一種細胞釋放物的探測器及其探測方法與流程

本發明屬于微加工及生物檢測領域，涉及一種細胞釋放物的探測器及其探測方法。

背景技術：

生物傳感器具有靈敏度高，選擇性好，便攜操作性強，成本低，簡單，快捷等優點。隨著生活水平不斷提高，人們對健康的追求越來越高，開發新型檢測裝置成為熱點。微陣列傳感器具有高通量、高選擇性、高靈敏度，微型化，智能化、集成化，低成本，高穩定，高壽命等優點。

傳統的微電極陣列主要以金屬、玻璃、硅等剛性材料為基底，通過沉積、光刻、腐蝕等微加工手段在其上形成屏幕或者三維結構的微電極陣列。這些微電極雖然在空間分辨率、耐腐蝕性、靈敏度等方面具有各自的優勢，但是由于幾乎不具有形變能力，在柔軟度匹配、共形貼附、以及動態形變匹配等方面很難滿足植入式要求，因此正在逐步被柔性微電極陣列技術所取代。

基于可穿戴設備的研究，具有靶組織接觸良好，減免機械損傷，降低免疫排斥反應的柔性微陣列傳感器，是當今電子、機械、儀器和醫學等領域的研究熱點之一，直接關系到機器人、醫療設備、可穿戴設備等載體的智能化和多功能化。

石墨烯良好的生物相容性、優異的導電性和機械性能，以及良好的電化學活性，使其在柔性生物傳感應用方面展現出極大的優勢。基于石墨烯高柔韌性和機械強度，制備的石墨烯柔性電極，可以使電極與靶組織良好接觸，減少電極和生物組織之間的機械強度的不匹配，可以減少臨床應用中產生的機械損傷和免疫反應。此外，在神經組織工程中，具有較高電子傳導速率的石墨烯還可以作為細胞的刺激電極，在沒有太多的化學反應下，加強與分化神經元的電耦合，這使得石墨烯與活細胞的界面研究成為未來神經假體裝置研發的熱點。

技術實現要素：

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種細胞釋放物的探測器及其探測方法。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：包括柔性基底，所述柔性基底的曲率值為0.18，還包括負載于柔性基底內凹面的石墨烯膜，所述石墨烯膜由go基底和嵌于go基底中的rgo陣列組成，所述rgo陣列由直徑為20μm圓柱狀的rgo單元構成，相鄰兩個單元的間距為60μm(兩個臨邊之間的距離)。

進一步地，所述石墨烯膜通過以下方法負載于柔性基底上：

(1)以柔性ito/pet為基底，控制三次旋涂的轉速和時間分別為1000rpm，8000rpm，1000rpm以及5s，10s，5s，旋涂正性光刻膠，然后在60℃烘膠臺上烘15min，用直徑為20μm，間隔60μm的掩膜曝光20s，后烘10min，顯影液中顯影8s。

(2)在步驟1處理后的基底上繼續旋涂4mg/ml的氧化石墨烯溶液6次，每次旋涂go過程為800rpm，5s；3000rpm，30s；1000rpm，5s。使得go浸潤到光刻膠凹槽內部，旋涂均勻，得到附著go的柔性ito/pet基底。

(3)使用電化學工作站三電極系統還原附著基底表面的go，恒電位-0.9v，還原溶液體系為0.2mpbs(ph7.4)，還原50s。

(4)最后，將電化學還原得到的附著有rgo/go微電極陣列的柔性ito/pet基底放在丙酮溶液中沖洗，將光刻膠洗掉，上面的go薄膜落到柔性ito/pet基底，即得到圖案化rgo/go微電極陣列。

一種探測器檢測細胞釋放雙氧水的方法，使得細胞貼附于石墨烯膜上；然后進行循環伏安特性的測定，電解液為2.5mmk3fe(cn)6和0.1mkcl的水溶液。

本發明具有以下優點：實現了不同曲率柔性基底go/rgo陣列的電化學性能的研究，和傳統的負載酶和納米催化劑的情況下對雙氧水的低濃度檢測相比，顯示了較高的靈敏度，具有很好的應用前景。

附圖說明

圖1為go/rgo微陣列電極片的制備流程圖；

圖2為石墨烯微陣列的形貌結構；

圖3為不同曲率的伏安特性曲線；

圖4為k<0細胞對雙氧水的檢測曲線；

圖5為內凹面和外凸面示意圖。

具體實施方式

本發明提供了提供一種基于柔性基底go/rgo陣列電極的彎曲曲率對細胞釋放物的探測器的制備方法。包括以下內容：

柔性基底上rgo/go微陣列的制備：以柔性ito/pet為基底，控制三次旋涂的轉速和時間分別為1000rpm，8000rpm，1000rpm以及5s，10s，5s，旋涂正性光刻膠，然后在60℃烘膠臺上烘15min，紫外光刻機掩膜曝光20s，后烘10min，顯影液中顯影8s，得到光刻膠微陣列。接著，在步驟1得到的光刻膠微陣列的基底上繼續旋涂4mg/ml的氧化石墨烯溶液6次，每次旋涂go的轉速和時間分別為800rpm，3000rpm，1000rpm以及5s，30s，5s。每次旋涂都將go在光刻膠表面輕輕吹打，使得go浸潤到光刻膠凹槽內部，旋涂均勻，得到附著go的柔性ito/pet基底。使用電化學工作站三電極系統還原附著基底表面的go，恒電位-1v，還原溶液體系為0.2mpbs(ph7.4)，還原50s。最后，將電化學還原得到的附著有rgo/go微電極陣列的柔性ito/pet基底放在丙酮溶液中沖洗，將光刻膠洗掉，上面的go薄膜落到柔性ito/pet基底，即得到圖案化rgo/go微電極陣列。

將電極片置于十二孔板內，石墨烯膜所在的活性面朝上，滅菌后，放置到十二孔板內，依次用pbs，dmem清洗，然后使用10％含血清培養液37℃孵化30min，最后接種細胞，接種密度約6000個/ml，37℃，5％co2細胞培養箱中培養24h。

取電極片兩片進行彎曲，彎曲呈曲率0.18，一片的活性面(貼附有細胞的石墨烯面)位于內凹面，另一片位于外凸面。使用藥物pma(15μl0.5μg/l)刺激兩個微電極的表面細胞，通過觀察電流的變化，實現go/rgo電極對細胞釋放物的檢測。結果發現，相同刺激條件下，內凹面細胞負載具有更高的靈敏度，推測其原因，內凹面更傾向于形成三維環繞，增加接收電信號的能力。

將負載有細胞的電極片彎曲，使得石墨烯膜位于電極片的內凹面，曲率分別為0.06、0.08、0.10、0.12、0.18、0.25。分別進行電極的循環伏安特性的測定，電解質為2.5mmk3fe(cn)6和0.1mkcl的混合溶液。圖3為不同曲率的伏安特性曲線。

將負載有細胞的電極片彎曲，使得石墨烯膜位于電極片的內凹面，曲率分別為0.06、0.1、0.18、0.25，進行釋放物檢測：使用藥物pma(15μl0.5μg/l)刺激不同曲率的微電極表面細胞，通過觀察電流的變化，實現go/rgo電極對細胞釋放物的檢測。測定結果表明，k<0.18情況下，曲率增大效果增強，當k>0.18時，檢測效果減弱。分析其中原因，在彎曲情況下，電極表面電場分部發生變化，導致測定結果差異；圖4為曲率值k為0.06、0.1、0.18、0.25情況下細胞對雙氧水的檢測曲線，檢測限降低，靈敏度增加，而當k>0.18時，隨著曲率值的增大，靈敏度降低。

上述實例用來解釋說明本發明，然而并非限定本發明。在本發明的精神和權利要求的保護范圍內，對本發明作出的任何修改和改變，都落入本發明的保護范圍。