一種利用近紅外光譜快速測定甘藍型油菜種子中生育酚含量的方法與流程

本發明涉及作物品質育種領域，具體涉及到一種利用近紅外光譜快速測定甘藍型油菜種子中生育酚含量的方法。

背景技術：

維生素e，包括生育酚和生育三烯酚，是一種重要的脂溶性維生素，它具有很強的抗氧化性，在動植生命中有著不可替代的重要地位。天然維生素e主要合成于油料作物的種子和葉片。油菜屬于雙子葉植物，只含有生育酚，由于油菜種子富含生育酚且種植面積大，因此油菜生育酚育種日漸成為研究的熱點之一，越來越受到育種工作者的關注。油菜籽粒生育酚含量的測定主要通過液相色譜法(hplc)進行測量，一般都比較復雜，它既要消耗種子，還要使用大量的化學試劑，無論是從時間、資金還是環境保護來說，都需要尋求更方便有效的方法。

近紅外光譜分析是近些年來在分析測試行業的逐漸備受關注的一門新技術，憑借其快速高效無損的檢測優勢，在農作物領域得到廣泛的應用，但利用近紅外光譜測定油菜或其它作物種子生育酚含量的方法至今尚未見報道，雖然在飼料維生素e含量檢測中有所應用，但在飼料中建立的模型或即使利用其它種子建立的分析模型對油菜種子維生素含量的測定也是完全不適合的，這主要是因為不同作物種子所含化學成分不同，含氫基團倍頻與合頻振動頻率不同，則近紅外圖譜的峰位、峰數及峰強也不同，即不同物質的光譜是存在特異性的，那么用油菜建立的模型僅適用于油菜，因此必須建立油菜種子自己的生育酚測量的方法。鑒于此，通過發明人的探索、研究，利用近紅外光譜分析，可以實現甘藍型油菜種子中生育酚含量的快速測定。

技術實現要素：

針對上述情況，本發明的目的就是為了提供一種利用近紅外光譜專門快速測定甘藍型油菜種子中生育酚含量的方法。

為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：

一種利用近紅外光譜快速測定甘藍型油菜種子中生育酚含量的方法，包括下述步驟：

(1)利用近紅外光譜儀采集表1中所有樣品的近紅外光譜數據

樣品光譜采集所用的儀器為fossnipsystem公司的fosstr-3700型近紅外快速品質分析儀，掃描波長為1100-2500nm，分辨率為2nm；每份材料掃描兩次，掃描后取反射值r，再轉化成log(1/r)保存到光譜文件中，逐份掃描，得到所有油菜籽樣品的光譜圖；

(2)對步驟(1)獲得的光譜圖進行預處理

即將所有甘藍型油菜種子光譜從fosstr-3700型近紅外快速品質分析儀中導出，轉入分析軟件winisi中；對樣品的光譜文件按編號進行合并后平均，即將每個樣品的2次重復掃描光譜進行合并，得到一個新的平均后的光譜文件，以降低誤差。

(3)利用winisi軟件將表1中的β+γ-生育酚以及總生育酚含量一一對應的輸入光譜文件中，建立校正模型；其中，建立β+γ-生育酚校正模型時采用的是表1中的295個樣品，即除了表1中序號為108、143、171、179、206、229這7個樣品外的所有樣品；建立總生育酚校正模型采用的是表1中的286個樣品，即除了表1中序號為9、15、26、29、62、74、76、99、116、121、135、162、224、230、255、291這16個樣品外的所有樣品；β+γ-生育酚以及總生育酚含量兩種校正模型所采用的數學方法均為2,3,3,1；所用的回歸方式為改進的偏最小二乘法(modifiedpls)；光譜散射處理方式采用標準正態變量轉換+趨勢變換法(snv+det)。

(4).采集待測樣品的光譜，處理之后輸入到校正模型中，得到待測樣品的生育酚含量預測值。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：

本發明提供的是一種利用近紅外光譜快速測定甘藍型油菜種子中生育酚含量的方法，該方法快速、準確、無損，操作簡單，操作過程只需經過簡單培訓的工人即可完成，每個樣品的測試過程不到2分鐘，經驗證，檢測結果準確，高效。而直接利用標準方法(hplc)測量甘藍型油菜種子中生育酚含量需要實驗人員操作，每個樣品所需時間達到4小時，并且不能對測量完成的樣品進行回收。

附圖說明

圖1為建立近紅外光譜技術快速測定甘藍型油菜種子中生育酚含量模型的流程圖。

圖2為校正集甘藍型油菜種子所有樣品的近紅外掃描光譜圖。

圖3為利用高效液相色譜法測得的甘藍型油菜種子中生育酚含量的色譜圖；

其中δ-t,is,γ+β-t,α-t分別表示δ生育酚、內標、γ和β生育酚之和、α生育酚。

圖4為驗證集利用校正模型計算得到的生育酚含量預測值和標準方法測定的化學值之間的關系散點圖；

其中a圖為γ+β-生育酚，b圖為總生育酚。

具體實施方式

本發明所述技術方案，如未特別說明，均為本領域的常規技術；所述試劑或材料，如未特別說明，均來源于商業渠道。

實施例1：

一種利用近紅外光譜快速測定甘藍型油菜種子中生育酚含量的方法，包括下述步驟：

1.收集甘藍型油菜樣品。

為保證分析模型的準確性，必須選取一批遺傳多樣性豐富的油菜種子。鑒于此，首先利用從全國各地收集的有代表性的一批油菜自交系，通過分子標記分析、生育酚含量測定，從中篩選出373份在生育酚含量、群體結構、遺傳多樣性均存在較大差異的甘藍型油菜種子，然后將這373份材料分成兩組，第一組作為校正集，用于建立近紅外校正模型；第二組作為驗證集，用于驗證近紅外校正模型的準確性，其中校正集302份，驗證集71份，所述的373份樣品參考lius,fanc,lij,etal.agenome-wideassociationstudyrevealsnoveleliteallelicvariationsinseedoilcontentofbrassicanapus.[j].theoreticalandappliedgenetics,2016,129(6):1203-1215.，具體如下表所示：

表1校正集甘藍型油菜樣品材料編號及hpcl測得的生育酚含量

表2驗證集甘藍型油菜樣品材料編號及hplc測得的生育酚含量

2.利用近紅外光譜儀采集校正集所有樣品的近紅外光譜數據。

樣品光譜采集所用的儀器為fossnipsystem公司的fosstr-3700型近紅外快速品質分析儀，掃描波長為1100-2500nm，分辨率為2nm。每份材料掃描兩次，掃描后取反射值r，再轉化成log(1/r)保存到光譜文件中，逐份掃描，得到所有油菜籽樣品的光譜圖。

3.對校正集的光譜進行預處理。

將校正集所有甘藍型油菜種子光譜從近紅外儀器中導出，轉入分析軟件winisi(本實施例使用的是winisiiii)中。對樣品的光譜文件按編號進行合并后平均，將每個樣品的2次重復掃描光譜進行合并，得到一個新的平均后的光譜文件，以降低誤差。

4.利用標準的方法測定校正集所有樣品的化學值，即樣品的生育酚含量。

本發明所使用的測定甘藍型油菜種子中生育酚含量的標準方法是高效液相色譜法(hplc)，所用的儀器是安捷倫(agilent)1260高效液相色譜儀，該儀器配有自動進樣器、真空脫氣機、色譜工作站以及熒光檢測器。

樣品處理方法為：

(1)取干燥的甘藍型油菜種子約50mg，精確稱量；

(2)加1.5ml含有0.01％bht提取液(體積比為9:1的甲醇、二氯甲烷混合液)；

(2)利用購自美國的sk450型混合機將樣品研磨3min，之后在常溫下震蕩提取4h；

(3)12000r/min條件下離心20min，取400ul上清于進樣瓶中；

(4)用agilent1260高效液相色譜儀對玻璃品種的樣品進行檢測；

(5)采用內標定量法，每個樣品中加入60μl的50ng/μl的5,7-二甲基生育酚的正己烷溶液；

(6)圖像顯示及處理軟件為workstationtoolar；分別計算出β+γ-生育酚以及總生育酚含量(由于α-生育酚、δ-生育酚含量較低，故不用于建立模型)。對校正集各樣品的的檢測結果如表1所示，結果顯示，γ+β-生育酚含量在133.78～396.69ug/g之間，總生育酚在216.12～522.21ug/g之間，最高值與最低值均相差兩倍以上，變化幅度均較大，由于歷史上油菜籽粒維生素e含量從來沒有作為一個重要性狀進行過人工選擇，這樣的含量變異基本上代表了絕大多數不同油菜籽粒維生素e含量的變化幅度，因此利用這些樣品建立的模型同樣適合用于絕大多數油菜種子維生素e含量的測定。

色譜分析條件為：(1)色譜柱：c18柱(4.6mmid×12.5mm，4-pack)，柱溫30℃；(2)熒光檢測器：激發波長為292nm，發射波長330nm，檢測時間為20min；(3)進樣量為20ul；(4)流動相為水:甲醇＝5:95(體積比)，變換至水:甲醇＝0:100(體積比)，流速為1.5ml/min。

5.將校正集的光譜數據與化學值相關聯，建立定標方程。

利用winisi軟件將hplc得到的兩種化學值(β+γ-生育酚以及總生育酚含量)一一對應的輸入光譜文件中；選擇計算和利用得分程序，以pca計算方式(利用文件中的掃描數據計算得分，以此統計文件中各樣品間的差異)和光譜文件中所有樣品得分的平均值作為中心，以此來計算每個樣品的馬氏距離，將馬氏距離設置為3.0，即每個樣品離中心樣品點的距離超過該值，就被視為超常樣品，就被剔除，最終有295個樣品(表1中除了序號為108、143、171、179、206、229這7個樣品)用于建立β+γ-生育酚校正模型，286個樣品(表1中除了序號為9、15、26、29、62、74、76、99、116、121、135、162、224、230、255、291這16個樣品)用于建立總生育酚校正模型。

6.采用不同的數學處理技術和散射校正方法完成定標方程內部驗證，選擇最佳定標方程，確定校正模型；本發明中β+γ-生育酚以及總生育酚含量兩種校正模型所采用的數學方法均為2,3,3,1(即做2階導數處理、導數處理光譜間隔點為3、一次平滑光譜間隔點為3、二次平滑為1)、(2,3,3,1)；所用的回歸方式為改進的偏最小二乘法(modifiedpls)；光譜散射處理方式采用標準正態變量轉換+趨勢變換法(snv+det)；選擇最佳定標方程的主要參數有定標標準誤差(sec)、交叉驗證誤差(secv)、定標決定系數(rsq)、交叉驗證系數(1-vr)。通過這些參數判定定標方程的優劣。

7.采集驗證集樣品的光譜，處理之后輸入到校正模型中，得到驗證集樣品的生育酚含量預測值。使用與校正集相同的方法得到處理過的驗證集材料的光譜，利用winisi軟件，通過建立的校正模型計算出驗證集所有材料的預測值，校正集和驗證集材料種子中生育酚含量如下表所示：

8.利用標準方法(hplc)測定校正集樣品的生育酚含量，即化學值，并與預測值進行對比分析，實現對校正模型的外部驗證。采用與校正集相同的方法測量出驗證集所有樣品的化學值，將驗證集的化學值與通過模型得到的預測值進行對比分析，以驗證校正模型是否可用，結果如下表所示：

說明：n,樣本數；mean,平均值；sd,參考值的標準偏差；sec,校準標準誤差；rsq,決定系數；1-vr,1-不可解釋方差與總方差的比值；dt,導數處理；scm,散射校正方法；terms,用于校準的主成分數；group,校準集被劃分成若干組；secv,交叉驗證的標準誤差；r²cv,交叉驗證確定系數；rpd,比性能差(sd/secv)；sep,外部驗證中預測的標準誤差；r²ev,外部驗證確定系數；snv+det,標準正態變量轉換+趨勢變換法；wmsc,加權多散射校正。

雖然本模型的rsq值相對有點低，但考慮到種子中生育酚含量低于種子干重的0.6％，這說明模型的質量較高，從上表中可看出交叉驗證的rpd值在1.0～2.0之間，運用本模型是可以比較準確預測甘藍型油菜種子中生育酚含量。此外，利用高效液相色譜法進行測量時從樣品制備到完成分析所用時間接近5個小時，而利用本發明所述的方進行分析時，每份樣品所用時間不超過3分鐘，大大縮短了檢測時間。這一模型的建立為油菜高生育酚育種提供了快捷有效的方法，從而將極大地加快新品種的選育進程。