本發明涉及制漿造紙工業領域，尤其涉及一種頂空氣相色譜快速檢測抗菌紙抑菌性的方法。
背景技術：
紙張和紙制品是一種與人們的日常生活密切相關的綠色環保、可再生的纖維材料。與人體接觸的生活用紙(餐巾紙、衛生紙、卸妝紙、吸油紙等)、食品包裝紙、醫療用紙以及紙幣等在生產、存放及使用過程中，會引入有害的微生物，如：真菌、綠膿桿菌、大腸桿菌等，易在使用過程中造成病菌感染而引起腸炎、傷寒、痢疾等疾病。此外，一些比較有價值的書籍、字畫、證券等紙質材料在保存的過程中，也會逐漸被儲存環境中的微生物產生的細菌(主要是霉菌)侵蝕，而造成財產方面的重大損失。因此，研究開發具有抗菌、抑菌、殺菌功能的紙產品，已成為當前新型紙品開發的熱點之一。而快速評價紙產品的抗菌或抑菌效果的檢測方法，對于抗菌紙產品的開發是非常重要的。
目前，紙張抗菌或抑菌效果的評價檢測方法主要是抑菌圈法。該方法主要用于測定紙張中的抑菌防霉劑對細菌、霉菌以及酵母菌的抑菌作用，其原理是利用抑菌劑在瓊脂平板培養基中擴散使其周圍的細菌的生長受到抑制而形成透明的抑菌圈，根據抑菌圈的大小來判斷紙張中抑菌防霉劑的抑菌效果的一種方法。該方法主要缺點是操作繁瑣、耗時(一般需要將細菌在培養基上培養24h后才能進行測定)，并且只能進行定性或半定量的測定。為了克服傳統的抑菌圈法評價抑菌效果時準確度不高、效率低的缺陷，目前已建立一些基于現代儀器的分析方法，如：化學發光法、三磷酸腺苷(atp)生物發光法等，以及便攜式生物熒光傳感器的細菌總數的快速檢測。然而，這些方法通常要求樣品中細菌濃度大于1000個/ml，以滿足檢測靈敏度的要求。目前還利用熒光納米粒子標記法對多重細菌(如鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌等)同時實現快速定性檢測，但是該方法不能用于細菌數量的定量分析。
頂空氣相色譜檢測技術是一種自動的現代化儀器分析技術，其可以實現對復雜樣品溶液中的揮發性組分進行大批量的高效測定。早在1997年gardinia等人就利用頂空氣相色譜法測定微生物代謝產物——二氧化碳的產生量來監測微生物的細胞活性和繁殖能力。然而，對于抗菌紙抑菌性的評價方法仍是基于傳統的計數法。因此，有必要開發一種能夠準確快速評價抗菌紙抑菌性的方法。
技術實現要素：
本發明的目的在于克服上述現有技術的缺點和不足，提供一種頂空氣相色譜快速檢測抗菌紙抑菌性的方法。通過測定二氧化碳和氧氣信號值可反映出細菌的生長情況，也可用兩種氣體信號值來代替其含量高低，進而簡便準確地計算出抗菌紙的抑菌率。此外，還可對大批量的抗菌紙進行半自動化測定。
由于大腸桿菌在氧氣存在的條件下，進行有氧呼吸，消耗氧氣并釋放出二氧化碳。大腸桿菌有氧呼吸的總反應式如式(1)所示。
c6h12o6+6o2+6h2o→6co2+12h2o+能量(1)
根據大腸桿菌在生長過程中對氧氣的消耗以及生成的二氧化碳，測定出兩者信號值，根據兩者的變化量即可計算出抗菌紙的抑菌率。即：
式中，ad為對照組檢測密閉瓶中氣象中二氧化碳或氧氣的峰面積，as為實驗組檢測密閉瓶中氣象中二氧化碳或氧氣的峰面積，a0為空白檢測密閉瓶中氣相中初始二氧化碳或氧氣的峰面積。
本發明通過下述技術方案實現：
頂空氣相色譜快速檢測抗菌紙抑菌性的方法，包括如下步驟：
步驟(1)：樣品制備：
制備抗菌紙：將殼聚糖用乙酸溶液溶解，加入硝酸銀溶液，調ph為弱堿性，抽濾制得殼聚糖凝膠。將殼聚糖凝膠涂布于濾紙表面制得抗菌紙；
制備lb液體和固體培養基：稱取胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉，加入蒸餾水攪拌溶解，用氫氧化鈉溶液調節ph值為7.0(±0.2)，高壓滅菌后制得液體培養基。取上述液體培養基加入瓊脂并加熱使其形成溶液，高壓滅菌后制得固體培養基。
制備不同濃度的大腸桿菌菌液：先取市購大腸桿菌菌液培養一定時間，之后將菌液稀釋，得到不同濃度的菌液，并對低濃的菌液進行計數。
步驟(2)：菌液的培養：
將不同濃度的菌液和抗菌紙裝入頂空瓶并置于恒溫培養箱中培養一定時間，并設置對照組(普通濾紙)。
步驟(3)：樣品檢測：
用頂空氣相色譜檢測頂空瓶內氧氣與二氧化碳信號值。
步驟(4)：結果分析：
做出步驟(3)菌液產生的氧氣與二氧化碳信號值圖像，利用實驗組與對照組的氧氣與二氧化碳差值計算出抗菌紙的抑菌率。
上述步驟(1)中乙酸溶解殼聚糖濃度為0.1％～1.0％，溶解時間為1h～6h，制備抗菌紙的殼聚糖涂布量為0～15％；制備大腸桿菌菌液濃度為3～3×107cfu/ml。
上述步驟(2)培養條件：頂空瓶中菌液10～1000μl、培養液1～10ml、紙樣0.01～0.5g、25～45℃、2h-20h。
上述步驟(3)所述頂空進樣器操作條件是：平衡溫度40～80℃，樣品平衡時間4～40min，頂空樣品瓶中載氣平衡時間10～20s，管路充氣時間10～20s，管路平衡時間1～10s，環路平衡時間10～20s。
上述步驟(3)所述氣相色譜儀操作條件是：色譜柱溫為50～150℃，氮氣作為載氣。其中，氮氣流量2.0～6.0ml/min。
上述步驟(3)所述氣相色譜儀操作條件是：色譜柱溫為50～150℃，氮氣作為載氣，氮氣流量為2.0～6.0ml/min；tcd檢測器溫度150～250℃。
上述步驟(4)結果分析抗菌紙抑菌率的計算方法有:以氧氣信號值表示；以二氧化碳信號值表示；二氧化碳與氧氣信號值變化量比值分析。
本發明相對于現有技術，具有如下的優點及效果：
首先，采用本方法測定抗菌紙抑菌性時，頂空瓶的密閉效果好，避免了受到雜菌的污染。
其次，本方法不需要人工計數細菌，同時儀器分析準確率高、靈敏度好；又可在短時間內進行大量的檢測。
因此，采用本方法檢測抗菌紙的抑菌性，不僅節省時間、提高檢測效率，而且可以簡便準確地計算出抑菌率。
附圖說明
圖1為以二氧化碳計算的抑菌率(wb)對硝酸銀相對添加量的關系圖
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步具體詳細描述。
實施例
所使用的儀器設備與試劑：涂布機、干燥機、高壓蒸汽滅菌鍋、生化培養箱、搖床、超凈工作臺、天平(0.001g)、ph計、移液槍及槍頭、安捷倫a7890型氣相色譜儀(熱導檢測器、hp-6890型毛細管色譜柱)、頂空瓶；
殼聚糖、大腸桿菌(e.coli-atcc)、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉、硫酸(2mol/l)、冰醋酸、硝酸銀、氯化鈉、氫氧化鈉。
(1)樣品制備：
制備抗菌紙：將1g殼聚糖溶于0.1％的乙酸溶液，加入一定量硝酸銀溶液(以硝酸銀對殼聚糖的質量分數為準)，6h后調ph值為7.5，抽濾制得殼聚糖凝膠。將殼聚糖凝膠涂布于濾紙表面制得抗菌紙(殼聚糖5％)；重復上述步驟，以不同硝酸銀對殼聚糖的質量分數(表1)制備10張抗菌紙。
表1抗菌紙
制備lb液體和固體培養基：稱取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gnacl，加入1000ml蒸餾水攪拌溶解，用1mol/l的naoh調節ph值為7.0(±0.2)，高壓滅菌(溫度121℃、時間15分鐘、0.1mpa)制得液體培養基；取上述液體培養基500ml加入7.5g瓊脂并加熱使其形成溶液，高壓滅菌(溫度121℃、時間15分鐘、0.1mpa)制得固體培養基。
在超凈工作臺上用移液槍移取200μl大腸桿菌菌種至10ml滅菌的液體培養液中，封口，放入搖床中培養12h(37℃，150r/min)得到大腸桿菌菌懸液。移取1ml菌懸液于試管1中，加入9ml無菌生理鹽水，混合均勻制得1：10的稀釋液；同樣方法制得1：102、1：103、1：104、1：105、1：106、1：107的菌稀釋液。分別取菌懸液、1：10、1：103、1：105、1：107的菌稀釋液作為1#、2#、3#、4#、5#待測菌夜。將待測菌夜接種于lb固體培養基，在37℃恒溫培養箱中培養24h，之后測定菌液濃度(表2)。
表2菌液濃度
(2)菌液的培養：
紙樣與培養液的質量比為1％。將抗菌紙剪成1cm×2cm的紙片，用移液槍移取5ml培養液于頂空瓶中，稱取紙片0.05g，并移取待測菌夜液100μl作為實驗組。對照組取濾紙紙片(1cm×2cm)0.05g，5ml培養液，待測菌夜100μl。將頂空瓶壓蓋密封，放入搖床中培養6h(37℃，)，取出放入-4℃的冰箱中冷凍。
(3)樣品檢測：
將冷凍的樣品于室溫下解凍后，放入80℃的水浴鍋中20min。然后用頂空氣相色譜儀檢測頂空瓶中co2和o2的信號值。
(4)結果計算：
由步驟(3)檢測的氧氣與二氧化碳信號值，根據式(2)可計算出抗菌紙的抑菌率。
(5)測定結果
表3抗菌紙抑菌率
*為實際硝酸銀的質量除以涂布所需殼聚糖質量的百分比；
**o2和co2空白的信號值分別為84.6、1.8。
根據表3，繪制以二氧化碳計算的抑菌率(wb)對硝酸銀相對添加量的關系圖(圖1)，其規律可由以下方程進行描述，即：
wa＝7.20*lnc+76.40
(3)
wb＝11.24*lnc+72.22(4)
式中，wa為用氧氣信號值表示的抑菌率(％)，wb為用二氧化碳信號值表示的抑菌率，c為硝酸銀的相對含量(％)。
由表3中wa和wb的數據可知，以二氧化碳和以氧氣計算的抗菌紙抑菌率的變化趨勢一致。但是當硝酸銀相對含量達到15％時，以二氧化碳計算的抑菌率wb已經接近100％，而以氧氣計算的抑菌率wa為96％。這是由于細菌在開始培養后，首先會進行有氧呼吸而消耗氧氣，而抗菌紙的抑制作用具有滯后性，所以wa和wb有一定的差異。因此，對于高抑菌的材料，以二氧化碳計算的抑菌率更為客觀。
圖1是以該批抗菌紙以二氧化碳計算的抑菌率(wb)對硝酸銀相對添加量的關系圖。由圖可知，隨著硝酸銀含量的逐漸增加，抗菌紙的抑菌率呈現先快速增加，后緩慢升高的趨勢，從圖1中也可以看出，從經濟合理的考慮，硝酸銀相對添加量為1.2％為宜，其抗菌紙的抑菌率可達到75.0％。
如上所述，便可較好地實現本發明。
本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。