糖化血紅蛋白的檢測方法、層析試紙條及其組裝方法與流程

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本發明涉及層析檢測技術領域，尤其涉及一種糖化血紅蛋白含量的檢測方法、層析試紙條及其組裝方法。

背景技術：

近年來，糖化血紅蛋白（hba1c）在臨床上開始漸漸被高度重視。糖化血紅蛋白（hba1c)是血紅蛋白a組分的某些特殊分子部位和葡萄糖經過緩慢而不可逆的非酶促反應結合而形成的。因此，當血液中葡萄糖濃度較高時，人體形成的糖化血紅蛋白含量也會相對較高。

hba1c是一項說服力較強、數據較客觀、穩定性較好的生化檢查項目，其不受偶爾一次血糖升高或降低的影響，能夠反映糖尿病患者2～3個月以內的糖代謝狀況，同時與糖尿病并發癥尤其是微血管病變關系密切，在糖尿病學上有重要的臨床參考價值。

1993年美國1型糖尿病控制及并發癥實驗（dcct）和英國大規模的ii型糖尿病控制與并發癥關系研究（ukpds）的研究中把hba1c作為糖尿病控制的一個觀察指標。1996年4月起在日本，hba1c被納入老年人保健法中糖尿病篩選的檢查項目。2002年美國糖尿病協會（ada）已將其作為監測糖尿病控制的金標準，對其應用也作了明確的規定：即所有糖尿病患者均應常規測定hba1c。其初診時測定結果為基線時的代謝狀況，此后的測定值則作為糖尿病長期治療控制中的一部分，這樣在提高糖尿病診斷水平、血糖控制、慢性并發癥的防治中具有十分重要的應用價值。目前通常認為檢測hba1c的臨床意義有兩點：1.在糖尿病的篩選普查中有早期提示的價值，可作為輕癥、ii型、“隱性”糖尿病的早期診斷指標。2.在糖尿病的治療中，hba1c是評價血糖控制好壞的重要標準。

雖然糖化血紅蛋白具有以上的重大檢驗意義，但在臨床上，只有30%左右的糖尿病患者能做到定期監測糖化血紅蛋白。

對于糖尿病患者而言，良好的血糖控制是預防并發癥的關鍵，而血糖監測在很大程度上取決于患者本人的認知和行動。由于大部分患者選擇可靠性不高的日常監測手段，目前超過60%的ii型糖尿病患者的糖化血紅蛋白控制不理想。

糖化血紅蛋白長期控制不穩定的影響是多方面的，它會改變紅細胞對氧的親和力，加速心腦血管并發癥的形成；如果眼睛內的晶體被糖化，則會引發白內障。此外，它可引起腎小球基底膜增厚，誘發糖尿病腎病，并引起血脂和血粘度增高。糖化血紅蛋白升高，是心肌梗死、腦卒中死亡的一個高危因素。在男性患者中，糖化血紅蛋白每增加1%，死亡率的相對危險性增加24%，女性患者增加28%。一旦糖化血紅蛋白超過7%，發生心腦血管疾病的危險性就增加50%以上。

測定糖化血紅蛋白的方法根據檢測的原理，基本上可分為基于ghb和hb的電荷不同（如離子交換法、電泳法）和基于hb上糖化基團的結構特點（如親和層析方法、免疫法和酶法等）兩類。其中，臨床上廣泛采用采用離子層析法，其具有精密度高、重復性好且操作簡單的優點。但其價格較為昂貴，而且容易受到帶電性相近的胎兒血紅蛋白(hb-f)的干擾,可能在離子交換hplc分析圖上與hba1c峰重疊。

手工微柱操作會受到人工因素影響,可能會洗脫不完全或過度洗脫并受外界環境溫度的影響,而某些血紅蛋白如hbf異常增加時,也會與糖化血紅蛋白同時洗脫,從而使結果產生偏差。由于手工操作層析時間和微柱的質量不易控制,易產生操作技術誤差,重復性欠佳。

還有一些使用瓊脂凝膠電泳法。根據hb及hba1帶正電荷,電泳時向負極移動的原理進行檢測。但是普通電泳法對hba和hba1分離效果不理想,目前尚無商品化且具有批量樣本通過能力的儀器面世,相當程度地限制了該方法的臨床應用。

等電點聚集法是測定ghb的一種新技術。其在聚丙烯酞凝膠中加人載體兩性介質(如ampholin)的薄板上形成一個由陽極到陰極逐漸增加的ph梯度,溶血液中各個組份將移動到各自的等電點的ph位置上,這樣就得到比一般電泳法更好的分劃效果和比較集中的色帶,通過分辨率高的微量光密度儀掃描,可以準確地測定出各自組份的含量。由于它能夠分辨出一級結構不同的hba、hbac、hbf、hbs及hbc等,可完全避開各種物質的干擾,是一種理想的方法,。但儀器價格相當昂貴,難于用作常規檢測和推廣使用。

親和層析檢測方法是利用生物高分子能與相應的專一配基分子可逆結合的原理,將配基通過共價鍵牢固地結合于固相載體上制得親和吸附系統。但是親和層析的檢測結果為糖化血紅蛋白總量,不能測試ghb的單一組份,且包含hba1的糖化組份,因此將親和色譜所測出的ghb稱為總的ghb是不確切的,嚴格來說是占不同百分數的各種ghb,目前對其測定內容的命名國內外尚不統一。

還有一些近期發展起來的新方法，例如離子捕獲法,其原理是糖化血紅蛋白與相應抗體結合后,聯以熒光標記物,形成一反應復合物,再聯結帶負電荷的多聚陰離子復合物,而在imx反應孔中的玻璃纖維預先包被了高分子的四胺合物,使纖維表面帶正電,使前述的反應復合物吸附在纖維表面,經過一系列清洗后測定其熒光強度,從而得到糖化血紅蛋白的濃度,該方法適用于成批糖化血紅蛋自標本的檢測。

化學發光法則采用離子捕捉免疫分析法,應用抗原抗體反應原理,聯以熒光標記物,通過連接帶負電的多陰離子復合物,吸附到帶正電的纖維表面,經過一系列徹底清洗等步驟后,測定熒光強度變化率,計算濃度。采用專用試劑包和免疫發光分析儀,其檢測系統易于規范和重復,可減少操作技術誤差,檢測的靈敏度和特異性高,批內、批間變異系數小,回收率高,準確度高,交叉污染率小,影響因素少。但是其儀器較貴，不適用于普及。

酶法的原理為用特殊蛋白酶分解hb,3-5min內果糖基氨基酸從hb分離,果糖基氨基酸氧化酶(faod)從果糖基氨基酸產生h2o2,h2o2經pod與da-64反應,選擇751nm測吸光度改變求得ghb濃度。此方法較為不穩定。

因此，提供一種靈敏度高、特異性強、操作簡便、檢測速度快的檢測方法來監測病人體內糖化血紅蛋白的水平的變化，可以做到及時檢測、及時治療并且減輕病人痛苦，減少家庭負擔以及社會負擔等，具有重大的現實意義。

技術實現要素：

鑒于上述現有技術的不足之處，本發明的目的在于提供一種糖化血紅蛋白的檢測方法、層析試紙條及其組裝方法，旨在解決現有技術中糖化血紅蛋白檢測繁瑣，成本高的問題。

為了達到上述目的，本發明采取了以下技術方案：

一種層析試紙條，應用于糖化血紅蛋白含量的檢測，其中，所述層析試紙條包括：

底板，所述底板的一端為用于承載樣品的加樣區，另一端為用于提供層析動力的吸引區；所述加樣區和吸引區之間形成層析反應區；

所述層析反應區內依次設置有接近加樣區的第一測試線和接近吸引區的第二測試線；所述第一測試線包被糖化血紅蛋白單克隆抗體；所述第二測試線包被血紅蛋白單克隆抗體。

所述的層析紙條，其中，所述加樣區為固定在所述底板上的樣品墊。

所述的層析紙條，其中，所述層析反應區固定在所述底板上的硝酸纖維素膜；

所述樣品墊的至少一部分疊合在所述硝酸纖維素膜上。

所述的層析紙條，其中，所述吸引區為吸水濾紙；所述吸水濾紙至少部分與所述硝酸纖維素膜重疊。

所述的層析紙條，其中，所述糖化血紅蛋白單克隆抗體的濃度為0.1-0.8mg/ml；所述血紅蛋白單克隆抗體的濃度為0.1-0.8mg/ml。

所述的層析紙條，其中，所述第一測試線和第二測試線之間的距離為15-20mm。

一種應用如上所述的層析試紙條的糖化血紅蛋白的檢測方法，其中，所述方法包括：

將獲取的待檢測樣本加入所述加樣區；

在層析反應完成后，可以得到一條峰形圖，如圖2所示，其中第1個色譜峰為hba1c峰，第2個色譜峰為hb峰，計算2個峰的峰面積，然后計算出糖化血紅蛋白的含量。

所述方法中，其中，所述通過2個峰的峰面積來計算糖化血紅蛋白的含量，根據所述第一個峰的峰面積s1和第二個峰的峰面積s2，計算糖化血紅蛋白的含量，具體包括：

根據2個峰的峰面積來計算糖化血紅蛋白的含量，確定所述第一個峰的峰面積s1和第二個峰的峰面積s2；

通過如下算式計算糖化血紅蛋白的含量：

hba1c%=s1/（s1+s2），其中，hba1c%為所述糖化血紅蛋白的濃度。

一種層析試紙條的組裝方法，其中，所述方法包括：

將硝酸纖維素膜和吸水濾紙分別粘貼在底板上；其中，所述吸水濾紙壓住所述硝酸纖維素膜2-4mm；

裁切樣本墊并將其一端與所述底板對齊，另一端壓在所述硝酸纖維素膜上方，形成試紙大板；

通過斬切機構，將所述試紙大板裁切為寬度為3-6mm的試紙條。

所述的方法，其中，所述方法還包括：

使用劃膜儀，在所述試紙條的預定位置，劃出第一測試線和第二測試線；其中，劃膜濃度為0.5-2ul/cm，劃膜速度為30-50mm/s。

有益效果：本發明提供的糖化血紅蛋白的檢測方法、層析試紙條及其組裝方法。其結合了免疫層析法和高效液相色譜法的優點，可以通過結構簡單的試紙條檢測及計算糖化血紅蛋白含量，既提高了傳統層析法的靈敏度特異性，又結合了親和層析色譜的檢測方法，操作簡便，為進一步poct產品的開發及實現糖化血紅蛋白家庭監測奠定了良好基礎。

附圖說明

圖1為本發明實施例提供的層析試紙條的結構示意圖；

圖2為本發明實施例提供的層析反應完成后得到的峰形圖；

圖3為本發明實施例提供的糖化血紅蛋白的檢測方法的方法流程圖。

具體實施方式

本發明提供的糖化血紅蛋白含量的檢測方法、層析試紙條及其組裝方法。為使本發明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，以下參照附圖并舉實施例對本發明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

圖1為本發明實施例提供的層析試紙條，其可以應用于糖化血紅蛋白含量的檢測。如圖1所示，所述層析試紙條包括：底板100、加樣區200、層析反應區300以及吸引區400。其中，所述加樣區200和吸引區400分別位于底板的兩端，所述加樣區200和吸引區400之間形成層析反應區300。

所述層析反應區300內依次設置有接近加樣區的第一測試線301和接近吸引區的第二測試線302。其中，所述第一測試線包被糖化血紅蛋白單克隆抗體；所述第二測試線包被血紅蛋白單克隆抗體，分別用于與對應的血紅蛋白和糖化血紅蛋白特異性結合，實現檢測。

該層析試紙條基于紙層析的原理進行，吸引區提供層析的動力，吸引加樣區內的樣品沿圖1中所示的層析方向x移動，在層析反應區依次通過所述第一測試線和第二測試線。

在樣品通過第一測試線時，樣品中的糖化血紅蛋白能夠與對應的單克隆抗體特異性結合，由于糖化血紅蛋白本身是紅色，所以可在第一檢測線形成紅色條帶。在樣品通過第二測試線時，樣品中的血紅蛋白則與其相應的單克隆抗體特異性結合，由于血紅蛋白本身是紅色，所以可在第二檢測線也形成相應的紅色條帶。

在本發明實施例中，劃出所述第一測試線和第二測試線的糖化血紅蛋白單克隆抗體和血紅蛋白單克隆抗體的濃度均可以為0.1-0.8mg/ml。在一些實施例中，所述濃度為0.5mg/ml。

較佳的是，所述第一測試線和第二測試線之間的距離為15-20mm，保證層析效果。具體的，距離可以設置為18mm。

可以理解的是，該紅色條帶的顏色深淺與樣品中相應的蛋白質濃度相關。由此，可以根據紅色條帶的顏色，確定樣品的糖化血紅蛋白濃度。

在本發明提供的層析試紙條中，利用了糖化血紅蛋白以及血紅蛋白自身具有顏色的特點，減省了傳統層析法中的結合物墊（不需要使用膠體金、乳膠等顏色標記物），很好的降低了制造的成本。而通過層析試紙的方式對糖化血紅蛋白進行檢測，整體的檢測過程簡單可靠，檢測耗時短，操作簡便，不需要專業人員以及復雜的儀器操作，具有良好的應用前景。

具體的，如圖1所示，所述加樣區200為固定在所述底板100上的樣品墊，所述樣品墊至少一部分疊合在作為層析反應區300的硝酸纖維素膜上，樣品可以通過疊合部位，從樣品墊進入到硝酸纖維素膜中。當然，在另一些實施例中，根據實際情況的需求，還可以使用其他合適的材質，作為層析反應區。

在本實施例中，可以采用吸水濾紙吸引位于樣品墊的樣品沿層析方向移動。與樣品墊相類似的，所述吸水濾紙300也有至少部分與所述硝酸纖維素膜400重疊。

圖3為本發明實施例提供的一種應用如上所述的層析試紙條的糖化血紅蛋白的檢測方法。如圖3所示，所述方法包括如下步驟：

s100：將獲取的待檢測樣本加入所述加樣區。所述待檢測樣本可以是人血清或者血漿樣本等。

在nc膜的毛細管作用下，加入到加樣區的待測樣本會向吸水紙端（吸水區）移動。層析移動過程中，待測樣本中的糖化血紅蛋白抗原與第一測試線上標記的糖化血紅蛋白單抗發生抗原-抗體反應從而被捕獲。而待測樣本中的血紅蛋白抗原則會與第二測試線上標記的血紅蛋白單抗發生抗原-抗體反應被捕獲。

s200：在層析反應完成后，可以獲得對應的峰形圖并計算所述hba1c峰和hb峰的峰面積。。由于糖化血紅蛋白和血紅蛋白自身具有紅色。因此，特異性結合后，會在第一測試線和第二測試線形成相應的紅色條帶而不需要使用特定的顏色標記物。

在本實施例中，所述對應的峰形圖如圖2所示，包括了第一和第二兩個色譜峰。其中，第一個色譜峰為hba1c峰，第二個色譜峰為hb峰。

s300：根據所述峰面積計算糖化血紅蛋白的含量。

具體的，可以通過如下算式來計算糖化血紅蛋白的含量：

hba1c%=s1/（s1+s2），其中，hba1c%為所述糖化血紅蛋白的濃度，s1為hba1c峰的峰面積，s2為hb峰的峰面積。

本發明還進一步的提供了上述實施例的層析試紙條的組裝方法。所述方法包括如下步驟：

首先，將硝酸纖維素膜和吸水濾紙分別粘貼在底板上；其中，所述吸水濾紙壓住所述硝酸纖維素膜2mm。然后，裁切樣本墊并將其一端與所述底板對齊，另一端壓在所述硝酸纖維素膜上方，形成試紙大板。最后，通過斬切機構，將所述試紙大板裁切為寬度為3-6mm的試紙條。其中，優選寬度為4mm