，8為ibv，9為arv，10為edsv。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

下述實施例中的鴨坦布蘇病毒(ducktembusvirus，dtmuv)為dtmuvfx2010分離株(姬希文,閆麗萍,顏丕熙,李國新,張七斤,李澤君.鴨坦布蘇病毒抗體間接elisa檢測方法的建立[j].中國預防獸醫學報,2011,08:630-634.)公眾可從申請人處獲得，該生物材料只為重復本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的鴨瘟病毒(dpv)(齊雪峰,程安春,汪銘書,楊曉燕,賈仁勇,陳孝躍.鴨瘟病毒抗體間接elisa檢測試劑盒的研制[j].中國獸醫科學,2007,08:690-694.)、鴨病毒性肝炎病毒(dhv)(馬秀麗,宋敏訓,于可響,廖明,辛朝安.鴨病毒性肝炎病毒vp1基因表達及其抗體檢測elisa方法的建立[j].微生物學報,2008,08:1110-1114.)、番鴨源禽ⅰ型副粘病毒(ndv)(傅光華,程龍飛,施少華,彭春香,黃瑜.番鴨源禽1型副粘病毒px2/03株p基因的克隆及原核表達[j].福建農林大學學報(自然科學版),2007,06:599-603.)、禽流感病毒(aiv)(譚偉,徐倩,謝芝勛.禽流感病毒研究概述[j].基因組學與應用生物學,2014,01:194-199.)、禽傳染性支氣管炎病毒(ibv)(周生,王紅寧,唐夢君,黃勇,柳萍.禽傳染性支氣管炎病毒saibk株全基因組的分段克隆、測序及分析[j].畜牧獸醫學報,2007,01:72-77.)、番鴨呼腸孤病毒(arv)(祁保民,陳曉燕,吳寶成,姚金水,張紅雷.番鴨呼腸孤病毒誘導的細胞凋亡觀察[j].畜牧獸醫學報,2010,04:495-499.)、減蛋綜合癥病毒(edsv)(陳滔.重組減蛋綜合癥病毒knob-s蛋白免疫原性及雞il-2和il-18對其實、免疫增強效應研究[d].湖南農業大學,2012)，公眾均可從申請人處獲得，該生物材料只為重復本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的pet-28a(+)為novagen公司的產品，產品目錄號為69865-3。

下述實施例中的非變性鎳柱結合緩沖液ⅰ由溶劑和溶質組成，溶劑為水，溶質及其濃度分別為：0.1mtris–hcl、0.1mnacl、0.01m咪唑(imidazole)、0.5mmedta，ph為8.0。

下述實施例中的非變性鎳柱洗脫緩沖液ⅱ的制備方法由溶劑和溶質組成，溶劑為水，溶質及其濃度分別為：0.1mtris-hcl、0.1mnacl、0.5m咪唑(imidazole)、0.5mmedta，ph為8.0。

下述實施例中的balb/c小鼠為南方醫科大學廣東省醫學實驗動物中心產品。

下述實施例中的家兔為濟南朋悅實驗動物繁育有限公司產品。

實施例1、抗體的制備

一、作為抗原的融合蛋白的制備

1、重組載體的獲得

將pet-28a(+)載體的ndei和hindiii識別序列間的dna片段替換為序列1的所示的來源于鴨坦布蘇病毒(ducktembusvirus，dtmuv)的dna分子，保持pet-28a(+)載體的其他序列不變，得到重組載體，將該重組載體命名為pet-a，pet-a能表達序列2所示的融合蛋白質，將該融合蛋白質命名為蛋白質a。

其中，序列1所示的dna分子編碼序列2所示的蛋白質，序列1的第61-408位編碼序列2的第21-136位所示的蛋白質，序列1的第1-60位為pet-28a(+)載體上的dna序列，序列1的第13-30位編碼序列2的第5-10位所示的his-tag。

表達對照蛋白的重組載體的獲得：

將pet-28a(+)載體的ndei和hindiii識別序列間的dna片段替換為序列3的所示的來源于鴨坦布蘇病毒(ducktembusvirus，dtmuv)的dna分子，保持pet-28a(+)載體的其他序列不變，得到重組載體，將該重組載體命名為pet-b，pet-b能表達序列4所示的融合蛋白質，將該融合蛋白質命名為蛋白質b。蛋白質b及與之相關的實驗在本申請中作為對照。

其中，序列3所示的dna分子編碼序列4所示的蛋白質。

2、重組菌的獲得

將步驟1的pet-a導入大腸桿菌bl21(de3)中，得到重組菌，將該重組菌命名為bl21-pet-a；將步驟1的pet-b導入大腸桿菌bl21(de3)中，得到重組菌，將該重組菌命名為bl21-pet-b；將pet-28a(+)載體導入大腸桿菌bl21(de3)中，得到重組菌，將該重組菌命名為bl21-pet。

3、融合蛋白的獲得

挑取步驟2的bl21-pet-a的單菌落接入含有卡那霉素培養基(卡那霉素培養基為向lb培養基中加入卡那霉素得到的卡那霉素濃度為50μg/ml的液體培養基)中，于37℃過夜培養，得到過夜培養物。將過夜培養物接種于1l卡那霉素培養基中，在37℃下劇烈振蕩(200rpm)發酵培養，得到發酵液，該發酵液的od600值在0.6-0.8左右；向發酵液中加入iptg，得到蛋白誘導前液，蛋白誘導前液中iptg的濃度為0.1mm；將蛋白誘導前液在20℃、80rpm的條件下過夜培養(共培養12小時)，得到蛋白誘導發酵液；將蛋白誘導發酵液在6000rpm下離心10分鐘，棄上清液，收集菌體；用非變性鎳柱結合緩沖液ⅰ重懸菌體后，得到菌體懸液；用超聲波破碎菌體懸液中的菌體后，12000rpm離心10min，收集上清液，該上清液即為含有蛋白質a的粗提液，超聲波破碎菌體的條件為：超聲5s，間歇5s，40w的功率，30個循環。

按照上述方法，將bl21-pet-a替換為bl21-pet-b，其他步驟均不變，得到含有蛋白質b的粗提液；按照上述方法，將bl21-pet-a替換為bl21-pet，其他步驟均不變，得到作為對照的蛋白粗提液。

4、融合蛋白的純化

采用鎳柱親和層析對步驟3的含有蛋白質a的粗提液進行純化，在amersham公司的aktafplc系統中用1ml裝量的hitrapchelatinghpcolumn(鎳柱)純化上清。非變性鎳柱結合緩沖液ⅰ用于平衡純化柱體和上樣。蛋白上樣量為10ml，流速設為1ml/min。用非變性鎳柱洗脫緩沖液a(非變性鎳柱洗脫緩沖液a由非變性鎳柱結合緩沖液ⅰ和非變性鎳柱洗脫緩沖液ⅱ的混合溶液組成，其中，非變性鎳柱洗脫緩沖液ⅱ占非變性鎳柱洗脫緩沖液a的體積百分比為25％)進行洗滌，去除非特異性結合的雜蛋白。用非變性鎳柱洗脫緩沖液b(非變性鎳柱洗脫緩沖液b由非變性鎳柱結合緩沖液ⅰ和非變性鎳柱洗脫緩沖液ⅱ的混合溶液組成，其中，非變性鎳柱洗脫緩沖液ⅱ占非變性鎳柱洗脫緩沖液b的體積百分比為80％)進行洗脫，收集含洗脫峰的洗脫液，該洗脫液中為純化后的蛋白溶液，將其命名為蛋白溶液1，用sds-page檢測蛋白溶液1中蛋白質a的純度。結果顯示(圖1)蛋白溶液a含有高純度的蛋白質a，大小為20kda左右。圖1中，a為sds-page結果，b為western-blot結果，一抗為histag抗體，泳道m為蛋白分子量標準，泳道1和3均為含有蛋白質a的粗提液，泳道2和4均為蛋白溶液1。

按照上述方法，將含有蛋白質a的粗提液替換為含有蛋白質b的粗提液，其他步驟均不變，得到含有蛋白質b的純化后的蛋白溶液，將其命名為蛋白溶液b，用sds-page檢測蛋白溶液b中蛋白質b的純度。結果顯示蛋白溶液b含有純的蛋白質b，大小為22kda左右。

二、多克隆抗體的制備

按劑量1mg蛋白質a/只，皮下分點注射免疫家兔，利用福氏不完全佐劑(fia)增強免疫效果，首免后每隔2周用同樣的方法進行加強免疫，共免疫6次，最后一次免疫后兩周，耳靜脈采血，分離血清，用蛋白質a包被的elisa板檢測抗體效價，取具有較高的抗體滴度家兔的頸動脈血，收集全血，分離得到兔抗血清。

用辛酸硫酸銨法粗提取兔抗血清igg，透析，再依次過sephadexg25和deae纖維素柱進一步提純，并將收集的蛋白質于透析袋中。置蔗糖或聚乙二醇中濃縮，得到抗蛋白質a的igg，將其命名為a多抗，用核酸蛋白檢測儀測定蛋白質含量，將其稀釋至10mg/ml，置于-80℃保存備用。利用蛋白質a檢測a多抗的抗體效價，檢測到a多抗的抗體效價為1:16。

按照上述方法，將蛋白質a替換為蛋白質b，其他步驟均不變，得到抗蛋白質b的igg，將其命名為b多抗，用核酸蛋白檢測儀測定蛋白質含量，將其稀釋至10mg/ml，置于-80℃保存備用。

三、單克隆抗體的制備

1、免疫：

選取8周齡balb/c小鼠10只，以步驟一的蛋白質a與fca作為免疫原，免疫劑量為200μg/只(100μg蛋白質a+100μlfca+0.1％tween80)，皮下分點注射。于首免后2-6周進行，免疫劑量為200μg/只(100μl蛋白質a+100μlfia+0.1％tween80)。共免疫3-4次，每次免疫間隔2周。最后1次免疫10天后，斷尾采血分離血清，用間接elisa法檢測血清抗體效價。

2、雜交瘤細胞的建立與陽性克隆的篩選：

選取elisa法檢測抗體效價(1:1000)較高的免疫小鼠，眶下竇采血，分離血清。脫頸致死小鼠；無菌手術取出脾臟制備脾細胞，并與ns0細胞在50％peg作用下進行細胞融合；將融合后的細胞懸液加到96孔細胞培養板上，用hat培養基進行選擇性培養。融合后的細胞置37℃，5％co2培養箱中培養；用間接elisa法以0.5μg/孔的蛋白質a的量包被酶標板進行陽性篩選。p/n大于2.1時即為陽性。對強陽性、細胞生長旺盛的孔進行3次有限稀釋克隆化，得到克隆化的陽性雜交瘤細胞株，將該雜交瘤細胞株命名為雜交瘤細胞株dtmuv-e-10a7，雜交瘤細胞株dtmuv-e-10a7已于2017年2月24日保藏于中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏中心登記入冊編號：cctccno：c201712。

3、單抗的大量制備：

采用腹水法大量制備單克隆抗體。將步驟2的雜交瘤細胞株dtmuv-e-10a7擴大培養，待細胞濃度達5×10⁵個/ml時停止換液，直至細胞全部死亡，收集培養液，測定其elisa效價；8周齡balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟10天后再腹腔注射雜交瘤細胞株e92，每只小鼠腹腔注射10⁷個雜交瘤細胞株dtmuv-e-10a7，7天后抽取腹水，用dtmuv病毒懸液包被酶標板測其elisa效價。

4、單抗的純化：

采用辛酸—硫酸銨法進行單抗的純化。(1)將20ml步驟3得到的腹水加入離心管中，于4℃12000rpm下離心15min，將上清液轉移至另一容器中；(2)向上清液中加入4倍血清體積的0.06mph4.8的醋酸緩沖液，室溫邊加邊攪拌，得到混合液體；(3)向步驟(2)得到的混合液體中加入適量的辛酸(每毫升混合液體中加入33μl辛酸)，滴加時要緩慢，室溫滴加，邊滴加邊攪拌；(4)辛酸滴加完后，室溫攪拌30min；(5)于4℃離心，12000rpm×30min，取上清，用濾紙過濾，得到濾液；(6)向濾液中加入硫酸銨至45％飽和度(sas)，室溫攪拌30min，4℃靜置2h或過夜；(7)于4℃離心12000rpm下離心30min，棄上清，沉淀用適量0.01mol/lph7.4pbs重懸，用0.01mol/lph7.4pbs于4℃透析24h，其間換液4次；(8)將透析物于4℃、12000rpm下離心30min，收集上清液分裝于ep管中，該上清液即為含有純化后的抗蛋白質a的單克隆抗體(即a單抗)的液體，將該液體命名為a單抗溶液，用核酸蛋白測定檢測儀測定a單抗溶液中的a單抗含量，稀釋至10mg/ml，置于-20℃保存。

用elisa的方法檢測a單抗溶液中a單抗的效價，a單抗的效價為1:51200。

將步驟3得到的未純化的腹水和a單抗溶液進行sds-page電泳分析(圖2)。未純化腹水上清泳道出現多條雜帶(泳道1)，而純化后的單克隆抗體(a單抗溶液)僅在53ku和22ku出現igg輕鏈和重鏈的條帶，無雜帶出現(泳道2)，表明純化效果良好。

5、單克隆抗體特異性檢測：

用a單抗分別與鴨瘟病毒(dpv)、鴨病毒性肝炎病毒(dhv)、番鴨源禽ⅰ型副粘病毒(ndv)、禽流感病毒(aiv)、禽傳染性支氣管炎病毒(ibv)、番鴨呼腸孤病毒(arv)、減蛋綜合癥病毒(edsv)和鴨坦布蘇病毒(dtmuv)以及陰性血清(未感染dtmuv的鴨的血清)與蛋白質a包被的elisa板反應，鑒定a單抗的特異性。具體方法如下：

將病毒抗原稀釋成濃度為5μg/ml的工作抗原、蛋白質a稀釋成濃度為5μg/ml的工作抗原，取100μl工作抗原加入酶免板的各個孔中，每種抗原9個孔，加入包被液(ph9.6，15mmna2co3，35mmnahco3，0.2mnacl)，放置于4℃冷藏箱過夜；將包被好抗原酶免板棄去孔內液體，同時用pbs緩沖液洗3次，每次每孔300μl，最后一次拍干酶免板；按100μl/孔加入封閉液，37℃放置1h；pbs緩沖液洗3次；按100μl/孔加入a單抗，同時設立陽性對照(dtmuv陽性血清，感染dtmuv的鴨子的血清)、陰性對照(dtmuv陰性血清，未感染dtmuv的鴨子的血清)和空白對照(不加a單抗)，每種抗原的陽性對照、陰性對照和空白對照均3個孔；37℃放置1h；用pbs緩沖液洗3次，每次每孔300μl，拍干；按100μl/孔加入酶標二抗(二抗為羊抗鼠igg抗體)，37℃放置1h，用pbs緩沖液洗3次，每次每孔300μl，拍干；按100μl/孔加入tmb，37℃閉光孵育20min；按100μl/孔加入稀硫酸，終止反應，在10min，將酶免板放置于在酶標儀上記錄od值；結果判定：以od陽性對照/od陰性對照≧2.1為陽性。若陰性對照孔透明或接近透明，陽性對照孔顯呈黃色或藍色，則可直接判定檢測結果。

結果顯示，a單抗可特異識別蛋白質a，a單抗與相應病毒抗原包被elisa板反應時呈強陽性，與其它病毒包被elisa板反應時均為陰性(表1)。表明a單抗可以特異識別dtmuv。

表1、單克隆抗體特異性試驗

注：表1中，“-”表示陰性，“+”表示陽性。

實施例2、熒光納米晶試紙條的制備

一、熒光納米晶顆粒的制備及表面修飾

1、熒光納米晶顆粒制備

將1.1ml的去離子水加入100ml的潔凈圓底燒瓶中，然后再分別加入4.74g的tritonx-100、3.64g的正辛醇以及14.50g環己烷，制成w/o型微乳液，向其中加入6.15mgbhhct(abcam，貨號：ab145314)和1.37mgeucl3·6h2o(上海永葉生物科技有限公司，貨號：s42353)；攪拌0.5h后，加入200μl的teos(sigma公司，貨號：x-020)和200μl12mol/l的濃氨水；室溫攪拌反應24小時后，加入約40ml丙酮結束反應，離心棄上清液。沉淀部分分別用乙醇和超純水將沉淀洗3次后，于真空干燥箱中干燥2h，得到熒光納米晶顆粒。

2、熒光納米晶顆粒的表面修飾

(1)將氨基硅烷溶于無水乙醇中得到氨基硅烷的質量百分比濃度為5％的氨基硅烷溶液；

(2)將步驟1的熒光納米晶顆粒于150℃加熱4h干燥；然后用1mol/l四水乙酸鎳洗滌幾次，離心去上清液，得到清洗后的熒光納米晶顆粒；

(3)在通風櫥內，將步驟(1)的氨基硅烷溶液和步驟(2)的清洗后的熒光納米晶顆粒加熱回流12-24h，溫度為120℃；冷卻，用1mol/l四水乙酸鎳洗滌產物，棄上清液，得到氨基化顆粒；

(4)將戊二酸酐溶于二甲基甲酰胺(dmf)中，直至接近飽和，加入三乙胺，得到溶液甲，溶液甲中戊二酸酐的濃度為1g/ml，三乙胺的濃度為1mg/ml；將步驟(3)所得氨基化顆粒懸浮于溶液甲中，攪拌2-4h；用dmf洗滌氨基化表面，然后用去離子水洗滌干凈，得到表面修飾后的熒光納米晶顆粒，用去離子水重懸表面修飾后的熒光納米晶顆粒，得到表面修飾后的熒光納米晶顆粒(即氨基修飾的熒光納米晶顆粒)濃度為1mg/ml的熒光納米晶顆粒液體，備用。

二、熒光納米晶顆粒標記單克隆抗體

取步驟一的熒光納米晶顆粒液體50μl，用50mmmes緩沖液(ph6.0)洗滌2次，1ml/次；用600μl50mmmes緩沖液(ph6.0)重懸熒光納米晶顆粒，得到顆粒懸浮液，將其命名為顆粒懸浮液1；向該顆粒懸浮液1中加入sulfo-nhs和edc，得到反應液1，反應液1中sulfo-nhs的濃度為20mg/ml，edc的濃度為20mg/ml，將反應液1室溫搖動反應30min；離心，棄上清液；用1ml50mm緩沖液mes(ph6.0)洗滌顆粒一次；用1ml50mm緩沖液mes(ph6.0)重懸顆粒，得到顆粒懸浮液，將其命名為顆粒懸浮液2；向顆粒懸浮液2中加入50μg實施例1的a單抗，室溫振搖反應1h，得到反應液2；向反應液2中加入與反應液2等體積的pbs-bsa溶液(pbs-bsa溶液為向pbs中加入bsa得到的bsa質量百分比濃度為2％的液體，ph7.4)，繼續反應1h，得到反應液3；將反應液3離心，檢測上清液中抗體的濃度。

按照上述方法，將向顆粒懸浮液2中加入實施例1的a單抗的量分別設為50μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg對熒光納米晶顆粒進行標記，用bca蛋白檢測試劑盒檢測標記后的上清液中抗體的濃度。取上清液中的抗體的濃度剛好升高的前一個濃度為最佳抗體用量，最終確定與50μl1mg/ml熒光納米晶顆粒共價偶聯的最佳a單抗的量為150μg。

將150μga單抗與50μl1mg/ml熒光納米晶顆粒共價偶聯得到的反應液3進行離心，棄上清液；用50mmmes緩沖液(ph6.0)洗滌顆粒3次，1ml/次，棄上清液，得到熒光納米晶顆粒標記的a單抗；用300μl重懸液(重懸液為向10mmtris-hcl(ph8.0)中加入蔗糖得到的蔗糖的質量百分比濃度為10％的液體)重懸熒光納米晶顆粒標記的a單抗，得到熒光納米晶顆粒標記a單抗懸浮液，4℃保存備用。

三、熒光納米晶試紙條的制備

1、熒光納米晶試紙條中硝酸纖維素膜的制備

以a多抗作為硝酸纖維素膜上的檢測線包被抗體，以羊抗鼠igg(abcam公司，ab6789)作為硝酸纖維素膜上的質控線包被抗體，具體方法如下：

采用0.02mpbs(ph＝7.4)緩沖液，將羊抗鼠igg抗體和a多抗的濃度均配制為濃度1mg/ml，利用bio-dotxyz3050噴膜系統將羊抗鼠igg抗體噴至硝酸纖維素膜(nc膜)的質檢線(c線)位置，將a多抗噴至檢測線(testline，t線)位置，噴樣速度為1.0μl/cm，然后于相對濕度為10％以下的干燥條件下進行抽濕4小時后，得到噴有抗體的硝酸纖維素膜，干燥密封保存待用。

在噴制質檢線時，采用用0.02mpbs(ph＝7.4)緩沖液將羊抗鼠igg抗體配制為不同濃度的羊抗鼠igg抗體溶液(不同羊抗鼠igg抗體溶液中羊抗鼠igg抗體的濃度分別為0.5mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、1.2mg/ml、1.5mg/ml)噴至nc膜的c線處，并在相對濕度為10％以下的干燥條件下進行抽濕4小時后，用步驟二的抗體標記顆粒懸浮液進行檢測，在紫外線下觀察，結果發現，隨著羊抗鼠igg濃度的增加，質檢線的亮度也逐漸增加，在達到1mg/ml后亮度不再明顯增加，因此確定質檢線的最佳包被條件為1mg/ml的羊抗鼠igg。

在噴制檢測線時，采用用0.02mpbs(ph＝7.4)緩沖液將a多抗配制為不同濃度的a多抗溶液(不同a多抗溶液中a多抗的濃度分別為0.5mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、1.2mg/ml、1.5mg/ml)噴至nc膜的c線處，并在相對濕度為10％以下的干燥條件下進行抽濕4小時后，用步驟二的抗體標記顆粒懸浮液與蛋白質a反應后得到的顆粒進行檢測，在紫外線下觀察，結果發現，隨著a多抗濃度的增加，檢測線的亮度也逐漸增加，在達到1mg/ml后亮度不再明顯增加，因此確定檢測線的最佳包被條件為1mg/ml的a多抗。如圖3所示。

2、熒光納米晶試紙條中樣品墊的制備

用膜處理緩沖液(膜處理緩沖液為向0.02mpbs(ph＝7.4)中加入tritonx-100、bsa和蔗糖得到的tritonx-100、bsa和蔗糖的質量百分比濃度分別為2％、1％和1％的溶液)處理玻璃纖維樣品墊，抽濕4小時待用；用上述膜處理緩沖液按1:100稀釋步驟二的熒光納米晶顆粒標記a單抗懸浮液，得到稀釋的熒光納米晶顆粒標記a單抗懸浮液，采用bio-dotxyz3050噴膜系統將稀釋的熒光納米晶顆粒標記a單抗懸浮液噴涂至上述處理過的樣品墊上，噴有熒光納米晶顆粒標記a單抗的樣品墊，抽濕干燥備用。

3、連接墊的制備

用膜處理緩沖液處理硝酸纖維素膜連接墊，抽濕4小時待用；采用bio-dotxyz3050噴膜系統將步驟2的稀釋的熒光納米晶顆粒標記a單抗懸浮液噴涂至上述處理過的連接墊上，噴有熒光納米晶顆粒標記a單抗的連接墊，抽濕干燥備用。

4、熒光納米晶試紙條的組裝

按照圖4進行組裝：

制備好的連接墊與樣品墊重疊連接。將噴有檢測線和質檢線硝酸纖維素膜粘貼于襯板上，將吸水墊、連接墊重疊的樣品墊分別粘帖于硝酸纖維素膜的兩端，均與nc膜重合疊壓3mm，試紙條裝配模式同膠體金試紙條，進而采用bio-dotgm4500切條機將其裁成5mm寬的條狀，4℃密封干燥保存備用。

熒光納米晶試紙條a的預期反應結果：

當待檢液體樣品沿著試紙條通過毛細作用向上泳動時，如果被檢樣品中含有dtmuv時，dtmuv的抗原首先與熒光納米晶顆粒上的a單抗結合形成復合物，該復合物繼續流動，與被固定在檢測線上的a多抗結合捕獲，從而在檢測線上富集，在紫外線照射激發下發出紅光，沒有被捕獲的結合有a單抗的熒光納米晶顆粒繼續向前流動，與固定在質檢線上的羊抗鼠igg免疫球蛋白結合，并在質檢線上富集，在紫外線照射激發下發出紅光；如果被檢樣品中不含dtmuv時，結合有a單抗的熒光納米晶顆粒與固定在質檢線上的羊抗鼠igg免疫球蛋白結合，并在質檢線上富集，在紫外線照射激發下發出紅光。

在紫外線照射下，在檢測線和質檢線同時出現紅色條帶的判為陽性反應，待檢液體中含有dtmuv抗原；只在質檢線出現紅色條帶的判為陰性反應，待檢液體中不含dtmuv抗原；如果質檢線未出現紅色條帶，則表明操作過程不正確或試紙條失效。

按照步驟1至步驟4的方法，將a多抗替換為b多抗，b多抗的用量為a多抗的最佳用量，其他步驟均不變，得到熒光納米晶試紙條，將該熒光納米晶試紙條命名為熒光納米晶試紙條b，作為對照。

實施例3、熒光納米晶試紙條的特異性

實驗重復三次，每次重復實驗的具體步驟如下：

用實施例2的熒光納米晶試紙條a和熒光納米晶試紙條b分別檢測鴨瘟病毒(dpv)、鴨病毒性肝炎病毒(dhv)、番鴨源禽ⅰ型副粘病毒(ndv)、禽流感病毒(aiv)、禽傳染性支氣管炎病毒(ibv)、番鴨呼腸孤病毒(arv)、減蛋綜合癥病毒(edsv)和鴨坦布蘇病毒(dtmuv)以及陰性血清(未感染dtmuv的鴨的血清)，具體步驟如下：

用pbs分別重懸鴨瘟病毒(dpv)、鴨病毒性肝炎病毒(dhv)、番鴨源禽ⅰ型副粘病毒(ndv)、禽流感病毒(aiv)、禽傳染性支氣管炎病毒(ibv)、番鴨呼腸孤病毒(arv)、減蛋綜合癥病毒(edsv)和鴨坦布蘇病毒(dtmuv)，分別得到相應病毒懸液，即dpv懸液、dhv懸液、ndv懸液、aiv懸液、ibv懸液、arv懸液、edsv懸液和dtmuv懸液，各病毒懸液中病毒的含量相同。

用移液器將dpv懸液、dhv懸液、ndv懸液、aiv懸液、ibv懸液、arv懸液、edsv懸液和dtmuv懸液以及pbs和陰性血清分別垂直緩慢滴至實施例2的熒光納米晶試紙條a的樣品墊上，10-20min后在紫外線下進行觀察，結果如表2和圖5所示。

用移液器將dpv懸液、dhv懸液、ndv懸液、aiv懸液、ibv懸液、arv懸液、edsv懸液和dtmuv懸液以及pbs和陰性血清分別垂直緩慢滴至實施例2的熒光納米晶試紙條b的樣品墊上，10-20min后在紫外線下進行觀察，結果如表2所示。

表2、熒光納米晶試紙條特異性試驗結果

注：表2中，“-”表示陰性，即質檢線發紅光且檢測線無紅光，“+”表示陽性，即質檢線與檢測線均發紅光。

結果顯示，熒光納米晶試紙條a可以特異識別dtmuv，熒光納米晶試紙條b不能識別dtmuv。

實施例4、熒光納米晶試紙條的靈敏度

實驗重復三次，每次重復實驗的具體步驟如下：

用核酸蛋白測定儀測定鴨坦布蘇病毒液280nm、260nm波長處od值，按以下公式計算鴨坦布蘇病毒蛋白濃度。鴨坦布蘇病毒蛋白濃度(mg/ml)＝(1.45×od280-0.74×od260)×稀釋倍數

將鴨坦布蘇病毒(dtmuv)用pbs懸浮，得到鴨坦布蘇病毒液，將鴨坦布蘇病毒液稀釋，分別得鴨坦布蘇病毒蛋白到濃度為0.05、0.1、1、5、10、20、50、100、200、500ng/ml的dtmuv懸液。檢測前先將待檢測樣品恢復室溫，用移液器將100μl各dtmuv懸液及pbs(即dtmuv的濃度為0ng/ml)垂直緩慢滴加在實施例2的熒光納米晶試紙條a的樣品墊上，10-20min后用手持式紫外燈進行照射，觀察檢測結果，如表3所示。

根據文獻《鴨坦布蘇病毒e基因主要抗原域的原核表達及單克隆抗體的制備》(孫濤等，中國預防獸醫學報，第38卷第6期，2016年6月)公開的單克隆細胞株4g8、6b12，獲取這兩株細胞株表達出的單抗4g8、6b12。

按照實施例步驟三的方法，將a多抗分別替換為單抗4g8和6b12，單抗4g8和6b12的用量均為a多抗的最佳用量，其他步驟均不變，得到熒光納米晶試紙條4g8和熒光納米晶試紙條6b12。

按照上述方法，將熒光納米晶試紙條a替換為熒光納米晶試紙條4g8和熒光納米晶試紙條6b12，其他步驟均不變，得到熒光納米晶試紙條4g8和6b12的靈敏度檢測結果(表3)。

表3、熒光納米晶試紙條靈敏度試驗結果

注：表3中，“-”表示陰性，即質檢線發紅光且檢測線無紅光，“+”表示陽性，即質檢線與檢測線均發紅光。

由上述結果可知，熒光納米晶試紙條a可以檢測到鴨坦布蘇病毒蛋白濃度為0.1ng/ml的dtmuv，熒光納米晶試紙條4g8可以檢測到鴨坦布蘇病毒蛋白濃度為100ng/ml的dtmuv，熒光納米晶試紙條6b12可以檢測到鴨坦布蘇病毒蛋白濃度為100ng/ml的dtmuv，表明，熒光納米晶試紙條a的靈敏度為0.1ng/ml鴨坦布蘇病毒蛋白，遠高于熒光納米晶試紙條4g8和6b12的靈敏度。

實施例5、熒光納米晶試紙條的重復性

實驗重復三次，每次重復實驗的具體步驟如下：

用實施例4的10ng/ml的dtmuv懸液作為陽性樣品檢測隨機抽取的實施例2的不同批次(共3個批次)及同一批次中不同的熒光納米晶試紙條a(每批次選取30個)，檢測試紙條的重復性。陽性樣品共檢測隨機抽取的不同批次及同一批次中不同的熒光納米晶試紙條a90個，具體實驗按照實施例4進行，用pbs作為陰性對照樣品。結果顯示在紫外燈下這90個試紙條的結果一致，質檢線與檢測線均發熒光，表明，熒光納米晶試紙條a的重復性好。

實施例6、熒光納米晶試紙條的質保期限

實驗重復三次，每次重復實驗的具體步驟如下：

取實施例2的熒光納米晶試紙條a100條，保存于4℃冰箱中，在熒光納米晶試紙條a在4℃下保存分別滿1、2、3、4、5、6、7、8、9和10個月時取出10條，連同新制備得到的熒光納米晶試紙條a(即保存0個月)用實施例4的10ng/ml的dtmuv懸液作為陽性樣品進行檢測，確定熒光納米晶試紙條a的質保期限(表4)，用pbs作為陰性對照樣品。

表4、熒光納米晶試紙條質保期限試驗結果

注：表4中，“*”表示質檢線與檢測線均無紅光，“+”表示陽性，即質檢線與檢測線均發紅光。

結果發現，在4℃保存6個月內，熒光納米晶試紙條a的檢測結果沒有任何變化，熒光納米晶試紙條a在4℃保存滿7個月及更長時間時，試紙條失效，不能檢測到dtmuv。結果表明，熒光納米晶試紙條a在4℃下可以保存6個月。

實施例7、熒光納米晶試紙條的準確性

采用實施例2的熒光納米晶試紙條a以及rt-pcr的方法對臨床上采集的215個鴨血清樣品進行dtmuv檢測，結果如表5所示。rt-pcr用到的引物為：f1：5’ctagtgaagaatcctaccg一3’f2：5’-aagtgaattcacccccaactgagcc-3’，采用的試劑為primescript^tmonesteprt-pcrkitver.2(寶生物工程(大連)有限公司，貨號：rr057a)。

表5、試紙條及rt-pcr檢測樣品的結果

根據表4計算利用熒光納米晶試紙條a檢測dtmuv的特異性、敏感性和準確性，特異性為：186/187＝99.47％；敏感性為：26/28＝92.86％；準確性：(26+186)/215＝98.60％。利用熒光納米晶試紙條a檢測dtmuv具有高特異性、高敏感性和高準確性。

<110>徐成蔚

<120>檢測鴨坦布蘇病毒的側向流免疫層析測定產品及相關試劑與制備方法

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