黃曲霉毒素B1適配體親和毛細管整體柱的制備及應用的制作方法

本發明涉及黃曲霉毒素b1的分離富集方法，具體涉及一種黃曲霉毒素b1適配體親和毛細管整體柱的制備方法及應用。

背景技術：

黃曲霉毒素b1（afb1）是主要由黃曲霉和寄生曲霉等產生的一種有毒代謝產物，已被國際癌癥研究機構(iarc)定為一級致癌物。黃曲霉毒素b1廣泛分布于各類農產品和食品中，其中最易受到污染的主要有花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等糧油食品。鑒于afb1的嚴重危害性，國內外相關組織對其制定了嚴格的限量標準。

目前黃曲霉毒素b1的檢測方法主要有薄層色譜法（tlc）、高效液相色譜法（hplc）、液質聯用法（lc-ms）、免疫分析法（ia）等。在眾多的方法中，hplc由于操作簡單，準確可靠，重復性好，已成為實驗室內黃曲霉毒素b1的主要檢測方法。但是由于農產品和食品樣品基體復雜，在采用hplc檢測黃曲霉毒素b1時，需要對提取液有一個分離純化的過程。由于相對高的親和力和特異性，免疫親和柱在分離純化和檢測分析中得到了廣泛的應用。然而，在親和色譜中，免疫抗體存在一些明顯的局限性，（1）抗體在固定相上的固定化仍然具有一定的挑戰性，固定的抗體在空間上的取向難以保持一致，影響抗體的親和力；（2）抗體易受外界條件的影響，在強親和力的親和色譜模式下，分離富集操作過程中經常需要改變溶液的ph、添加有機溶劑或變性劑等，劇烈的洗脫條件，可能會導致抗體失活，在很大程度上限制了方法的靈活應用；（3）抗體由于體積大，在固定相表面的覆蓋率小，導致免疫親和柱容量比較小；（4）抗體制備需要經過免疫動物實驗或細胞實驗、繁瑣費時、成本高。

技術實現要素：

本發明的目的是針對上述問題，提供一種黃曲霉毒素b1適配體親和毛細管整體柱，將氨基修飾的黃曲霉毒素b1適配體通過戊二醛偶聯接枝修飾于有機-無機雜化的氨基毛細管整體柱，用于待測樣品中黃曲霉毒素b1的高選擇性分離與富集。

本發明的技術方案如下：一種黃曲霉毒素b1適配體親和毛細管整體柱的制備方法，包括如下步驟：

（1）毛細管活化：用于制備整體柱的石英毛細管內徑為530μm，外徑為690μm。分別用1.0mol/l氫氧化鈉溶液沖洗毛細管4h，去離子水沖洗30min，1.0mol/l鹽酸溶液沖洗4h，然后再以去離子水洗至中性，在160℃下用氮氣吹干。

（2）整體柱的原位合成：首先將10~30mgctab溶于150~350μl無水乙醇和50~150μl去離子水的混合溶液中。然后將100~200μlteos和50~100μlaptes快速加入上述混合溶液中。室溫渦旋0.5~5min，然后放置在-5~5℃的水浴中超聲0.5~5min后，將混合溶液灌入上述活化處理過的毛細管中。最后，毛細管兩端以硅橡膠封口，放置于30~60℃烘箱中反應10~30h。

（3）整體柱的清洗：反應完成后，以甲醇和水充分清洗毛細管。

（4）戊二醛衍生：將含有5~20%戊二醛的磷酸緩沖溶液以5~20μl/min速率通入毛細管整體柱中，連續反應12h，然后用磷酸緩沖溶液沖洗掉殘留的戊二醛。

（5）修飾適配體：將黃曲霉毒素b1適配體制成濃度為4~8nmol/l的磷酸緩沖溶液，注入毛細管整體柱中反應8~12h，重復三次，用磷酸緩沖溶液沖洗掉未反應的適配體。最后用3~8mg/ml氰基硼氫化鈉沖洗整體柱6h，將制得的毛細管整體柱截取5cm的長度用于之后的固相微萃取操作。

上述的毛細管整體柱在分離富集黃曲霉毒素b1中的應用。

一種基于上述的毛細管整體柱分離富集黃曲霉毒素b1的方法，它是基于黃曲霉毒素b1的毛細管整體柱選擇性捕捉上樣液中的黃曲霉毒素b1，實現黃曲霉毒素b1的分離富集；其步驟是：

（1）毛細管活化：用10~20mmol/l的tris-hcl緩沖溶液平衡親和毛細管整體柱，將親和毛細管整體柱活化；

（2）上樣：將待測樣品溶液以10~100μl/min通入親和毛細管整體柱內；

（3）清洗：待樣品全部流經親和毛細管整體柱后，用10~20mmol/ltris-hcl緩沖液將柱內殘留和未被特異性捕獲的黃曲霉毒素b1淋洗下來；

（4）洗脫：用含有40~60%甲醇的tris-hcl緩沖溶液將被親和毛細管整體柱捕獲的黃曲霉毒素b1洗脫。

本發明的黃曲霉毒素b1適配體親和毛細管整體柱，將氨基修飾的黃曲霉毒素b1適配體通過戊二醛偶聯接枝修飾于有機-無機雜化的氨基毛細管整體柱，通過適配體與黃曲霉毒素b1特異性親和作用，有機-無機雜化整體柱高的柱滲透性和大的比表面積，可以高靈敏、高選擇性地分離、富集復雜食品樣品中痕量、超痕量黃曲霉毒素b1，與檢測儀器聯用可實現黃曲霉毒素b1簡便、靈敏、快速檢測。

附圖說明

圖1本發明實施例1適配體親和毛細管整體柱的掃描電子顯微鏡圖；

圖2本發明實施例4整體柱凈化后的色譜圖。

具體實施方式

本發明在有機-無機雜化毛細管整體柱的表面修飾并結合黃曲霉毒素b1適配體，然后用這種毛細管整體柱去分離富集黃曲霉毒素b1。以下實施例僅作為本發明內容的進一步說明，其中的實驗條件和設定參數不應視為本發明基本技術方案的局限。

實施例1黃曲霉毒素b1適配體親和毛細管整體柱的制備

（1）毛細管活化：用于制備整體柱的石英毛細管內徑為530μm，外徑為690μm。分別用1.0mol/l氫氧化鈉溶液沖洗毛細管4h，去離子水沖洗30min，1.0mol/l鹽酸溶液沖洗4h，然后再以去離子水洗至中性，在160℃下用氮氣吹干。

（2）整體柱的原位合成：首先將25mgctab溶于225μl無水乙醇和100μl去離子水的混合溶液中。然后將150μlteos和80μlaptes快速加入上述混合溶液中。室溫渦旋30s，然后放置在0℃的冰水浴中超聲30s后，將混合溶液灌入上述活化處理過的毛細管中。最后，毛細管兩端以硅橡膠封口，放置于40℃烘箱中反應20h。

（3）整體柱的清洗：反應完成后，以甲醇和去離子水充分清洗毛細管，以除去未反應的硅烷試劑和模板劑ctab。

（4）戊二醛衍生：配制含10%戊二醛的100mmol/l磷酸緩沖溶液（ph8.0），將該溶液以5μl/min的速率通入毛細管，連續反應12小時，然后用磷酸緩沖溶液沖洗掉殘留的戊二醛。

（5）適配體修飾：將黃曲霉毒素b1適配體溶于100mmol/l磷酸緩沖溶液，配制成5nmol/l的適配體溶液，然后以5μl/min速率通入毛細管，在4℃下反應8h，重復三次，用磷酸緩沖溶液沖洗掉未反應的適配體。最后用5mg/ml氰基硼氫化鈉溶液以5μl/min沖洗整體柱6h，將制得的整體柱截取5cm的長度用于之后的固相微萃取操作。

上述步驟中，黃曲霉毒素b1適配體的來源于實驗室合成，其堿基序列為：

5’-agcagcacagaggtcagatggtgctatcatgcgctcaatgggagactttagctg

cccccacctatgcgtgctaccgtgaa-3’，其中5'端通過c6間隔臂被-nh2修飾。

實施例2

首先采用與實施例1相同的步驟進行毛細管活化處理。然后，將10mgctab溶于150μl無水乙醇和50μl去離子水的混合溶液中，然后將100μlteos和50μlaptes快速加入上述混合溶液中。室溫渦旋5min，然后放置在-5℃的冰水浴中超聲5min后，將混合溶液灌入上述活化處理過的毛細管中。毛細管兩端以硅橡膠封口，放置于30℃烘箱中反應10h。反應完成后，以甲醇和去離子水充分清洗毛細管。

配制含5%戊二醛的磷酸緩沖溶液，將該溶液以10μl/min的速率通入毛細管，連續反應。在適配體修飾過程中，將黃曲霉毒素b1適配體制成濃度為4nmol/l的磷酸緩沖溶液，然后以5μl/min速率通入毛細管，在4℃下反應12h，重復三次，用磷酸緩沖溶液沖洗掉未反應的適配體。最后用3mg/ml氰基硼氫化鈉溶液以5μl/min沖洗整體柱6h，將制得的整體柱截取5cm的長度用于之后的固相微萃取操作。

實施例3

首先采用與實施例1相同的步驟進行毛細管活化處理。然后，將30mgctab溶于350μl無水乙醇和150μl去離子水的混合溶液中，然后將200μlteos和100μlaptes快速加入上述混合溶液中。室溫渦旋2min，然后放置在5℃的水浴中超聲2min后，將混合溶液灌入上述活化處理過的毛細管中。毛細管兩端以硅橡膠封口，放置于60℃烘箱中反應30h。反應完成后，以甲醇和去離子水充分清洗毛細管。

配制含20%戊二醛的磷酸緩沖溶液，將該溶液以20μl/min的速率通入毛細管，連續反應。在適配體修飾過程中，將黃曲霉毒素b1適配體制成濃度為8nmol/l的磷酸緩沖溶液，然后以5μl/min速率通入毛細管，在4℃下反應10h，重復三次，用磷酸緩沖溶液沖洗掉未反應的適配體。最后用8mg/ml氰基硼氫化鈉溶液以5μl/min沖洗整體柱6h，將制得的整體柱截取5cm的長度用于之后的固相微萃取操作。

實施例4黃曲霉毒素b1適配體親和毛細管整體柱的應用

（1）活化：用100μl10mmol/ltris-hcl平衡實施例1制備得到的親和整體柱，將親和整體柱活化。

（2）上樣：將500μl樣品溶液以10μl/min的速率通入整體柱內。

（3）清洗：待樣品全部流經親和柱后用50μl10mmol/ltris-hcl（ph=7.5）緩沖液將柱內殘留和未被特異性捕獲的黃曲霉毒素b1淋洗下來；

（4）洗脫：以20μl/min的速率，用含有40%甲醇的tris-hcl溶液，將被親和柱捕獲的黃曲霉毒素b1洗脫。

（5）上機檢測：采用高效液相色譜柱后衍生熒光檢測洗脫液中的黃曲霉毒素b1。色譜柱為c18反相色譜柱，檢測所采用的激發波長和發射波長分別為365nm和440nm。小麥加標樣品色譜分離圖如附圖2所示，其中橫坐標是保留時間，縱坐標是熒光強度。提取液加標量5μg/l濃度水平時，回收率為83.1~92.3%。

實施例5

采用與實施例4相同的步驟，對待測樣品中的黃曲霉毒素b1進行分離與富集，其不同點在于：其中采用20mmol/l的tris-hcl緩沖液，上樣速率為100μl/min，并用含60%甲醇的tris-hcl溶液進行洗脫處理。

本發明并不局限于上述實施方式，如果對本發明的改動或變型不脫離本發明的精神和范圍，倘若這些改動和變型屬于本發明的權利要求和等同技術范圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變型。