一種基于稀土上轉換發光強度比的熒光染料濃度的探測方法與流程

本發明涉及一種熒光染料濃度的測定方法，具體地說是一種基于輻射能量傳遞過程的稀土離子上轉換發光強度比的技術，可用于進行與稀土離子具有能量傳遞的熒光染料的探測。

背景技術：

近年來由于稀土離子發光具有尖銳的發射、較大的stokes位移和較長的熒光壽命，使得稀土摻雜發光材料在照明、可視化應用、光通訊和生物醫學等領域引起了人們極大的興趣。稀土摻雜上轉換發光材料由于通過多光子吸收過程能夠將低能量光子轉變為高能量光子，使得其在生物醫學、光催化、太陽能電池和光學傳感等領域得到廣泛應用。其中，稀土上轉換發光還具有生物組織穿透深度大、光損傷小、響應快速、空間分辨率高以及光漂白弱和背景噪聲小等特性，在生物探測領域受到越來越多的關注(文獻1：f.wang,x.g.liu,chemicalsocietyreviews,2009,38,976)。

基于稀土上轉換發光的熒光染料傳感器通過稀土離子到熒光染料分子的能量傳遞進行熒光染料的探測，這種能量傳遞要求稀土離子的發射光譜和熒光染料分子的吸收光譜之間有重疊。稀土離子到熒光分子的能量傳遞主要有熒光共振能量傳遞(fluorescenceresonanceenergytransfer-fret)和輻射能量傳遞(radiativeenergytransfer-ret)兩種途徑。fret是一種從稀土離子到熒光染料分子的無輻射能量傳遞過程，由于fret效率與兩者間距離的六次方成反比，一般稀土離子與熒光染料分子的距離必須小于幾個納米(文獻2：h.edelhoch,l.brand,m.wilchek,biochemistry,1967,6,547)。為了實現這種納米級的距離要求，人們通常采用非常復雜的方法將稀土摻雜上轉換發光材料和熒光染料分子進行連接，導致基于fret的生物傳感器制備工藝十分復雜，加工性差(文獻3：j.l.liu,y.liu,q.liu,c.y.li,l.n.sun,f.y.li,journaloftheamericanchemicalsociety,2011,133,15276)。由于進行生物探測的環境常常為水溶液環境，而稀土上轉換發光對水環境非常敏感容易引起熒光猝滅，因此基于fret的生物傳感器發光效率很低，穩定性較差(文獻4：s.xu,w.xu,y.f.wang,s.zhang,y.s.zhu,l.tao,etal.,nanoscale,2014,6,5859)。此外，由于基于fret的生物傳感器需要將稀土摻雜上轉換發光材料和熒光染料分子進行連接，使得這種傳感器再生性差，不可重復使用。

而ret是一種稀土離子的發光被熒光染料分子再吸收的過程，稀土離子發光可以遠距離傳播到熒光染料分子并被其再吸收，消除了fret要求的稀土摻雜上轉換發光材料和熒光染料分子之間距離必須為納米級的限制，因此不須進行稀土摻雜上轉換發光材料與熒光染料分子的復雜連接，使得稀土摻雜生物傳感器的制備工藝大大簡化。此外，由于ret可以使得稀土發光遠距離傳播到熒光染料分子，因此稀土摻雜上轉換發光材料可以不與熒光染料分子直接接觸，從而避免了水環境造成的稀土離子上轉換發光的猝滅效應，能夠有效提高稀土上轉換發光強度。由于基于ret的稀土摻雜生物傳感器不需要進行稀土摻雜上轉換發光材料與熒光染料分子的連接，使得稀土摻雜上轉換發光材料可重復使用，大大降低了傳感器的損耗。

目前，基于稀土上轉換發光的生物傳感器大部分都是通過測量熒光染料分子的發光對其濃度進行探測(文獻4：s.xu,w.xu,y.f.wang,s.zhang,y.s.zhu,l.tao,etal.,nanoscale,2014,6,5859)，由于熒光染料分子的發光來自稀土離子到熒光染料分子的能量傳遞，而不論是fret還是ret其效率都不高，因此熒光染料分子的發光普遍較弱，造成測量誤差較大和檢測靈敏度較低。由于熒光染料分子發光來自于稀土離子的能量傳遞，因此也可以通過稀土離子的發光建立起與熒光染料分子之間的聯系，從而實現熒光染料濃度的探測(文獻5：y.h.wang,l.bao,z.h.liu,d.w.pang,analyticalchemistry,2011,83,8130)。然而稀土離子的上轉換發光常常受到基質材料、發光能級、材料尺度、激發條件和外部環境和儀器條件變化等因素的影響，導致稀土離子的上轉換發光強度受到上述因素的影響而不能進行精確測量，使得基于稀土上轉換發光強度的生物傳感器誤差較大。而熒光強度比技術(fluorescenceintensityratio-fir)則能夠很好地消除上述因素的干擾，其是一種通過采集與待測量有關的兩個不同波長的發光強度，以兩者的比值作為表征參數的方法，因此基于fir技術的光學傳感器具有較高的靈敏度和分辨率。目前，基于fir技術的稀土摻雜光學溫度傳感器已經得到成功的應用并有著較高的溫度靈敏度(文獻6：x.f.wang,q.liu,y.y.bu,c.s.liu,t.liu,x.h.yan,rscadvances,2015,5,86219)。

本發明通過選定發射光譜與待測熒光染料分子吸收光譜有重疊的稀土離子，設計一種基于ret過程的熒光染料傳感器，通過測量與熒光染料濃度相關的兩個不同波長的稀土離子上轉換發光，以其強度比作為表征參數實現熒光染料濃度的探測，達到操作簡單、探測靈敏度高、可重復使用的目的。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種操作簡單、探測靈敏度高、可重復使用的基于稀土離子上轉換發光強度比的熒光染料濃度探測方法。

本發明的技術方案如下：

針對所需要探測的熒光染料分子種類的不同，選擇合適的稀土離子，所選擇的稀土離子與熒光染料分子之間存在有效的能量傳遞，稀土離子與熒光染料分子之間的能量傳遞為輻射能量傳遞過程。選擇的依據是稀土離子的上轉換發光光譜與熒光染料的吸收光譜有較大重疊，在光譜的重疊部分稀土離子具有兩個以上不同波長的發光峰(包括stark發光峰)，且熒光染料分子對所選取的不同波長的上轉換發光具有不同的吸收特性，且吸收系數差異越大，熒光染料濃度的探測靈敏度越高。以選取的兩個不同波長的稀土離子上轉換發光的強度比值作為表征參數，由于稀土離子能級豐富，上轉換發光峰較多，可選擇性也多。

由于本發明基于從稀土離子上轉換發光到熒光染料分子的ret過程，因此熒光染料分子對稀土上轉換發光的吸收符合beer–lambert定律：

式(1)中c為熒光染料濃度，iλ(0)和iλ(c)分別為熒光染料濃度為0和c時的波長為λ的上轉換發光的強度，kλ為熒光染料對波長λ的光的吸收系數，l為波長λ的光在熒光染料中的穿透距離。考察波長為λ1和λ2的兩個上轉換發光，兩者穿過濃度為c的熒光染料后的強度比值r為：

式(2)中為熒光染料對波長分別為λ1和λ2的兩個上轉換發光的吸收系數之差。由公式(2)可見，在測試條件一定時，δk和l為常數，因此lnr與濃度c呈線性關系。這種基于熒光強度比技術的熒光染料傳感器的相對靈敏度可以表示為：

由公式(3)可見，基于熒光強度比技術的熒光染料傳感器的相對靈敏度s取決于熒光染料對波長分別為λ1和λ2的兩個上轉換發光的吸收系數之差δk，吸收系數相差越大，濃度探測靈敏度越高。

本發明第二個目的請求保護基于ret過程的熒光強度比技術在熒光染料探測上的應用。

本發明與現有技術相比具有如下優點：

1.本發明基于稀土離子的上轉換發光，所采用的激發光為紅外波段，在生物體液中的穿透深度大、光損傷小。

2.本發明基于稀土離子的上轉換發光強度的比值，與絕對發光強度無關，因此探測精度高，實現精確測量。

3.本發明可針對所需探測的特定熒光染料，選擇合適的稀土離子進行探測，有效降低測量誤差，提高檢測靈敏度。

4.本發明可在同一種稀土離子的上轉換發光中，選吸收系數差異較大的兩個波長的上轉換發光進行表征，能有效提高探測靈敏度。

附圖說明

圖1為本發明實施例1中的稀土er³⁺離子摻雜材料的上轉換發光光譜(實線)與羅丹明b(rhb)的相對吸收光譜(點線)和發射光譜(虛線)；

圖2為本發明實施例2中的稀土tm³⁺離子摻雜材料的上轉換發光光譜(實線)與熒光素fitc的相對吸收光譜(點線)和發射光譜(虛線)；

圖3為本發明測量熒光染料濃度的系統示意圖；

圖4為本發明實施例1中的能量傳遞機理圖；

圖5為本發明實施例1中的不同rhb濃度條件下er³⁺的上轉換發光光譜；

圖6為本發明實施例1中的er³⁺的綠色上轉換發光強度和rhb發光強度隨rhb濃度的變化曲線；

圖7為本發明實施例1中的er³⁺的兩個綠色上轉換發光強度比與rhb濃度之間的對數關系曲線(圖a)和er³⁺的兩個綠色上轉換發光強度比與rhb濃度之間的關系曲線(圖b)；

圖8為本發明實施例1中的er³⁺綠色上轉換發光光譜在中心波長521、525、531、544和553nm處進行的光譜分峰擬合；

圖9為本發明實施例1中對不同rhb濃度下er³⁺綠色上轉換發光光譜的光譜分峰擬合；

圖10為本發明實施例1中er³⁺的不同的兩個stark發光峰強度比與rhb濃度之間的對數關系曲線。

具體實施方式

下面通過附圖和具體實施例詳述本發明，但不限制本發明的保護范圍。如無特殊說明，本發明所采用的實驗方法均為常規方法，所用實驗器材、材料、試劑等均可從化學公司購買。

實施例1：

(1)在玻璃襯底上制備稀土er³⁺離子摻雜上轉換發光材料

采用旋涂法制備er³⁺摻雜ybmoo4復合薄膜：首先采用磁控濺射法和低溫水溶液法在玻璃襯底表面依次制備ag層和zno陣列層，然后在其表面旋涂摩爾比為1:10的硝酸鉺(er(no3)3·5h2o)和硝酸鐿(yb(no3)3·5h2o)的乙醇溶液，隨后再旋涂一層等量的與硝酸鉺摩爾比為6:1的七鉬酸銨((nh4)6mo7o24·4h2o)的水溶液，其中七鉬酸銨水溶液的ph值通過1m的naoh溶液調至7。旋涂后獲得的樣品放入馬弗爐中，在空氣氣氛下以3℃/min的速率升至500℃，并在該溫度保持1h，保溫結束并隨爐冷卻，即得到er³⁺摻雜ybmoo4復合薄膜。

(2)熒光染料濃度測定

將er³⁺摻雜ybmoo4復合薄膜附著在比色皿的一側，比色皿中裝有不同濃度的rhb水溶液(圖3)。采用980nm激光激發er³⁺摻雜上轉換復合薄膜，在比色皿另一側通過光譜儀測量經過rhb溶液的er³⁺的上轉換發光光譜(圖1)。通過測量對應于er³⁺的²h11/2→⁴i15/2和⁴s3/2→⁴i15/2躍遷的兩個綠色上轉換發光強度iλ1(c)、iλ2(c)的比值r，建立與rhb濃度之間的關系，實現熒光強度比的rhb探測。

實施例2：

首先在玻璃襯底上制備稀土tm³⁺離子摻雜上轉換發光材料，然后將薄膜附著在比色皿的一側，比色皿中裝有不同濃度的fitc水溶液。采用980nm激光激發tm³⁺摻雜上轉換發光薄膜，在比色皿另一側通過光譜儀測量經過fitc溶液的tm³⁺的上轉換發光光譜(圖2)。通過測量對應于tm³⁺的¹d2→³f4和¹g4→³h6躍遷的兩個藍色上轉換發光強度的比值，建立與fitc濃度之間的關系，實現熒光強度比的fitc探測。

從圖1和圖2所示的實施例1和實施例2的稀土er³⁺/tm³⁺摻雜薄膜的上轉換發光光譜和熒光染料rhb/fitc的吸收光譜可以看出，稀土er³⁺離子的綠色上轉換發光(波長范圍500-580nm內對應于²h11/2→⁴i15/2和⁴s3/2→⁴i15/2躍遷)和稀土tm³⁺離子的藍色上轉換發光(波長范圍430-510nm內對應于¹d2→³f4和¹g4→³h6躍遷)分別與rhb和fitc的吸收光譜有較大程度的重疊，表明稀土er³⁺/tm³⁺離子和rhb/fitc熒光分子之間能夠進行有效的能量傳遞。此外，由于熒光染料分子對不同波長入射光吸收不同(rhb和fitc的吸收光譜)，因此rhb和fitc分別對er³⁺的兩個綠色上轉換發光(²h11/2→⁴i15/2和⁴s3/2→⁴i15/2躍遷)和tm³⁺的兩個藍色上轉換發光(¹d2→³f4和¹g4→³h6躍遷)具有明顯不同的吸收系數(圖中星形所示，吸收系數相差大約50％)。

從圖3所示本發明實施例1的測量熒光染料濃度的系統示意圖可以看出，在980nm紅外激光激發下稀土摻雜薄膜發出的上轉換發光一部分會被熒光染料分子再吸收，發生從稀土離子到熒光分子的能量傳遞，導致熒光染料分子被激發從而引起熒光染料的發光。接下來熒光染料的發光以及一部分未被熒光染料吸收的稀土離子上轉換發光透射出比色皿后通過透鏡聚焦進光譜儀進行光譜的采集。由于稀土摻雜上轉換發光薄膜附著在比色皿的外壁而與比色皿中的熒光染料完全隔離，且隔離的距離至少大于比色皿的外壁厚度，因此稀土離子與熒光染料之間的能量傳遞不屬于fret過程(fret過程要求能量的提供方和接受方之間的距離小于幾個納米)，而是屬于ret過程。圖4給出了實施例1的能量傳遞機理圖，在980nm激光激發下，yb³⁺離子吸收光子能量從基態²f7/2能級躍遷至激發態²f5/2能級，然后再以能量轉移(et)的方式將能量傳遞給er³⁺。er³⁺離子通過連續et過程在能級⁴f7/2上進行布居，隨后無輻射弛豫至能級²h11/2和⁴s3/2后向⁴i15/2輻射躍遷，發出中心波長527和550nm的兩個綠色上轉換發光。er³⁺離子從能級⁴f9/2向能級⁴i15/2輻射躍遷發出中心波長662nm的紅色上轉換發光。接下來一部分綠光通過ret過程被rhb分子吸收，激發rhb分子從homo能級躍遷到lumo能級，最后染料分子從lumo能級輻射躍遷到homo能級，發出中心波長580nm的染料熒光。

從圖5所示的本發明實施例1所測量得到的不同rhb濃度條件下er³⁺的上轉換發光光譜可以看出，隨著rhb染料濃度從0逐漸增加到1000ppm，er³⁺的兩個綠色上轉換發光峰強度逐漸降低，而紅色上轉換發光強度保持不變，同時在波長范圍560-640nm內出現了rhb的發光峰，且rhb發光強度隨著rhb濃度的增大逐漸增強。從圖6所示的er³⁺的綠色上轉換發光強度和rhb發光強度隨rhb濃度的變化曲線可以看出，隨著rhb濃度逐漸增大，er³⁺的綠色上轉換發光強度(ih和is)以及強度之和(ih+is)逐漸降低，并且還可以觀察到兩個綠色上轉換發光強度降低的趨勢不一致。rhb的發光強度(irhb)隨著rhb濃度的增大逐漸增強，但相比于er³⁺的綠色上轉換發光強度，rhb的發光強度非常低，在rhb濃度小于100ppm時甚至探測不到rhb的發光。從圖7a所示的兩個綠色上轉換發光強度比(r(ih/is))和rhb濃度(crhb)之間的對數關系曲線圖可以看出，強度比r(ih/is)和rhb濃度crhb之間滿足線性關系lnr＝0.096+0.0014crhb，擬合的確定系數r²＝0.99904，表明線性關系良好。從圖7b所示的兩個綠色上轉換發光強度比(r(ih/is))和rhb濃度(crhb)之間的關系曲線圖可以看出，強度比r(ih/is)和rhb濃度crhb之間滿足r＝1.1007exp(0.0014crhb)，擬合的確定系數r²＝0.99937，表明er³⁺的綠色上轉換發光強度比呈現出優良的rhb濃度傳感特性。

為了進一步驗證基于ret過程的熒光強度比技術在熒光染料探測上的應用，還可以采用er³⁺離子其它兩個波段的上轉換發光強度比進行rhb濃度探測。從圖1和圖5的er³⁺的綠色上轉換發光光譜可以看到，發光峰出現了stark劈裂。將er³⁺的綠色上轉換發光光譜按照stark劈裂進行分峰擬合，得到如圖8所示的中心波長為521、525、531、544和553nm的5個stark發光峰。與圖8給出的rhb吸收光譜進行對比可以看出，rhb熒光染料對于5個stark發光具有不同的吸收系數(圖中星形所示)。圖9給出的是本發明實施例1中對不同rhb濃度下er³⁺綠色上轉換發光光譜進行stark發光峰擬合的結果，由圖可見在rhb濃度較低的情況下(≤50ppm)，由于rhb發光太弱未能擬合出rhb的發光峰。從圖10給出的本發明實施例1中er³⁺的兩個不同stark發光峰強度比與rhb濃度之間的對數關系曲線可以看出，當用來實現熒光強度比的兩個stark發光的吸收系數之差δk大于37％時(中心波長531和544nm的兩個stark發光吸收系數之差)，兩個stark發光強度比和rhb濃度之間滿足良好的線性關系，且擬合的確定系數r²都很大，表明er³⁺的stark發光的強度比也呈現出良好的rhb濃度傳感特性(圖10e-j)。從圖10e-j和公式(3)還可以看出，δk越大，擬合精度也越高，探測靈敏度s(即線性擬合的斜率)也越高。當用來實現熒光強度比的兩個stark發光的吸收系數之差δk小于37％時，在rhb濃度較低時兩個stark發光強度比和rhb濃度之間偏離線性關系，不能夠實現良好的rhb濃度傳感特性(圖10a-d)。