本發明屬于水污染檢測與治理領域，尤其是涉及一種多氯聯苯77檢測的核酸適配體比色傳感器的制備及應用。
背景技術：
多氯聯苯77(pcb77)是一類廣泛存在于環境中的高毒性低濃度的持久性有機環境污染物。20世紀以來，世界多地發生了多氯聯苯污染事件，對人類、動物的健康以及環境造成了無法挽回的影響。較其他污染物而言，它具有高毒性低致死量的特點。在許多污水處理廠及沿江、河口地區均有發現pcbs的存在，而且它會存在于水體中，更會殘留在土壤中，最后通過食物鏈富集到人體或動物體內，對生命體的神經，生殖等多系統造成無可挽回的影響。多氯聯苯是具有209種同系物的持久性有機污染物。pcb77，pcb126，pcb169都是平面構型，這種平面構型的pcbs比非平面型的pcbs毒性要高得多，被認為是其中一類毒性極強的類二噁英類pcbs(dl-pcbs)。高毒性的pcbs在實際水體中濃度卻極低。因此如何建立的方法檢測這種高毒性低濃度的污染物顯得尤為重要。因此實現對pcb77的快速、簡便且高靈敏高選擇性檢測具有重要的現實意義。
目前，氣質聯用(gc-ms)做為最常見的標準檢測辦法(gb)可以實現對pcb的定量檢測。但是其需要復雜的前處理過程，專門人員操作，費時費力，對儀器和操作人員的要求較高。近年來，研究人員也研制了一些新的實驗方法，如電化學方法、熒光法、表面增強拉曼等新型方法來檢測pcb77。但是，它們并不能實現快速高靈敏檢測的目標。相對地，比色法不僅操作簡單，使用方便，方法靈活，不需要昂貴的大型儀器并具有目測法代替復雜儀器的潛力，而且可以實現對污染物的分析檢測。但是，比色法本身缺乏選擇性，無法達到對復雜環境體系中的高毒性低濃度污染物的檢測要求，所以我們設想將核酸適配體作為特異性識別元素與比色相結合。因此，構筑基于特異性識別元件的比色傳感器，在復雜的水樣中實現對pcb77的檢測，具有重要的環境意義。
核酸適配體(aptamer)是通過指數富集的配基系統進化技術(selex)體外篩選得到的一種單鏈的dna或者rna序列，對靶標分子具有極高的親和力，因此賦予了對靶物質極高的識別能力。核酸適配體可以和目標物發生類似于抗原和抗體的特異性結合，因此也被稱為“化學抗體”。它具有結構和化學性質穩定的特點，可以識別一個或者一類目標物。此外，核酸適配體還具有合成周期短、合成成本低、穩定性高、易于修飾等優點。因此在本發明中，將特異性識別pcb77的核酸適配體與比色分析方法結合，實現了對pcb77的快速、靈敏以及高選擇性檢測。具體如下：將具有一定堿基序列的核酸適配體溶液和較高濃度的氯化鈉溶液加入到金納米粒子溶膠中。由于核酸適配體對金納米粒子的保護作用結合較高濃度氯化鈉的靜電屏蔽作用，金納米粒子傾向于互相分離。當向上述體系加入pcb77溶液后，核酸適配體高親和力特異性結合pcb77分子，金納米粒子失去了保護。在較高濃度氯化鈉作用下，金納米粒子團聚，特征等離子共振吸收峰由520nm紅移至646nm，溶液顏色由紅色變紫色或者藍色。利用吸光度比值a646/a520的變化與pcb77濃度之間的關系實現對pcb77的分析檢測。
技術實現要素：
本發明的目的是針對現有檢測pcb77方法的儀器價格昂貴、操作復雜、分析耗時等不足而提供的一種基于一定堿基序列的核酸適配比色傳感器的分析方法。利用具特異性識別pcb77功能的核酸適配體分子作為傳感器的識別元件，提高了比色傳感器的選擇性，增加了比色分析方法的靈敏度。同時，該比色分析方法具有制備簡單、響應迅速、操作簡便等優點。
本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：
通過向制備的金納米粒子溶膠中加入一定堿基序列的核酸適配體溶液和較高濃度的氯化鈉溶液，室溫下培育10～20min，構筑得到基于一定堿基序列的核酸適配體比色傳感器。該核酸適配體比色傳感器以pcb77為檢測對象，通過將不同濃度的pcb77溶液加入到比色傳感器溶液中，室溫下作用10～20min后，采用紫外-可見分光光度計測定上述混合溶液的紫外-可見吸收光譜。通過測定的吸光度比值a646/a520與pcb77濃度之間的關系可實現對pcb77的高靈敏度和高選擇性分析檢測；具體步驟如下：
(1)所用玻璃儀器均經過王水浸泡、高純水清洗干凈并烘干待用。向潔凈的燒杯中加入40～60ml的濃度為0.03～0.06mol/l的氯金酸(haucl4)溶液，持續加熱至沸騰；持續攪拌下，將4～6ml濃度為0.03～0.04mol/l檸檬酸鈉溶液加入到沸騰的haucl4溶液中，反應持續10～30min后停止加熱。待溶液冷卻至室溫，用0.22μm的濾膜過濾得到金納米粒子溶膠。
(2)向樣品管中加入100～300μl的金納米粒子溶膠，并分別加入30～70μl的核酸適配體溶液和15～25μl的nacl溶液。作用10～20min后，得到核酸適配體比色傳感器。其中，使用20-60個堿基的核苷酸序列做為與pcb77發生特異性結合的核酸適配體。
(3)將不同濃度的pcb77標準溶液分別加入步驟(2)制備的核酸適配體比色傳感器溶液中，室溫下靜置培育10～20分鐘。用紫外-可見分光光度計測定不同樣品的紫外-可見吸收光譜。
(4)將pcb77溶液和100倍于pcb77溶液濃度的干擾物溶液分別加入步驟(2)制備的核酸適配體比色傳感器的溶液中，室溫下靜置作用10～20分鐘，用紫外-可見分光光度計測定不同樣品的紫外-可見吸收光譜。
(5)取實際水樣，先經過濾紙過濾以除去其中所含的顆粒物與懸浮物。隨后用0.22μm的濾膜進行多次過濾，對江水樣品進一步純化。向純化后的江水樣品中加入pcb77標準溶液，使得江水樣品中pcb77的含量為2×10-8mol/l。將預處理后的水樣加入到步驟(2)制備的核酸適配體比色傳感器溶液中，室溫下靜置培育10～20min，以紫外-可見分光光度計測定不同樣品的紫外-可見吸收光譜。
與現有技術相比，本發明將操作簡便、響應迅速的比色分析技術與對pcb77具有特異性識別能力的核酸適配體技術相結合，構筑了一個新穎的pcb77核酸適配體比色傳感器。利用特異性識別pcb77功能的核酸適配體分子作為傳感器的識別元件，提高了比色傳感器的選擇性，增加了比色分析方法的靈敏度。該傳感器可同時實現對pcb77的高靈敏度和高選擇性分析檢測。與現有pcb77的檢測技術相比，本發明具體以下優點：
(1)與傳統分析方法如高效氣相色譜質譜法相比，本發明中構筑的核酸適配體比色傳感器不需要借助復雜大型的儀器、操作簡單、靈敏度高、可實現對pcb77的快速檢測。
(2)與現有的生物傳感器相比，本發明直接將核酸適配體溶液與金納米粒子溶膠混合，制備得到核酸適配體比色傳感器，該傳感器制備簡單，具有較高的穩定性和重現性；選取合成成本低、穩定性高、易于修飾等優點的核酸適配體作為傳感器的識別元素，提升了比色分析方法的靈敏度和選擇性。
附圖說明
圖1為構筑的核酸適配體比色傳感器的吸光度比值a646/a520隨pcb77濃度對數的變化曲線。
具體實施方式
下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發明的保護范圍。
實施例1
一種用于pcb77快速檢測的基于一定堿基序列的核酸適配體比色傳感器，以金納米粒子溶膠為基體，通過pcb77與金納米粒子競爭結合核酸適配體引起金納米粒子聚集程度的改變，實現對pcb77的分析。核酸適配體比色傳感器的具體制備步驟如下：
(1)所用玻璃儀器均經過王水浸泡、高純水清洗干凈并烘干待用。制備時，向潔凈的燒杯中加入100ml的濃度為0.05mol/l的氯金酸(haucl4)溶液，持續加熱至沸騰；持續攪拌下，將10ml濃度為0.0388mol/l檸檬酸鈉溶液加入到沸騰的haucl4溶液中，反應持續20分鐘后停止加熱。待溶液冷卻至室溫，用0.22μm的濾膜過濾得到金納米粒子溶膠。
(2)向樣品管中加入200μl(1)中制備得到的金納米粒子溶膠，隨后分別加入55μl的核酸適配體溶液和20μl的nacl溶液，25℃作用15min后，得到特異性識別pcb77的核酸適配體比色傳感器。實驗中使用的pcb77的核酸適配體的堿基序列為：
5′-ggcta-cgaag-tagtg-
atttt-ttccg-atggc-ccgtg-3′
實施例2
對于核酸適配體比色傳感器制備過程中的兩個濃度參數和反應時間參數：核酸適配體和氯化鈉的最優濃度，反應時間的最優量進行了確定。具體為：取一系列的金納米粒子溶膠，分別向其中加入不同濃度的適配體溶液和氯化鈉溶液，配制得到核酸適配體的濃度位于1.40×10-8～1.40×10-7mol/l的范圍、氯化鈉的濃度位于0.01～0.04mol/l范圍內的一系列核酸適配體比色傳感器溶液。分別以紫外-可見分光光度計測定上述系列溶液的a646/a520。研究結果表明，當適配體的濃度為3.8×10-7mol/l，氯化鈉的濃度為0.0345mol/l時，a646/a520的比值最大。因此，在核酸適配體比色傳感器的構筑過程中所采用的核酸適配體和氯化鈉的最優濃度分別為3.8×10-7mol/l，0.0345mol/l。
實施例3
取pcb77液體樣品，先用正己烷配制得到1.0×10-3mol/l的pcb77母液，再分別用不同體積的乙醇對上述pcb77母液進行稀釋，配制得到一系列不同濃度的pcb77的標準溶液。取實施例1中制備得到的核酸適配體比色傳感器溶液，分別向其中加入不同濃度的pcb77溶液，25℃下作用3min后，以紫外-可見分光光度計測定溶液的紫外-可見吸收光譜。研究結果表明，隨著測試體系中pcb77濃度的增加，金納米粒子的特征等離子共振吸收峰由520nm紅移至646nm。pcb77的濃度越高，金納米粒子位于646nm處的吸光度值a646越大，位于520nm處的吸光度值a520越小，此時二者的比值a646/a520越大。利用a646/a520與pcb77濃度的對數之間的線性關系建立工作曲線，如圖1所示，左上角插圖為pcb77的核酸適配體堿基序列；右下角插圖為加入不同濃度的pcb77的核酸適配體比色傳感器溶液的紫外-可見吸收光譜。如圖所示，隨著加入污染物濃度的依次增加，金納米粒子在520nm處的紫外吸收峰強度越來越低，在646nm處的紫外吸收峰強度越來越高。本發明中，核酸適配體比色傳感器測定pcb77的線性范圍為5×10-10～9×10-7mol/l，檢測限為5×10-11mol/l。
實施例4
(1)向樣品管中加入200μl實施例1中制備得到的金納米粒子溶膠，隨后分別加入55μl的核酸適配體溶液和20μl的nacl溶液，25℃作用15min后，得到特異性識別pcb77的核酸適配體比色傳感器。再分別向其中加入實施例3中配制的不同濃度的pcb77溶液，25℃下作用3min后，以紫外-可見分光光度計測定溶液的紫外-可見吸收光譜。研究結果表明，隨著測試體系中pcb77濃度的增加，金納米粒子的特征等離子共振吸收峰由520nm紅移至646nm。pcb77的濃度越高，金納米粒子位于646nm處的吸光度值a646越大，位于520nm處的吸光度值a520越小，此時二者的比值a646/a520越大。可見，具有40個堿基的核酸適配體所制備的pcb77核酸適配體比色傳感器在測定pcb77時表現出特異性識別能力。本實驗中使用的pcb77的核酸適配體的堿基序列為：
5′-ggcgg-ggcta-cgaag-tagtg-
atttt-ttccg-atggc-ccgtg-3′
(2)向樣品管中加入200μl，實施例1中制備得到的金納米粒子溶膠，隨后分別加入55μl的錯配堿基的核酸適配體溶液和20μl的nacl溶液，25℃作用15min后，得到錯配堿基的核酸適配體比色傳感器。分別向其中加入實施例3中配制的不同濃度的pcb77溶液，25℃下作用3min后，以紫外-可見分光光度計測定溶液的紫外-可見吸收光譜。研究結果表明，隨著測試體系中pcb77濃度的增加，金納米粒子的特征等離子共振吸收峰仍處在520nm位置，并沒有發生紅移。隨著pcb77的濃度越高，金納米粒子位于520nm處的吸光度值a520并未發生變化。可見，所制備的錯配堿基的核酸適配體比色傳感器在測定pcb77時并沒有發生特異性識別。本實驗中使用的錯配堿基的核酸適配體的序列為：
5′-ggcgg-aatta-cgaag-ccatg-
atttt-ggacg-atggc-ttatg-3′
實施例5
取實施例1中制備得到的核酸適配體比色傳感器溶液，分別向其中加入1×10-8mol/l的pcb77標準溶液和1×10-6mol/l的腐殖酸標準溶液，25℃下作用3min后，以紫外-可見分光光度計分別測定加入了pcb77和腐殖酸的核酸適配體比色傳感器溶液的紫外-可見吸收光譜。研究結果表明，加入1×10-8mol/l的pcb77標準溶液引起的金納米粒子吸收比a646/a520為1.3882，而加入100倍濃度于pcb77的腐殖酸引起的金納米粒子吸收比a646/a520為0.2675，遠小于pcb77引起的吸光度的變化值。可見，所制備的核酸適配體比色傳感器在測定pcb77時表現出較高的選擇性。環境中與pcb77共存的污染物腐殖酸加入待測體系后，并不對核酸適配體比色傳感器測定pcb77造成干擾。
實施例6
取實際江水樣品，先經過濾紙過濾以除去其中所含的顆粒與懸浮物，隨后用0.22μm的濾膜進行多次過濾，對江水樣品進一步純化。向純化后的江水樣品中加入pcb77標準溶液，使得江水樣品中pcb77的含量為2×10-7mol/l。測試時，將上述預處理的水樣加入到核酸適配體比色傳感器溶液中，25℃溫度下作用3min后，以紫外-可見分光光度計測定上述溶液的紫外-可見吸收光譜。研究結果表明，以構筑的核酸適配體比色傳感器測定江水樣品中pcb77含量的回收率為97％之間，相對標準偏差(n＝3)為9.2％。從測試的結果來看，制備的核酸適配體比色傳感器在測定pcb77時表現出較高的靈敏度與準確性。該核酸適配體比色傳感器的制備為水體中pcb77的分析檢測提供一種簡便、快捷的分析方法。
以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，這并不影響本發明的實質內容。