一種定量微藻利用源于硅酸巖風化的無機碳能力方法與流程

本發明涉及一種定量微藻利用源于硅酸巖風化的無機碳能力方法，屬于全球變化以及生態環境系統監測領域。

背景技術：

全球大氣二氧化碳(co2)濃度逐漸升高，全球氣候變暖，全球碳循環已成為國際科學界關注的熱點。全球碳儲存庫主要有化石燃料、陸地、大氣、海洋，碳酸鹽巖等，隨著人類對化石燃料資源的開采燃燒及其土地開荒，擾動了前農業時期的全球碳循環。地球系統的碳循環影響著全球氣候變化，它對世界經濟、社會和生態環境等產生了重大影響，大氣co2濃度升高對世界各國經濟的可持續發展和國家安全，等帶來嚴峻挑戰。鈣鎂硅酸鹽巖的風化作用形成較為穩定的碳酸氫根離子(hco3^-)，對氣候調節起決定性的作用。

硅酸鹽在風化作用中，微藻作為古老的生命形式，貫穿整個地質，微藻能利用風化產生的碳酸氫根離子(hco3^-)，形成“生物泵”，加速巖石的風化。定量出微藻利用源于硅酸巖風化的無機碳能力，可指示微藻對硅酸巖的生物溶蝕能力，為尋找遺失的碳匯提供新的途徑。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是：提供一種定量微藻利用源于硅酸巖風化的無機碳能力方法，實現微藻利用源于硅酸巖風化無機碳的光合碳匯的定量，可以補充部分被忽視的“遺失碳匯”，填補碳匯計算的空白。

本發明采取以下技術方案：它包括以下步驟：

第一，利用添加碳酸氫鈉的濃度為16mm及以上、同時附加10mm乙酰唑胺也即az雙向同位素標記培養待測微藻，獲取待測微藻二氧化碳同化過程中的穩定碳同位素分餾值δ；分步驟如下：

分步一、首先選擇兩種δ¹³c值差值大于10‰的碳酸氫鈉作為同位素標記1和同位素標記2分別添加到檢測培養液中，同時在同樣的培養條件下培養起始生物量相同的待測微藻；檢測培養液為添加碳酸氫鈉的濃度為16mm及以上、同時附加10mm乙酰唑胺也即az的藻類培養液；測定待測微藻的起始生物量mo和微藻的起始穩定碳同位素組成δ¹³c的值δo。同位素標記1的碳酸氫鈉的δ¹³c值為δc1，同位素標記2的碳酸氫鈉的δ¹³c值為δc2；

分步二、其次將待測微藻在添加同位素標記的檢測培養液中培養4天后，測定待測微藻的最終生物量mn和在兩種同位素標記的檢測培養液培養的被考察微藻的穩定碳同位素組成δ¹³c的值δs1和δs2；

分步三、測定此培養期間每天培養環境中大氣二氧化碳的日平均穩定碳同位素組成；由此計算出在培養期間，培養環境中大氣二氧化碳的平均穩定碳同位素組成δ¹³c的值δair；

分步四、獲取待測微藻增值倍數p＝mn/mo；

分步五、將待測微藻的起始穩定碳同位素組成δo、待測微藻增值倍數p以及在兩種同位素標記的檢測培養液培養的被考察微藻的穩定碳同位素組成δs1或δs2代入方程：和計算出在兩種同位素標記的檢測培養液培養的被考察微藻的新生藻體穩定碳同位素組成δ¹³c的值δt1和δt2；

分步六、將δt1、δt2、δc1和δc2代入到方程：計算出待測微藻在碳酸氫根離子利用途徑完全被抑制的情況下利用添加的無機碳源的份額fb-a；

分步七、將fb-a、δair以及δt1和δc1或δt2、δc2代入到方程：

δ＝δair+fb-aδc1-δt1-fb-aδair或δ＝δair+fb-aδc2-δt2-fb-aδair，計算出待測微藻二氧化碳同化過程中的穩定碳同位素分餾值δ；

第二，同時設置對照組和測試組，培養條件相同；對照組為培養液中不添加硅酸鹽巖，培養待測微藻；測試組為培養液中添加硅酸鹽巖，培養待測微藻；

第三，將對照組中的待測微藻在培養液中培養7天或7天以上，分別測定待測微藻的最初和最終生物量mco和mcn；微藻的起始穩定碳同位素組成δo-c；培養后的微藻的穩定碳同位素組成δ¹³c的值δs-c；

第四，將測試組待測微藻在培養液中同樣培養7天或7天以上，同樣分別測定待測微藻的最初和最終生物量meo和men；微藻的起始穩定碳同位素組成δo-e；培養后的微藻的穩定碳同位素組成δ¹³c的值δs-e；

第五，測定對照組和測試組每天培養環境中大氣二氧化碳的日平均穩定碳同位素組成，由此計算出對照組和測試組的培養環境中大氣二氧化碳的平均穩定碳同位素組成δ¹³c的值δair-e。

第六，分別計算對照組和測試組的微藻增值倍數pc和pt，pc＝mcn/mco，pt＝men/meo；

第七，將對照組的微藻的起始穩定碳同位素組成δo-c、培養后的微藻的穩定碳同位素組成δ¹³c的值δs-c以及微藻增值倍數pc代入方程:計算出對照組中微藻的新生藻體穩定碳同位素組成δ¹³c值δt-c；

第八，同時，將測試組的微藻的起始穩定碳同位素組成δo-e、培養后的微藻的穩定碳同位素組成δ¹³c的值δs-e以及微藻增值倍數pt代入方程：計算出測試組中微藻的新生藻體穩定碳同位素組成δ¹³c值δt-e；

第九，將δair-e、δt-c、δ代入方程即可計算出測試組和對照組微藻的碳酸氫根離子途徑份額fb；

第十，確定測試組中硅酸鹽巖風化過程中產生的碳酸氫根離子的碳同位素值δc-w；δc-w＝δair-e-1.1‰；

第十一，將δc-w、fb、δ代入方程δtb＝δc-w－δ+9‰fb計算出微藻僅利用硅酸鹽巖風化產生的碳酸氫根離子所形成的藻體碳同位素值δtb；

第十二，將δt-e、δt-c、δtb代入方程即可算出微藻利用硅酸鹽巖風化產生的無機碳源的利用份額fb；

第十三，將微藻利用硅酸鹽巖風化產生的無機碳源的利用份額fb、測試組的微藻增值倍數pt，代入方程d＝fb(pt-1),計算出待測微藻利用源于硅酸巖風化的無機碳能力d。

本發明的基本原理為：

穩定碳同位素的強烈分餾特征是識別不同無機碳來源的基礎。自然界中碳元素有兩種穩定同位素：¹²c和¹³c，它們的天然平均豐度分別為98.89％和1.11％。穩定碳同位素組成通常用δ¹³c(‰)表示，自然界中δ¹³c的變化為-90‰～+20‰(pdb標準)。穩定碳同位素的強烈分餾特征有利于識別不同無機碳來源。質量平衡原理以及同位素混合模型和化學計量學方法，是定量識別不同無機碳源的基礎。

微藻能且只能利用co2與hco3^-作為自身的碳源，一方面co2作為線性非極性，呈電中性，能以分子形式經自由擴散進入細胞雙層脂膜，進入細胞內為微藻光合作用所利用，此過程稱為二氧化碳途徑；另一方面碳酸氫根離子(hco3^-)通過碳酸酐酶(ca)催化，被微藻直接利用(直接利用：hco3^-通過載體蛋白或陰離子交換蛋白轉運進入細胞，一部分在細胞內經胞內碳酸酐酶轉化為co2，另一部分通過葉綠體膜蛋白主動轉運到葉綠體內，經葉綠體碳酸酐酶轉化為co2參與光合作用)或間接利用(間接利用：hco3^-在胞外碳酸酐酶的催化作用水解，形成co2直接自由擴散進行光合作用)，此過程為微藻的碳酸氫根離子利用途徑。

(一)微藻二氧化碳同化過程中的穩定碳同位素分餾值(δ)的計算原理

乙酰唑胺(acetazolamide，az)是含1,3,4-噻二唑環的雜環磺酰胺類碳酸酐酶胞外酶抑制劑，高濃度碳酸氫鈉也對碳酸酐酶胞外酶有抑制作用，在高濃度碳酸氫鈉和10mmaz的作用下，依賴于胞外碳酸酐酶的碳酸氫根離子的間接轉運途徑和碳酸氫根離子的直接轉運途徑將同時被完全抑制。通過添加的兩種標記的重碳酸鹽的方法可以定量出微藻同化二氧化碳過程中的穩定碳同位素分餾值，進而建立計算無機碳利用途徑份額的計算方法。

微藻可以利用大氣的無機碳源和添加的無機碳源，且對于每一種來源的無機碳的利用，都存在co2和hco3^-兩種無機碳利用途徑，為此，我們可以建立如下兩端元的同位素混合模型：

δti＝(1-fbi)δta+fbiδtb＝(1-fbi)[(1-fbi)(δair-δ)+fbi(δair-δ+9‰)]+fbi[(1-fbi)(δci-δ)+fbi(δci-δ+9‰)](i＝1,2)(1)

δta是指微藻只利用大氣來源的無機碳時的藻體碳同位素值，包括：co2和hco3^-這兩種利用途徑；δtb是指微藻只利用添加的碳酸氫鈉來源的無機碳時的藻體碳同位素值，同樣包括：co2和hco3^-這兩種利用途徑。δti為添加已知δ¹³c的某一碳酸氫鈉培養的微藻藻體的δ¹³c值，fbi為微藻利用添加的無機碳占總碳源的份額，(1-fbi)為微藻利用大氣二氧化碳占總碳源的份額。fbi為微藻利用碳酸氫根離子途徑，(1-fbi)為微藻二氧化碳利用途徑份額。δair、δ以及δci分別為環境中大氣二氧化碳的平均穩定碳同位素組成δ¹³c的值、二氧化碳同化過程中的穩定碳同位素分餾值以及同位素標記的碳酸氫鈉的δ¹³c值。

在同一條件下培養的同一種微藻，對于添加的兩種標記的重碳酸鹽來說，方程(1)可以分別表示如下：

δt1＝(1-fb1)[(1-fb1)(δair-δ)+fb1(δair-δ+9‰)]+fb1[(1-fb1)(δc1-δ)+fb1(δc1-δ+9‰)](2)

δt2＝(1-fb2)[(1-fb2)(δair-δ)+fb2(δair-δ+9‰)]+fb2[(1-fb2)(δc2-δ)+fb2(δc2-δ+9‰)](3)

在方程(2)和(3)中，δt1為添加第一種已知δ¹³c的碳酸氫鈉培養的微藻藻體的δ¹³c值；δt2為添加第二種已知δ¹³c的碳酸氫鈉培養的微藻藻體的δ¹³c值；fb1為微藻利用添加的第一種碳酸氫鈉占總碳源的份額；fb2為微藻利用添加的第二種碳酸氫鈉占總碳源的份額；fb1為培養在添加第一種已知δ¹³c的碳酸氫鈉的培養液中的微藻利用碳酸氫根離子途徑所占的份額；fb2為培養在添加第二種已知δ¹³c的碳酸氫鈉的培養液中的微藻利用碳酸氫根離子途徑所占的份額。δc1為同位素標記1的碳酸氫鈉的δ¹³c值，δc2為同位素標記2的碳酸氫鈉的δ¹³c值；δ值為微藻co2同化過程中的穩定碳同位素分餾值；δair值為培養微藻時房間空氣中的碳同位素值。

不論添加哪種標記的碳酸氫鈉，只要在同一培養條件下，同一種微藻利用添加的重碳酸鹽所占總碳源的份額是相同的，即：fb1＝fb2＝fb。不論添加哪種標記的碳酸氫鈉，只要在同一培養條件下，同一種微藻利用碳酸氫根離子途徑所占的份額是相同的，由此可以得到：fb1＝fb2＝fb。此基礎上，將方程(2)與方程(3)做差、化簡可得：

在高濃度碳酸氫鈉和10mmaz的作用下，依賴于胞外碳酸酐酶的碳酸氫根離子的間接轉運途徑和碳酸氫根離子的直接轉運途徑將同時被完全抑制，所以：

fb1＝fb2＝fb＝0(5)

這樣，此時的(2)和(3)式可分別簡化成：

δ＝δair+fbδc1-δt1-fbδair(6)

δ＝δair+fbδc2-δt2-fbδair(7)

δt1為添加第一種已知δ¹³c的碳酸氫鈉培養的微藻藻體的δ¹³c值；δt2為添加第二種已知δ¹³c的碳酸氫鈉培養的微藻藻體的δ¹³c值；

收獲后的微藻藻體的δ¹³c值，不完全是新生成的藻體的δ¹³c，而是含有培養時的原始藻體加新生成的藻體的δ¹³c混合值，因此，為了獲取新生成的藻體的δ¹³c值δt1或δt2；我們建立了如下方程：

δo+(p-1)×δti＝p×δsi(8)

p為微藻增值倍數，其值為實驗處理后的微藻生物量(mn)/初始接種時的微藻生物量(mo)；

δo為初始接種的微藻藻體碳同位素組成(δ¹³c)；

δsi為實驗處理后的微藻藻體碳同位素組成(δ¹³c)(i＝1，2)；

δti為實驗處理新生成的藻體碳同位素組成(δ¹³c)(i＝1，2)。

(8)式變形后為：

因此知道了δti、δci以及培養期間培養環境中大氣二氧化碳平均穩定碳同位素組成δ¹³c的值δair，由(6)和(7)式計算微藻二氧化碳同化過程中的穩定碳同位素分餾值δ。

(二)微藻利用硅酸鹽巖風化產生的無機碳源的利用份額的計算原理

在風化水體中微藻可以利用直接來源于大氣的無機碳源和硅酸鹽巖風化產生的無機碳源，建立微藻碳同位素的兩端元混合模型為：

δt＝(1-fb)δta+fbδtb(10)

化簡可得：

fb＝(δt-δta)/(δtb-δta)(11)

式中：δta為微藻只利用直接來源于空氣二氧化碳的無機碳時的碳同位素值；

δtb為微藻只利用硅酸鹽巖風化產生的無機碳源時的碳同位素值；

δt值為硅酸鹽巖處理下的微藻藻體的碳同位素值；

fb為微藻利用硅酸鹽巖風化產生的無機碳源的利用份額；

1-fb為微藻利用直接來源于空氣二氧化碳的無機碳的的利用份額。

且對于每一種來源的無機碳的利用，都存在co2和hco3^-兩種無機碳利用途徑，在無機碳利用過程中，hco3^-的直接轉運過程存在約10‰的碳同位素分餾，由caex催化的hco3^-的間接轉運過程只存在約1.1‰的碳同位素分餾，兩者之間存在約9‰的穩定碳同位素分餾差異。故建立的兩端元混合模型(10)式可化為：

δt＝(1-fb)[(1-fb)(δair-δ)+fb(δair-δ+9‰)]+fb[(1-fb)(δc-δ)+fb(δc-δ+9‰)](11)

化簡得：

fb＝[fb(δair-δc)+(δ+δt-δair)]/9‰(12)

式中：δc值為硅酸鹽巖風化過程中產生的碳酸氫根離子的碳同位素值；

δ值為微藻co2同化過程中的穩定碳同位素分餾值；

δair值為培養微藻時環境空氣中的碳同位素值；

fb值為微藻的碳酸氫根離子途徑利用份額；

1-fb值為微藻的二氧化碳途徑利用份額。

根據(12)式，微藻在有硅酸鹽巖和無硅酸鹽巖處理的情況下，其碳酸氫根離子途徑份額并不會改變，則fb＝fb1＝fb2：

fb1＝[fb1(δair-δc)+(δ+δt1-δair)]/9‰(13)

fb2＝[fb2(δair-δc)+(δ+δt2-δair)]/9‰(14)

其中：fb1值為微藻在沒有硅酸鹽巖處理下利用硅酸鹽巖風化產生的無機碳源的利用份額；

fb2值為微藻在有硅酸鹽巖處理下利用硅酸鹽巖風化產生的無機碳源的利用份額；

fb1值為微藻在沒有硅酸鹽巖處理下的碳酸氫根離子途徑利用份額；

fb2值為微藻在有硅酸鹽巖處理下的碳酸氫根離子途徑利用份額；

δt1值為在沒有硅酸鹽巖處理下微藻藻體的碳同位素值；

δt2值為在有硅酸鹽巖處理下微藻藻體的碳同位素值。

當不添加硅酸鹽巖時fb1值為0，計算出fb如(15)式

fb＝(δ+δt1－δair)/9‰(15)

根據(11)式，可將δtb表示為(16)式：

δtb＝(1-fb)(δc－δ)+fb(δc－δ+9‰)(16)

(16)式化簡得：

δtb＝δc－δ+9‰fb(17)

δc值為硅酸鹽巖風化過程中產生的碳酸氫根離子的碳同位素值，其值可根據空氣中的二氧化碳分餾值計算得到，如(18)式：

δc＝δair－1.1‰(18)

在25℃下，緩慢的平衡狀態下約為8.5‰，但是由于藻類快速吸收利用，使得二氧化碳水解平衡一直向著碳酸氫根離子方向發展，因此，在有藻類快速利用碳酸氫根離子的情況下硅酸鹽巖風化過程產生的碳同位素分餾值取為1.1‰。

(11)式中微藻利用硅酸鹽巖風化產生的無機碳源的利用份額fb＝(δt－δta)/(δtb－δta)中δt值為添加硅酸鹽巖培養的藻體碳同位素值，δta即為同條件下不加硅酸鹽巖培養的藻體碳同位素值，δtb可根據(17)式計算出，即可算出微藻利用硅酸鹽巖風化產生的無機碳源的利用份額fb。最后，以微藻利用硅酸鹽巖風化產生的無機碳源的利用份額fb與微藻新增值倍數的乘積來表征微藻利用源于硅酸巖風化的無機碳能力。

本發明的有益效果：

1)本方法不僅能量化在微藻對硅酸鹽的生物溶蝕作用過程中的碳酸氫根離子途徑份額，而且還能量化出微藻利用硅酸鹽巖風化產生的碳酸氫根離子的份額。

2)本方法可以定量出不同微藻利用源于不同的硅酸巖風化的無機碳能力，結果具有可比性。

3)本方法提供了一種微藻易被忽視的部分“碳匯”的獲取方法，為尋找遺失的碳匯提供技術支撐。

4)本方法還可以通過定量出不同微藻利用源于不同的硅酸巖風化的無機碳能力來比較不同微藻對硅酸鹽的生物溶蝕作用。

具體實施方式

本發明的實例：它包括以下步驟：

第一步驟，利用添加碳酸氫鈉的濃度為16mm及以上、同時附加10mm乙酰唑胺也即az雙向同位素標記培養待測微藻，獲取待測微藻二氧化碳同化過程中的穩定碳同位素分餾值δ；分步驟如下：

(1)首先選擇兩種δ¹³c值差值大于10‰的碳酸氫鈉作為同位素標記1和同位素標記2分別添加到檢測培養液中，同時在同樣的培養條件下培養起始生物量相同的待測微藻；檢測培養液為添加碳酸氫鈉的濃度為16mm及以上、同時附加10mm乙酰唑胺也即az的藻類培養液。測定待測微藻的起始生物量mo和微藻的起始穩定碳同位素組成δ¹³c的值δo。同位素標記1的碳酸氫鈉的δ¹³c值為δc1，同位素標記2的碳酸氫鈉的δ¹³c值為δc2；將待測微藻在添加同位素標記的檢測培養液中培養收獲后，測定待測微藻的最終生物量mn和在兩種同位素標記的檢測培養液培養的被考察微藻的穩定碳同位素組成δ¹³c的值δs1和δs2。測定培養期間每天培養環境中大氣二氧化碳的日平均穩定碳同位素組成，由此計算出在培養期間，培養環境中大氣二氧化碳的平均穩定碳同位素組成δ¹³c的值δair。

(2)待測微藻增值倍數p＝mn/mo。將微藻的起始穩定碳同位素組成δo、待測微藻增值倍數p以及在兩種同位素標記的檢測培養液培養的被考察微藻的穩定碳同位素組成δs1或δs2代入方程：和計算出在兩種同位素標記的檢測培養液培養的被考察微藻的新生藻體穩定碳同位素組成δ¹³c的值δt1和δt2。將δt1、δt2、δc1和δc2代入到方程：計算出待測微藻利用添加的無機碳源的份額fb-a。

(3)將fb-a、δair以及δt1和δc1或δt2、δc2代入到方程：

δ＝δair+fb-aδc1-δt1-fb-aδair或δ＝δair+fb-aδc2-δt2-fb-aδair，計算出待測微藻二氧化碳同化過程中的穩定碳同位素分餾值δ；

第二步驟，同時設置對照組和測試組，培養條件相同；對照組為培養液中不添加硅酸鹽巖，培養待測微藻；測試組為培養液中添加硅酸鹽巖，培養待測微藻；

第三步驟，將對照組中的待測微藻在培養液中培養7天后，分別測定待測微藻的最初和最終生物量mco和mcn；微藻的起始穩定碳同位素組成δo-c；培養后的微藻的穩定碳同位素組成δ¹³c的值δs-c；

第四步驟，將測試組待測微藻在培養液中同樣培養7天后，同樣分別測定待測微藻的最初和最終生物量meo和men；微藻的起始穩定碳同位素組成δo-e；培養后的微藻的穩定碳同位素組成δ¹³c的值δs-e；

第五步驟，測定對照組和測試組每天培養環境中大氣二氧化碳的日平均穩定碳同位素組成，由此計算出對照組和測試組的培養環境中大氣二氧化碳的平均穩定碳同位素組成δ¹³c的值δair-e。

第六步驟，分別計算對照組和測試組的微藻增值倍數pc和pt，pc＝mcn/mco，pt＝men/meo；

第七步驟，將對照組的微藻的起始穩定碳同位素組成δo-c、培養后的微藻的穩定碳同位素組成δ¹³c的值δs-c以及微藻增值倍數pc代入方程:計算出對照組中微藻的新生藻體穩定碳同位素組成δ¹³c值δt-c；

第八步驟，同時，將測試組的微藻的起始穩定碳同位素組成δo-e、培養后的微藻的穩定碳同位素組成δ¹³c的值δs-e以及微藻增值倍數pt代入方程：計算出測試組中微藻的新生藻體穩定碳同位素組成δ¹³c值δt-e；

第九步驟，將δair-e、δt-c、δ代入方程即可計算出測試組和對照組微藻的碳酸氫根離子途徑份額fb；

第十步驟，依據δair-e確定測試組中硅酸鹽巖風化過程中產生的碳酸氫根離子的碳同位素值δc-w，δc-w＝δair-e-1.1‰；

第十一步驟，將δc-w、fb、δ代入方程δtb＝δc-w－δ+9‰fb計算出微藻僅利用硅酸鹽巖風化產生的碳酸氫根離子所形成的藻體碳同位素值δtb；

第十二步驟，將δt-e、δt-c、δtb代入方程即可算出微藻利用硅酸鹽巖風化產生的無機碳源的利用份額fb；

第十三步驟，將微藻利用硅酸鹽巖風化產生的無機碳源的利用份額fb、測試組的微藻增值倍數pt，代入方程d＝fb(pt-1),計算出待測微藻利用源于待測硅酸巖風化的無機碳能力d。

實施例1：在不同營養下萊茵衣藻利用源于硅酸巖風化的無機碳能力

實施例1的實施效果如下：

實驗1：萊茵衣藻在二氧化碳同化過程中的穩定碳同位素分餾值(δ)的計算；

培養材料為：萊茵衣藻。培養基為在基本培養液(se培養基)添加16mm碳酸氫鈉和10mmaz，基本培養條件為：光周期l/d：12h/12h；溫度25℃；光照強度為100μmol·m^-2·s^-1，ph值8.3。添加的碳酸氫鈉的δ¹³c分別為-17.4‰(pdb)(δc1)和-28.4‰(pdb)(δc2)，表1表示萊茵衣藻有關實驗數據。

表1萊茵衣藻新生藻體穩定碳同位素組成δ¹³c的值

依據表1可以獲得萊茵衣藻的二氧化碳同化過程中的穩定碳同位素分餾值δ如表2。

表2萊茵衣藻的二氧化碳同化過程中的穩定碳同位素分餾值δ(‰)

實驗2：萊茵衣藻利用硅酸巖風化產生的無機碳源的利用份額以及萊茵衣藻對硅酸巖的溶蝕作用能力的計算；

培養材料為：萊茵衣藻。培養基為se培養基與剔鎂se培養基(用等物質量的硫酸鈉代替硫酸鎂)，其ph值6.3。基本培養條件為：光周期l/d：12h/12h；溫度25℃；光照強度為100μmol·m^-2·s^-1。se培養基條件件下培養萊茵衣藻，一組為添加橄欖巖的，一組不添加橄欖巖；剔鎂se培養基條件下培養萊茵衣藻，一組為添加橄欖巖的，一組不添加橄欖巖；每一組處理均設置三個實驗平行，培養7天后測定各個處理的藻體碳同位素值，測定空氣的穩定碳同位素值δair，結果見表3。

表3萊茵衣藻的碳同位素值、空氣穩定碳同位素值以及微藻增值倍數

注：c.r+l表示剔鎂se培養基、添加萊茵衣藻的處理組；

c.r+r+l表示剔鎂se培養基、添加萊茵衣藻與橄欖巖樣品的處理組；

c.r+f表示se培養基、添加萊茵衣藻的處理組；

c.r+r+f表示se培養基、添加萊茵衣藻與橄欖巖樣品的處理組。

根據表3的相關實驗數據，根據本發明的計算方法，可計算出測試組和對照組微藻的碳酸氫根離子途徑份額fb；硅酸鹽巖風化過程中產生的碳酸氫根離子的碳同位素值δc-w、微藻僅利用硅酸鹽巖風化產生的碳酸氫根離子所形成的藻體碳同位素值δtb、微藻利用硅酸鹽巖風化產生的無機碳源的利用份額fb以及微藻利用源于硅酸巖風化無機碳能力d(如表4)

表4萊茵衣藻利用的橄欖巖風化過程中的碳酸氫根的份額和微藻利用源于硅酸巖風化無機碳能力

*fb不能超過1，超過1為測定精度造成的，所以取1。

從表4中可以看出，萊茵衣藻在缺鎂培養基與不缺鎂培養基的兩種培養條件下微藻利用源于硅酸巖風化的無機碳能力明顯不同。在缺鎂條件下，微藻能利用的橄欖巖風化過程產生的碳酸氫根離子份額較大，促進了溶蝕反應方程式向右進行，產生的碳酸氫根離子多，因此，微藻利用源于硅酸巖風化無機碳能力強，這與實際相符。上述測得的模式藻類利用的橄欖巖風化過程中的碳酸氫根的份額一方面可用于估算野外環境下微藻利用硅酸巖風化產生的無機碳形成的碳匯，另一方面還可以用于不同培養環境下無機碳利用途徑的份額、無機碳源利用份額的確定。

實施例2：在不同營養下蛋白核小球藻利用源于硅酸巖風化的無機碳能力

實施例2的實施效果如下：

實驗1：蛋白核小球藻二氧化碳同化過程中的穩定碳同位素分餾值(δ)的計算；

培養材料為：蛋白核小球藻。培養基為在基本培養液(se培養基)添加16mm碳酸氫鈉和10mmaz，基本培養條件為：光周期l/d：12h/12h；溫度25℃；光照強度為100μmol·m^-2·s^-1，ph值8.3。添加的碳酸氫鈉的δ¹³c分別為-17.4‰(pdb)(δc1)和-28.4‰(pdb)(δc2)，表5表示蛋白核小球藻的有關實驗數據。

表5蛋白核小球藻新生藻體穩定碳同位素組成δ¹³c的值

依據表5可以獲得蛋白核小球藻的二氧化碳同化過程中的穩定碳同位素分餾值δ如表6。

表6蛋白核小球藻的二氧化碳同化過程中的穩定碳同位素分餾值δ(‰)

實驗2：蛋白核小球藻利用硅酸巖風化產生的無機碳源的利用份額以及蛋白核小球藻利用源于硅酸巖風化無機碳能力的計算；

培養材料為：蛋白核小球藻。培養基為se培養基與剔鎂se培養基(用等物質量的硫酸鈉代替硫酸鎂)，其ph值6.3。基本培養條件為：光周期l/d：12h/12h；溫度25℃；光照強度為100μmol·m^-2·s^-1。se培養基條件件下培養萊茵衣藻，一組為添加橄欖巖的，一組不添加橄欖巖；剔鎂se培養基條件件下培養蛋白核小球藻，一組為添加橄欖巖的，一組不添加橄欖巖；每一組處理均設置三個實驗平行，培養七天后測定各個處理的藻體碳同位素值，測定空氣的穩定碳同位素值δair，其結果見表7。

表7蛋白核小球藻的碳同位素值、空氣穩定碳同位素值以及微藻增值倍數

注：c.p+l表示剔鎂se培養基、添加蛋白核小球藻的處理組；

c.p+r+l表示剔鎂se培養基、添加小球藻與橄欖巖樣品的處理組；

c.p+f表示se培養基、蛋白核小球藻的處理組；

c.p+r+f表示se培養基、蛋白核小球藻、橄欖巖樣品的處理組；

根據表7的相關實驗數據，根據本發明的計算方法，可計算出測試組和對照組微藻的碳酸氫根離子途徑份額fb；硅酸鹽巖風化過程中產生的碳酸氫根離子的碳同位素值δc-w、微藻僅利用硅酸鹽巖風化產生的碳酸氫根離子所形成的藻體碳同位素值δtb、微藻利用硅酸鹽巖風化產生的無機碳源的利用份額fb以及微藻利用源于硅酸巖風化無機碳能力d(如表8)

表8蛋白核小球藻利用的橄欖巖風化過程中的碳酸氫根的份額和蛋白核小球藻利用源于硅酸巖風化無機碳能力

從表8中可以看出，在缺鎂培養基與不缺鎂培養基的兩種培養條件下蛋白核小球藻利用源于硅酸巖風化的無機碳能力差異也較大。同樣地，在缺鎂條件下，蛋白核小球藻能利用的橄欖巖風化過程產生的碳酸氫根離子份額也大于不缺鎂培養基中蛋白核小球藻能利用的橄欖巖風化過程產生的碳酸氫根離子份額，最終導致蛋白核小球藻在缺鎂培養基中利用源于硅酸巖風化的無機碳能力大于不缺鎂培養基中的蛋白核小球藻利用源于硅酸巖風化的無機碳能力。

綜合實施例1和實施例2的結果可以看出，蛋白核小球藻利用源于橄欖巖風化的無機碳能力遠遠大于萊茵衣藻利用源于橄欖巖風化的無機碳能力，這與蛋白核小球藻的細胞顯著小于萊茵衣藻的細胞有關。具有同樣生物量的蛋白核小球藻因細胞小，比表面積大，接觸硅酸巖的面積大，因此具有較強的溶蝕能力，產生的碳酸氫根離子量大，最終導致微藻利用源于硅酸巖風化的無機碳能力強。