一種快速篩選砷離子核酸適配體的方法及應用與流程

本發明屬于環境安全監測領域，具體涉及一種能快速篩選砷離子核酸適配體的方法以及在砷離子檢測中的應用。

背景技術：

砷是一種有毒重金屬，對于動植物有強烈的毒害作用，在土壤、和水中可不斷累積，造成嚴重污染。對于重金屬的檢測，當前已經發展了多種檢測手段，如原子吸收光譜法、熒光法、電化學法、生物傳感器法等方法。目前砷的檢測方法有化學法與儀器法，化學法包括砷斑法、銀鹽法，由于化學法方法繁瑣、靈敏度不高，不適應現代發展的需要；儀器法雖有較高的準確性，但其所需儀器昂貴，且需要專業人員的操作，很難滿足現場快速檢測的需要。

核酸適配體是一種對靶標分子具有高度特異性結合能力的功能核酸片段，已被廣泛應用于重金屬、毒素分子等多種物質的檢測。指數富集的配體系統進化技術(selex)技術是篩選核酸適配體的一種主流技術。目前國際上基于該技術篩選了一條具有高度親和力的as³⁺適配體,然而篩選所需的核酸文庫巨大，篩選過程繁瑣，費時費力，對操作人員有嚴格的技術要求。而所篩選的as³⁺適配體序列包含100個核苷酸，核苷酸鏈過長，合成成本較高，也影響載體表面的固定化，限制其在砷檢測中的應用。因此，有必要發展一種簡單快速的適配體篩選方法，對砷離子的適配體進行進一步的篩選和優化。

技術實現要素：

本發明為了解決上述問題，目的在于提供一種簡便、快速的適配體篩選方法，對砷離子的核酸適配體進行快速優化，以克服現有適配體篩選技術耗時長、技術要求高的不足。

一種基于金納米粒子的比色法反應體系，用于篩選最適合檢測砷離子的核酸適配體序列，其特征在于，包括：核酸序列；納米金溶液；以及氯化鈉溶液，其中，核酸序列為

as-40：ttacagaacaaccaacgtcgctccgggtacttcttcatcg，

as-40-2：ttacagaacaaccaacccgggtacttcttcatcg，

as-40-4：tagggagataccagc，

as-40-6：ttacagaacaaccggtacttcttcatcg。

本發明提供的篩選砷離子適配體的比色反應體系，還可以具有這樣的特征，其特征在于：其中，核酸序列的濃度為0.01～1.00μmol/l。

本發明提供的篩選砷離子適配體的比色反應體系，還可以具有這樣的特征，其特征在于：其中，納米金溶液的濃度為10～20nmol/l。

本發明提供的篩選砷離子適配體的比色反應體系，還可以具有這樣的特征，其特征在于：其中，氯化鈉溶液的濃度為0.1～0.9mol/l。

本發明提供的比色法檢測砷離子的核酸序列反應體系，還可以具有這樣的特征，其特征在于：其中，核酸序列為5’-ttacagaacaaccaacgtcgctccgggtacttcttcatcg-3’。

本發明提供的一種具有上述技術特征的篩選砷離子適配體的比色方法及利用所篩選適配體進行砷離子濃度檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一，在向納米金溶液中加入待篩選的核酸適配體溶液后混勻；

步驟二，將步驟一所得到的混合溶液和已知濃度的亞砷酸鈉溶液混勻，并孵育一段時間后得到混合溶液；

步驟三，將步驟二中的混合溶液和特定濃度的氯化鈉溶液混勻，室溫反應5min，觀察樣品的顏色變化，拍照記錄，并測定混合后的溶液對特定波長可見光的吸光度比值，得到砷離子濃度-吸光度比值標準曲線；

步驟四，將另外待篩選的核酸適配體溶液替換步驟二中的適配體溶液，重復步驟一、二、三，得到該適配體反應體系中的顏色變化照片以及對應的砷離子濃度-吸光度比值標準曲線；

步驟五，比較四種適配體反應體系的顏色變化以及砷離子濃度-吸光度比值標準曲線，可獲得最適合檢測砷離子的適配體。

步驟六，將未知濃度的砷離子溶液替換步驟二中已知濃度的亞砷酸鈉溶液，重復步驟一、二、三，得到其在特定波長可見光的吸光度比值，根據該適配體體系的砷離子濃度-吸光度比值標準曲線，可獲得待測溶液中的砷離子濃度。

本發明提供的適配體篩選方法，還可以具有這樣的特征，其特征在于：其中，步驟二和步驟三中混合的時間為5min，溫度為室溫25℃。

本發明提供的適配體篩選方法，還可以具有這樣的特征，其特征在于：其中，步驟三中的吸光度比值測定的波長為650nm、520nm，吸光度比值為a650/a520。

本發明還提供具有上述的技術特征的比色法檢測砷離子的核酸序列反應體系在檢測砷離子濃度中的應用，其特征在于：其中，砷離子為水溶液中的正三價砷離子，其濃度為0.01-1.00mmol/l。

發明作用與效果

根據本發明所提供的篩選砷離子適配體的比色反應體系，操作簡單，輔助試劑：納米金、氯化鈉比較容易獲得，可通過裸眼判斷或者使用成本較低的分光光度計進行測量，大大降低了適配體的篩選難度；本發明篩選獲得的適配體序列長度靈活，避免了pcr擴增引物的限制，有效縮短適配體序列長度，降低適配體的合成成本，有利于固定化應用。本發明提供的比色反應體系還可以用于進行砷離子的快速檢測。

附圖說明

圖1為適配體as-40與不同濃度砷離子的反應結果照片；

圖2為圖1的砷離子濃度-吸光度比值曲線；

圖3為適配體as-40-2與不同濃度砷離子的反應結果照片；

圖4為圖3的砷離子濃度-吸光度比值曲線；

圖5為適配體as-40-4與不同濃度砷離子的反應結果照片；

圖6為圖5的砷離子濃度-吸光度比值曲線；

圖7為適配體as-40-6與不同濃度砷離子的反應結果照片；以及

圖8為圖7的砷離子濃度-吸光度比值曲線。

具體實施方式

為了使本發明實現的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解，以下實施例結合附圖對本發明的砷離子核酸適配體的篩選反應體系的具體實例作具體闡述。

實施例

本實施例所用的核酸序列是使用已知的經典的亞磷酰胺三酯法進行化學合成的。其序列如下所示：

as-40：ttacagaacaaccaacgtcgctccgggtacttcttcatcg，

as-40-2：ttacagaacaaccaacccgggtacttcttcatcg，

as-40-4：tagggagataccagc，

as-40-6：ttacagaacaaccggtacttcttcatcg。

1、標準物質溶液的制備

稱取不同質量的氯化鈉用雙蒸水配成不同濃度的氯化鈉溶液(0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mol/l)；合成的dna核酸序列(as-40、as-40-2、as-40-4、as-40-6)用雙蒸水稀釋成梯度濃度的適配體溶液(0、0.1、0.3、0.5、1μmol/l)；稱取不同質量的亞砷酸鈉用雙蒸水配成所需濃度的亞砷酸鈉溶液(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1mmol/l)。

2、適配體as-40對不同濃度砷離子的檢測步驟

50μlaunps加入50μl濃度為0.1-1μm的適配體as-40溶液，混勻，室溫反應5min；在其中加入50μl不同濃度的亞砷酸鈉溶液(0-1mmol/l)，放置反應5min；最后加入10μl0.7mol/l的氯化鈉溶液，使得溶液總體積為160μl，混勻，室溫放置5min。觀察實驗結果顏色變化，拍照記錄結果(圖1)，并使用紫外可見光分光光度計測量特定波長的吸光度，計算波長為650nm和520nm的吸光度比值a650/a520，得到砷離子濃度-吸光度比值標準曲線(圖2)。

3、適配體的篩選

將其它待篩選的適配體as-40-2，as-40-4和as-40-6分別替換實施例2中的適配體as-40，所得實驗結果依次如圖3-8所示。經過對比，得知適配體as-40的檢測效果最佳。

4、砷離子的檢測

50μl未知濃度的砷離子溶液(在0.1–0.5mmol/l范圍內)代替實施例2中已知濃度的亞砷酸鈉溶液，所得實驗結果與對應適配體的標準曲線進行比對，得知所檢測的砷離子濃度。

實施例的作用和有益效果

根據本實施例所提供的比色法篩選砷離子適配體的反應體系，篩選過程操作簡單，篩選速度快，避免了pcr擴增，可以篩選較短的核酸序列，降低了適配體的合成成本，擴展了砷適配體的固定化應用；而且輔助試劑：納米金、氯化鈉也比較容易獲得；另外本實施例提供的比色反應體系還可以用于檢測砷離子，通過成本較低的分光光度計就可以測量，檢測成本較低，適合快速檢測。

本實施例中，砷離子為水溶液中的正三價砷離子(亞砷酸鈉)，其濃度為為0.01-1.00mmol/l。