自閉癥生物標志物及其檢測試劑盒的制作方法

本發明屬于生物醫藥領域，具體地，本發明涉及自閉癥生物標志物及其檢測試劑盒。

背景技術：

自閉癥(asd，autismspectrumdisorders)或稱孤獨癥或者孤獨癥譜系障礙，是廣泛性發育障礙的一種亞型，以男性多見，起病于嬰幼兒期，主要表現為不同程度的言語發育障礙、人際交往障礙、興趣狹窄和行為方式刻板，約有3/4的患者伴有明顯的精神發育遲滯。據美國疾病監控與預防中心(cdc)數據，2015年其發病率1/45(即2.24％)。我國尚缺乏全國性流行病調查數據，若以1/100估算，預估我國asds患者將超過1000萬。

自閉癥(asd)作為一種兒童精神疾病嚴重影響患兒的社會功能，給患兒家庭和社會帶來沉重負擔，但是目前自閉癥通常根據量表進行評估，沒有血液診斷方法和有效的治療方案，這樣診斷將依靠主觀經驗判斷，不僅不能對自閉癥的發病提供有效預警，而且診斷準確率很低。因此研究自閉癥發病機理和可以體現其嚴重程度的生物標志物，并及時針對病因進行干預與治療是治療疾病、減輕社會負擔的關鍵因素。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是提供了自閉癥生物標志物；本發明還提供了用于診斷自閉癥的試劑盒；本發明進一步還提供一種篩選易患自閉癥的生物樣品的系統。

本發明第一方面提供了自閉癥生物標志物，其包括腸道中的iga水平。

本發明第二方面提供了所述的生物標志物在篩選易患自閉癥的生物樣品的系統中的應用。

本發明第三方面提供了檢測腸道中的iga水平的試劑組合在制備用于診斷自閉癥的試劑盒中的用途。

在一優選例中，所述檢測腸道中的iga水平的試劑組合包括elisa檢測試劑。

在一優選例中，所述elisa檢測試劑包括含1ug/ml羊抗人iga，igg，igm(h+l)抗體的磷酸鹽緩沖液。

在一優選例中，所述elisa檢測試劑還包括hrp標記的羊抗人iga的溶液，其是采用品牌為jackson且貨號為109-036-011的hrp標記的羊抗人iga以體積比1∶10000稀釋于含2.5％脫脂牛奶的pbs中獲得。

在一優選例中，所述elisa檢測試劑還包括含0.2％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。

在一優選例中，所述elisa檢測試劑還包括含2.5％脫脂牛奶的磷酸鹽緩沖液。

在一優選例中，所述elisa檢測試劑還包括磷酸緩沖鹽溶液。

在一優選例中，所述elisa檢測試劑還包括tmb顯色液。

在一優選例中，所述elisa檢測試劑還包括終止液。

在一優選例中，所述終止液為濃度為2m的h2so4溶液。

在一優選例中，所述用于診斷自閉癥的試劑盒的使用包括以下步驟：

獲取來自受測個體腸道的第一生物樣品和來自正常個體腸道的第二生物樣品；

將第一生物樣品和第二生物樣品進行勻漿處理從而提取上清；

將上清分別進行等同稀釋后進行elisa檢測；

根據elisa檢測的結果對第一生物樣品和第二生物樣品所含的腸道中的iga水平進行差異顯著性分析。

在一優選例中，所述第一生物樣品和第二生物樣品均為腸道固體排泄物。

在一優選例中，將第一生物樣品和第二生物樣品進行勻漿處理從而提取上清包括如下步驟：所述稱取健康對照和自閉癥患者的糞便各0.3克左右，均用兩倍體積的磷酸緩沖鹽溶液進行勻漿處理，然后20000g離心10分鐘，取上清作為生物樣本提取液。

在一優選例中，所述elisa檢測包括如下步驟：

步驟一：在elisa反應板中加入含1ug/ml羊抗人iga，igg，igm(h+l)抗體的pbs，4℃密封孵育16小時；拍干反應板，用含0.2％吐溫-20的pbs洗滌板孔，拍干反應板，再用含0.2％吐溫-20的pbs洗滌板孔，拍干反應板，得到包被好的elisa板；

步驟二：在包被好的elisa板孔中加入75ul含2.5％脫脂牛奶的pbs和25ul生物樣本提取液于反應板孔中，于37℃孵育1小時；

步驟三：用含0.2％吐溫20的pbs洗滌elisa板孔，拍干反應板，重復四次。洗板后在各反應板孔加入100ulhrp標記的羊抗人iga的溶液于37℃孵育1小時；

步驟四：用含0.2％吐溫-20的pbs洗滌板孔，拍干反應板，重復五次。洗板后在各反應板孔均加入tmb顯色液100ul顯色，置于37℃保溫15min，然后每孔加入50ul終止液終止反應；

步驟五：分別于終止后，將各反應板置酶標儀中，讀取od450值。

本發明第四方面提供了一種自閉癥檢測試劑盒，包括適用于檢測權利要求1所述的生物標志物的試劑。

在一優選例中，還包括分析所述生物標志物在體內是否異常的工具。

在一優選例中，所述適用于檢測權利要求1所述的生物標志物的試劑包括elisa檢測試劑。

在一優選例中，所述elisa檢測試劑包括含1ug/ml羊抗人iga，igg，igm(h+l)抗體的磷酸鹽緩沖液。

在一優選例中，所述elisa檢測試劑還包括hrp標記的羊抗人iga的溶液，其是采用品牌為jackson且貨號為109-036-011的hrp標記的羊抗人iga以體積比1∶10000稀釋于含2.5％脫脂牛奶的pbs中獲得。

在一優選例中，所述elisa檢測試劑還包括含0.2％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。

在一優選例中，所述elisa檢測試劑還包括含2.5％脫脂牛奶的磷酸鹽緩沖液。

在一優選例中，所述elisa檢測試劑還包括磷酸緩沖鹽溶液。；

在一優選例中，所述elisa檢測試劑還包括tmb顯色液。

在一優選例中，所述elisa檢測試劑還包括終止液。

在一優選例中，所述終止液為濃度為2m的h2so4溶液。

在一優選例中，所述試劑盒的使用包括以下步驟：

獲取來自受測個體腸道的第一生物樣品和來自正常個體腸道的第二生物樣品；

將第一生物樣品和第二生物樣品進行勻漿處理從而提取上清；

將上清分別進行等同稀釋后進行elisa檢測；

根據elisa檢測的結果對第一生物樣品和第二生物樣品所含的腸道中的iga水平進行差異顯著性分析；

任選的，所述第一生物樣品和第二生物樣品均為腸道固體排泄物；

在一優選例中，將第一生物樣品和第二生物樣品進行勻漿處理從而提取上清包括如下步驟：所述稱取健康對照和自閉癥患者的糞便各0.3克左右，均用兩倍體積的磷酸緩沖鹽溶液進行勻漿處理，然后20000g離心10分鐘，取上清作為生物樣本提取液。

在一優選例中，所述elisa檢測包括如下步驟：

步驟一：在elisa反應板中加入含1ug/ml羊抗人iga，igg，igm(h+l)抗體的pbs，4℃密封孵育16小時；拍干反應板，用含0.2％吐溫-20的pbs洗滌板孔，拍干反應板，再用含0.2％吐溫-20的pbs洗滌板孔，拍干反應板，得到包被好的elisa板；

步驟二：在包被好的elisa板孔中加入75ul含2.5％脫脂牛奶的pbs和25ul生物樣本提取液于反應板孔中，于37℃孵育1小時；

步驟三：用含0.2％吐溫20的pbs洗滌elisa板孔，拍干反應板，重復四次。洗板后在各反應板孔加入100ulhrp標記的羊抗人iga的溶液于37℃孵育1小時；

步驟四：用含0.2％吐溫-20的pbs洗滌板孔，拍干反應板，重復五次。洗板后在各反應板孔均加入tmb顯色液100ul顯色，置于37℃保溫15min，然后每孔加入50ul終止液終止反應；

步驟五：分別于終止后，將各反應板置酶標儀中，讀取od450值。

本發明第五方面提供了所述的試劑盒在篩選易患自閉癥的生物樣品的系統中的應用。

本發明第六方面提供了一種篩選易患自閉癥的生物樣品的系統，包括：

勻漿處理裝置，所述勻漿處理裝置用于將待測樣品和對照樣品進行勻漿處理從而提取上清；

elisa檢測裝置，所述elisa檢測裝置與所述勻漿處理裝置相連，用于檢測待測樣品和對照樣品各自上清經elisa檢測試劑處理后的酶標值；以及

分析裝置，所述分析裝置與所述elisa檢測裝置相連，基于酶標值對其所含的生物標志物進行差異顯著性分析，根據分析結果判斷所述生物樣品是否易患自閉癥。

在一優選例中，所述待測樣品和對照樣品均為腸道固體排泄物。

在一優選例中，將待測樣品和對照樣品進行勻漿處理包括如下步驟：稱取所述待測樣品和對照樣品各0.3克左右，均用兩倍體積的磷酸緩沖鹽溶液進行勻漿處理，然后20000g離心10分鐘，取上清作為生物樣本提取液。

在一優選例中，所述檢測待測樣品和對照樣品各自上清經elisa檢測試劑處理后的酶標值包括如下步驟：

步驟一：在elisa反應板中加入含1ug/ml羊抗人iga，igg，igm(h+l)抗體的pbs，4℃密封孵育16小時；拍干反應板，用含0.2％吐溫-20的pbs洗滌板孔，拍干反應板，再用含0.2％吐溫-20的pbs洗滌板孔，拍干反應板，得到包被好的elisa板；

步驟二：在包被好的elisa板孔中加入75ul含2.5％脫脂牛奶的pbs和25ul生物樣本提取液于反應板孔中，于37℃孵育1小時；

步驟三：用含0.2％吐溫20的pbs洗滌elisa板孔，拍干反應板，重復四次。洗板后在各反應板孔加入100ulhrp標記的羊抗人iga的溶液于37℃孵育1小時；

步驟四：用含0.2％吐溫-20的pbs洗滌板孔，拍干反應板，重復五次。洗板后在各反應板孔均加入tmb顯色液100ul顯色，置于37℃保溫15min，然后每孔加入50ul終止液終止反應；

步驟五：分別于終止后，將各反應板置酶標儀中，讀取od450值。

在本文中，術語“生物標志物”應做廣義理解，其包括任何能夠反映異常狀態的任何可檢測生物指標，可以包含基因標志物，物種標志物(種標志物/屬標志物)以及功能標志物(ko/og標志物)，其具有非常廣泛的用途，可用于疾病診斷、判斷疾病分期或者用來評價新藥或新療法在目標人群中的安全性及有效性。

本發明具有以下有益效果：

本發明首次發現自閉癥的致病與腸道中的iga含量有關，因此將腸道中的iga含量作為自閉癥的檢測標志物，這樣自閉癥的診斷將不依靠主觀經驗判斷，不僅可以對自閉癥的發病提供有效預警，而且可對其進行確診，克服了自閉癥的診斷較大程度的依賴于主觀經驗判斷的缺陷，極大提高了診斷準確率。

附圖說明

圖1是實施例1中發現階段自閉癥組和對照組的腸道iga含量的對比圖，其elisa檢測時采用標本1(1∶4)，縱軸代表od450值，每個點代表一個樣品。***代表p值小于0.0001，t檢驗。

圖2是實施例1中發現階段自閉癥組和對照組的腸道iga含量的對比圖，其elisa檢測時采用標本2(1∶40)，縱軸代表od450值，每個點代表一個樣品。***代表p值小于0.0001，t檢驗。

圖3是實施例1中驗證階段自閉癥組和對照組的腸道iga含量的對比圖，其elisa檢測時采用標本1(1∶4)，縱軸代表od450值，每個點代表一個樣品。***代表p值小于0.0001，t檢驗。

圖4是實施例1中驗證階段自閉癥組和對照組的腸道iga含量的對比圖，其elisa檢測時采用標本2(1∶40)，縱軸代表od450值，每個點代表一個樣品。***代表p值小于0.0001，t檢驗。

具體實施方式

除非特殊說明，本發明所用術語具有本發明所屬領域中的一般含義。

下面參考具體實施例和附圖，對本發明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發明的限制。實施例中未注明具體技術或條件的，均按照常規實驗條件，如sambrook等分子克隆實驗手冊(sambrookj&russelldw，molecularcloning：alaboratorymanual，2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。

實施例1

本實施例運用elisa檢測分析健康人群和自閉癥患者的糞便樣本，繼而進行統計檢驗，從而確定與自閉癥患者群相關的生物標志物。具體步驟如下：

1.樣品來源

自閉癥組：來自深圳市兒童醫院心理科及言語治療科門診asd患兒，收集時間為2015年7～12月。納入標準：①根據國際最新診斷標準，即《美國精神障礙診斷與統計手冊第5版》(diagnosticandstatisticalmanualofmentaldisorders，5thedition，dsm-5)，診斷為asd”需要非常多支持”的患兒；②年齡＜14歲；③性別不限。排除標準：①患有其他精神疾病(如精神分裂癥等)；②患有其他神經發育障礙疾病；③患有遺傳代謝性疾病；④患有嚴重神經疾病以及顱腦損傷史等重大軀體疾病史。

對照組：來自深圳市兒童醫院兒保科體檢兒童。納入標準：①無精神疾病，身體健康；②與患者組年齡及性別匹配。排除標準同患者組。所有入組兒童家長對本研究知情并簽署知情同意書。

本研究經深圳市兒童醫院倫理委員會批準。

本研究分兩期：發現階段和驗證階段。

第一期為發現階段，共收集22例自閉癥患兒，男18例，女4例；年齡2～6歲，平均(2±1)歲。共收集15名對照兒童，男8名，女7名；年齡1～6歲，平均(2±1)歲。兩組性別(fisher精確檢驗p＞0.05)、年齡(student’sttest，p＞0.05)差異無統計學意義。

第二期為驗證階段，收集22例自閉癥患兒，男18例，女3例；年齡2～6歲，平均(2±1)歲。共收集16名對照兒童，男9名，女7名；年齡1～6歲，平均(2±1)歲。兩組性別(fisher精確檢驗，p＞0.05)、年齡(student’sttest，p＞0.05)差異無統計學意義。

2.糞便采集與獲取上清

稱取健康對照和自閉癥患者的糞便各0.3克左右，均用兩倍體積的pbs(磷酸緩沖鹽溶液，phosphatebuffersaline))進行勻漿處理，然后20000g離心10分鐘，取上清作為生物樣本提取液，進行后續iga含量檢測。

3.elisa檢測

(1)反應板包被：在elisa反應板(品牌為coming，貨號為9018)中加入含1ug/ml羊抗人iga，igg，igm(h+l)抗體(品牌為jackson，貨號為109-006-064)的pbs，4℃密封孵育16小時；拍干反應板，用含0.2％吐溫-20的pbs洗滌板孔，拍干反應板，再用含0.2％吐溫-20的pbs洗滌板孔，拍干反應板，得到包被好的elisa板。

(2)加入標本：在包被好的elisa板孔中加入標本1(1∶4)，或標本2(1∶40)于反應板孔中，于37℃孵育1小時。

所述標本1(1∶4)包括75ul含2.5％脫脂牛奶的pbs和25ul生物樣本提取液；所述標本2(1∶40)包括97.5ul含2.5％脫脂牛奶的pbs和2.5ul生物樣本提取液。

(3)加入酶標抗體：用含0.2％吐溫20的pbs洗滌elisa板孔，拍干反應板，重復四次，洗板后在各反應板孔加入100ulhrp標記的羊抗人iga的溶液(hrp標記的羊抗人iga，具有α鏈特異性，品牌為jackson貨號為109-036-011，其以體積比1∶10000稀釋于含2.5％脫脂牛奶的pbs中得到hrp標記的羊抗人iga的溶液)于37℃孵育1小時。

(4)顯色：用含0.2％吐溫-20的pbs洗滌板孔，拍干反應板，重復五次，洗板后在各反應板孔均加入tmb顯色液100ul顯色，置于37℃保溫15min，然后每孔加入50ul終止液(2m硫酸)終止反應。

(5)檢測：分別于終止后，將各反應板置酶標儀中，讀取od450值。

上述各步驟涉及到的試劑的配制方法如下：

pbs：稱取磷酸二氫鉀(kh2po4)0.2g，磷酸氫二鈉(na2hpo4·12h20)2.9g，氯化鈉(nacl)8.0g，氯化鉀(kcl)0.2g，加水至1000ml。

含0.2％吐溫-20的pbs：稱取磷酸二氫鉀(kh2po4)0.2g，磷酸氫二鈉(na2hpo4·12h20)2.9g，氯化鈉(nacl)8.0g，氯化鉀(kcl)0.2g，吐溫-202ml，加水至1000ml。

含2.5％脫脂牛奶的pbs：稱取磷酸二氫鉀(kh2po4)0.2g，磷酸氫二鈉(na2hpo4·12h20)2.9g，氯化鈉(nacl)8.0g，氯化鉀(kcl)0.2g，脫脂奶粉25g，加水至1000ml。

4.統計分析

通過t檢驗法分析自閉癥組和對照組的iga水平是否差異顯著。

結果：

(1)發現階段

第一期為發現階段，共收集22例患兒，男18例，女4例；年齡2～6歲，平均(2±1)歲。共收集15名對照兒童。發現階段，通過t檢驗法分析發現，自閉癥患者腸道排泄物iga總含量顯著高于健康對照，1∶4和1∶40兩個稀釋度的檢測結果差異的p值均小于0.0001.自閉癥患者糞便中iga含量顯著高于健康對照，如圖1和圖2所示。

(2)驗證階段

第二期為驗證階段，收集22例患兒，16名對照兒童，通過t檢驗法分析發現，自閉癥患者腸道排泄物iga總含量顯著高于健康對照，1∶4稀釋度的檢測結果差異的p值均小于0.05，如圖3和圖4所示。

綜上所述，自閉癥患者腸道排泄物iga總含量顯著高于健康對照，通過elisa方法且采用標本1(1∶4)來檢測糞便iga總含量在疾病組和對照組差異顯著(p值小于0.05)，可以作為疾病診斷標志物，或者作為疾病治療的靶標，或者作為治療評估的指標，為自閉癥的診斷和治療提供新的思路。