MALDI?TOFMS技術鑒定臨床感染豬腸球菌的方法與流程

本發明涉及細菌檢測領域，尤其是公開了一種maldi-tofms技術鑒定臨床感染豬腸球菌的方法。

背景技術：

腸球菌為革蘭陽性兼性厭氧菌，是動物性食品污染的常見菌之一，近來腸球菌對動物致病性的報道不斷增多，尤其是20～70日齡豬常發生一種高熱、皮下及實質臟器腫大、出血為主要特征的傳染病，以散養和小規模豬群多發，給養豬業造成了嚴重的經濟損失。由于腸球菌對現有抗生素均產生不同程度的耐藥性，且抗性基因通過食物鏈由動物傳播給人或在其他細菌之間傳遞，這使得腸球菌快速準確的鑒定顯得尤為重要，并對感染腸球菌的診斷和治療具有重要意義。

技術實現要素：

本發明克服現有技術存在的不足，提供一種操作簡便、快速、準確性高的鑒定臨床感染豬腸球菌的方法。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：maldi-tofms技術鑒定臨床感染豬腸球菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：采用甲酸提取法對樣品進行處理與點樣；

1)向1.5mlep離心管中加入300μl去離子水；取待測樣本(一個菌落)5-10mg至離心管中；充分混勻；加入900μl無水乙醇，充分混勻；

2)13000rpm離心2min，倒去上清。再次離心，用移液槍完全吸取殘余的上清液，整個過程不觸碰沉淀。室溫下干燥沉淀2-3min。

3)加入70％甲酸水溶液50μl，充分混勻；再加入50μl的純乙腈，充分混勻；13000rpm離心2min，吸取上清置于另一新的離心管中；

4)取上清1μl置于maldi靶板上，室溫晾干，再加1μlhcca基質液覆蓋樣品，室溫晾干后上機；

5)分別取等體積的標準肽溶液與基質溶液混合后，取1μl混合液置于maldi靶板上，室溫晾干，待完全干燥后進行檢測，每個樣品和標準品各做三個平行孔。

步驟二：利用maldibiotyper高通量微生物鑒定系統對經過步驟一處理的樣品進行質譜分析，得到質譜圖；

放入已點好樣品和校準品的靶板。打開flexcontrol，校準儀器，先用標準品進行系統誤差校正，再進行待測樣本的質譜分析，通過biotyper軟件進行分析鑒定。

步驟三：使用biotyper軟件，對得到的質譜圖進行分析，得到腸球菌質譜圖數據庫的標準圖譜；

步驟四：將待檢測的腸球菌用腦心浸液瓊脂培養及分純，并進行步驟一和步驟二處理；

步驟五：對待檢測的腸球菌質譜圖進行聚類分析。

所述步驟一具體包括以下步驟：1)向1.5mlep離心管中加入300μl去離子水；取待測樣本5-10mg至離心管中；充分混勻；加入900μl無水乙醇，充分混勻；

2)13000rpm離心2min，倒去上清；再次離心，用移液槍完全吸取殘余的上清液，整個過程不觸碰沉淀；室溫下干燥沉淀2-3min；

3)加入70％甲酸水溶液50μl，充分混勻；再加入50μl的純乙腈，充分混勻；13000rpm離心2min，吸取上清置于另一新的離心管中；

4)取上清1μl置于maldi靶板上，室溫晾干，再加1μlhcca基質液覆蓋樣品，室溫晾干后上機；

5)分別取等體積的標準肽溶液與基質溶液混合后，取1μl混合液置于maldi靶板上，室溫晾干，每個樣品和標準品各做三個平行孔；所述步驟二具體包括以下步驟：放入已點好樣品和校準品的靶板；打開flexcontrol，校準儀器，先用標準品進行系統誤差校正，再進行待測樣本的質譜分析，通過biotyper軟件進行分析鑒定。

所述樣品為16srrna確認的臨床株；所述標準品為atcc29212糞腸球菌。

所述步驟三具體包括以下步驟：對樣品處理與點樣，每個平行樣品重復點3個樣品孔；每個樣品孔采集8張質譜圖；每個菌株采集24張譜圖，共收集到240張并保存；使用biotyper軟件，分別調入所采集的每株腸球菌的質譜圖，將此質譜圖匯總進行分析，該圖譜即為腸球菌質譜圖數據庫的標準圖譜。

所述待檢測的腸球菌為33株腸球菌臨床野生株。

本發明與現有技術相比有以下有益效果：

本發明采用的檢測方法與傳統和基因型鑒定方法相比，maldi-tofms是基于蛋白指紋圖譜的鑒定方法，操作簡便、快速、準確性高。本研究從河南不同地區病豬分離的腸球菌，利用maldi-tofms方法鑒定均為糞腸球菌和屎腸球菌，且親緣關系較近。而糞腸球菌和屎腸球菌是所有腸球菌感染致病中較為常見的菌株，也是醫院、食品和豬糞等環境中的優勢菌，由于腸球菌具有較強的獲得性耐藥能力，且在各種環境中生存能力較強，maldi-tofms方法對腸球菌的快速鑒定，可避免菌株的傳播和更多耐藥菌株的產生，對于獸醫臨床實踐具有重要的意義。

附圖說明

圖1為腸球菌的主要離子峰圖譜；

圖2為33株腸球菌的可信度分值；

圖3為33株腸球菌指紋圖譜的聚類分析。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述，以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

本實施例中，10株建庫的腸球菌為16srrna確認的臨床株，33株建庫后驗證的腸球菌為臨床野生分離株。質控菌株atcc29212為糞腸球菌，以上均為河南農業大學贈送。

實驗中用到的甲酸、乙腈、三氟乙酸、無水乙醇都是由fisher公司提供的色譜純。bts標準品、基質α-氰-4-羥基肉桂酸(hcca)、msp96孔靶由德國bruker公司提供。

革蘭陽性細菌鑒定卡(gpi；生產批號：b56k)，購自法國生物梅里埃中國有限公司產品；

腦心浸液瓊脂培養基(bhi)(生產批號：160220)購自北京陸橋；maldibiotyper高通量微生物鑒定系統，購自德國brukerdahonics公司，參數設置：線性操作模式，正離子，基質抑制偏轉模式。脈沖離子提取時間：100ns。相對分子質量：2000～20000d；

具體鑒定方法包括如下步驟：

步驟一：采用甲酸提取法對樣品進行處理與點樣；

步驟二：利用maldibiotyper高通量微生物鑒定系統對經過步驟一處理的樣品進行質譜分析，得到質譜圖；

步驟三：使用biotyper軟件，對得到的質譜圖進行分析，得到腸球菌質譜圖數據庫的標準圖譜；

步驟四：將待檢測的腸球菌用腦心浸液瓊脂培養及分純，并進行步驟一和步驟二處理；

步驟五：對待檢測的腸球菌質譜圖進行聚類分析。

1.2.1樣品處理與點樣采用甲酸提取法

1)向1.5mlep離心管中加入300μl去離子水；取待測樣本(一個菌落)5-10mg至離心管中。充分混勻；加入900μl無水乙醇，充分混勻；

2)13000rpm離心2min，倒去上清。再次離心，用移液槍完全吸取殘余的上清液，整個過程不觸碰沉淀。室溫下干燥沉淀2-3min；

3)加入70％甲酸水溶液50μl，充分混勻；再加入50μl的純乙腈，充分混勻；13000rpm離心2min，吸取上清置于另一新的離心管中；

4)取上清1μl置于maldi靶板上，室溫晾干，再加1μlhcca基質液覆蓋樣品，室溫晾干后上機；

5)分別取等體積的標準肽溶液與基質溶液混合后，取1μl混合液置于maldi靶板上，室溫晾干，待完全干燥后進行檢測，每個樣品和標準品各做三個平行孔；

1.2.2數據采集

放入已點好樣品和校準品的靶板。打開flexcontrol，校準儀器，先用標準品進行系統誤差校正，再進行待測樣本的質譜分析，通過biotyper軟件進行分析鑒定。

1.2.3建立數據庫的方法

按1.2.1.1的方法進行樣品處理與點樣，每個平行樣品重復點3個樣品孔。每個樣品孔采集8張質譜圖。每個菌株采集24張譜圖，共收集到240張并保存。使用biotyper軟件，分別調入所采集的每株腸球菌的質譜圖，將此質譜圖匯總(已有數據庫和新建數據庫)進行分析，該圖譜腸球菌質譜圖數據庫的標準圖譜。

1.2.4臨床野生株的鑒定

取33株腸球菌臨床野生株，用腦心浸液瓊脂(bhi)培養及分純，

參照上述建庫時的處理方法，然后上機。

1.2.5結果判斷如表1所示為質譜數據判斷標準

表1

2結果

2.1建庫

經過16srrna確認的10株腸球菌臨床株，用于建立maldi-tofms數據庫，對10株菌全部進行了數據采集與匯總，建立了標準圖譜，最終建成包含10株腸球菌信息的數據庫，如圖1所示。這10株腸球菌菌株的主要離子峰一致，峰譜穩定；

2.2臨床野生株的鑒定

依次將1-33株腸球菌如圖2所示，分別進行鑒定，分析與腸球菌數據庫中的匹配結果。經maldi-tofms鑒定，33株腸球菌的匹配分值均大于2.300，表明鑒定結果的可信度很高。

2.3腸球菌maldi-tofms質譜聚類分析結果

選取33株腸球菌質譜圖進行聚類分析，采用相似分值構建系統樹，33株腸球菌聚類分型樹狀圖如圖3所示。差異程度0-1000表示菌株之間的同源性程度高低，差異程度越接近1000，表示菌株同源性越低，越接近0時表示菌株同源性越高。經maldi-tofms分析33株腸球菌在差異程度為0.8時分成兩個主要的類別，用不同的顏色標示，其中綠色為糞腸球菌共13株，紅色為屎腸球菌20株,1號菌株為糞腸球菌atcc29212，與5號菌株同源性最高，與屎腸球菌相比，糞腸球菌的親緣關系更近一些。

以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換,凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。