一種三維熒光差分超分辨顯微方法及裝置與流程

本發明屬于光學超分辨顯微領域，特別涉及一種三維熒光差分超分辨顯微方法及裝置。

背景技術：

1873年，德國科學家abbe提出光學成像系統的“衍射極限”，任何光學顯微鏡都存在一個分辨率極限，由光波長以及透鏡的數值孔徑決定。光學顯微成像系統由于“衍射極限”的存在，在可見光波段無法實現200納米以下的高分辨成像。為此人們不斷努力，研究發展超分辨成像技術，希望突破衍射極限，獲得更高的分辨率。2014年從事熒光超分辨光學顯微術的三位科學家獲得了諾貝爾化學獎，他們開啟了人類利用熒光標記方法實現超分辨顯微的大門。從此，人類的光學顯微已進入超分辨時代。

現在主流超分辨顯微成像技術可以大致分為兩類：一類是基于經典共焦系統，如受激輻射淬滅顯微術(sted)，熒光發射微分顯微術(fed)；另一類是基于寬場成像系統，如隨機光學重組顯微術(storm)、結構光照明顯微術(sim)、光子活化定位顯微術(palm)等等。近年來，超分辨技術得到了迅猛發展，其發展方向已經不在單單局限于橫向分辨率的提高，而是向著提高三維分辨率、提高成像速度、系統集成化緊湊化發展。以上提到的超分辨顯微術中，有的已經向三維方向發展，為醫學或生物學研究人員提供更多的微觀信息。

隨著分辨率的提升，光學超分辨顯微方法和裝置越來越受到醫學和生物學領域研究人員的青睞。其快速直觀無損的特定，使其得到了更多的應用，因此，高集成化、易使用，高分辨率的光學超分辨顯微裝置也成為了研究者們關注的重點。

技術實現要素：

本發明提供了一種三維熒光差分超分辨顯微方法及裝置，可以實現超越衍射極限的三維分辨率。系統結構緊湊，單激發光路，調校方便，該方法裝置簡單，成像速度快，對樣品沒有特殊熒光染料要求。可應用于生物、醫學研究中對衍射極限一下微觀結構細節的三維成像。

本發明的具體技術方案如下：一種三維熒光差分超分辨顯微裝置，包括激光器、承載待測樣品的電動樣品臺和將光線投射到所述電動樣品臺的顯微物鏡，所述激光器與顯微物鏡之間依次設有：

用于將所述激光器發出的激光轉換為平行光的準直器；

用于將所述激光器發出的光束改變為線偏振光的起偏器；

用于調制所述光束偏振方向的第一二分之一波片；

用于依次調制光束水平分量和垂直分量的空間光調制模塊；

用于對所述相位調制后的光束進行光路偏轉的掃描振鏡系統；所述圓偏振光通過所述顯微物鏡投射到所述待測樣品上；

依次布置的分別用于對所述掃描振鏡系統出射的光束進行聚焦和準直的掃描透鏡和場鏡；

并設有用于控制所述空間光調制器和掃描振鏡系統的控制器及收集所述待測樣品發出的信號光的探測系統。

優選的，所述的空間光調制模塊包括：

空間光調制器，由所述計算機控制加載黑色背景或同時加載0～π相位調制圖案和0～2π渦旋相位調圖案；

反射鏡，用于將空間光調制器反射的光束再次反射進入空間光調制器內；

位于所述空間光調制器和反射鏡之間的第一四分之一波片，用于將兩次經過的光束的偏振方向轉過90度。

進一步優選的，所述的空間光調制模塊和掃描振鏡系統間設有用于將偏振光轉換為圓偏振光的第二二分之一波片和第二四分之一波片。

本發明中，探測系統包括：

布置在第二四分之一波片和掃描振鏡系統之間的分束鏡。所述分束鏡在待測樣品為熒光樣品時應選用二色鏡。

用于濾去分束鏡出射的信號光中的雜散光的帶通濾波片，所述帶通濾波片在待測樣品為非熒光樣品時可以省略；

用于探測信號光束的光強信號的探測器，所述探測器選用光電倍增管(pmt)或雪崩光電二極管(apd)；

用于將濾光后的信號光束聚焦到探測器上的聚焦透鏡；用于對所述信號光束進行空間濾波的空間濾波器，其位于所述聚焦透鏡的焦平面處，所述空間濾波器可以采用針孔或多模光纖，若采用針孔，所用針孔的直徑應小于一個艾里斑直徑。

所述激光器與起偏器之間依次設有用于對所述激光光束進行濾波的單模光纖。

所述空間光調制器液晶屏幕在左右兩側同時加載0～π相位調制圖案和0～2π渦旋相位調圖案；

空間光調制器中加載調制圖案和黑色背景的切換頻率與掃描振鏡系統的空間掃描頻率相同，從而實現掃描振鏡系統配合電動樣品太每掃描一次三維空間，空間光調制器的調制函數切換一次。

優選的，所述顯微物鏡的數值孔徑na＝1.49。

根據上述的三維熒光差分超分辨顯微裝置，本發明的顯微方法包括以下步驟：

1)激光器發出的激光光束在準直后轉換為線偏振光；

2)調節第一二分之一波片，使光束的偏振方向與空間光調制器可調節偏振方向成α角；

3)將偏振光入射至空間光調制器的屏幕一側，利用該側加載的0～π相位調制圖案對偏振光進行相位調制；

4)控制空間光調制器反射后的光束重新折返入射至空間光調制器的屏幕另一側，利用該側加載的0～2π渦旋相位調圖案進行相位調制；

5)兩次調制后的激光光束在轉化為圓偏后經掃描振鏡系統和顯微物鏡聚焦到樣品上并進行掃描；

6)在掃描過程中實時收集被測樣品各被激發點發出的信號光，得到一次掃描信號光強i1(x,y,z)；

7)將步驟3)和步驟4)內的空間光調制器上僅加載黑色背景，重復步驟3)～6)，對相同的三維空間進行第二次掃描，得到二次掃描信號光強i2(x,y,z)；

8)根據公式i(x,y,z)＝i2(x,y,z)-r×i1(x,y,z)計算最終信號光強i(x,y,z)，并利用i(x,y,z)得到超分辨圖像；其中r＝i2^max/2×i1^max，i2^max為i2(x,y,z)的最大值，i1^max為i1(x,y,z)中的最大值。

本發明中，當待測樣品為熒光樣品時，所述信號光為所述圓偏振光經顯微物鏡投射后在樣品上激發出的熒光；當待測樣品為非熒光樣品時，所述信號光為所述圓偏振光經顯微物鏡投射后經樣品表面的反射光束。

其中，被測樣品上x，y，z軸方向由三維掃描方式決定。

作為優選的，最終信號光強i(x,y,z)為負值時，令i(x,y,z)＝0。

本發明原理如下：

根據經典衍射理論，實際光學系統對平行光的聚焦效果，并非理想的點，而是一個可計算其空間尺寸的梭形空間分布，長軸延光軸方向，在焦面上即衍射斑或艾里斑。艾里斑范圍內的樣品都會被激發從而發出信號光，使得在艾里斑范圍內的樣品細節無法被分辨。因此，顯微系統的分辨率受到衍射極限的限制。所以，突破衍射極限的限制，提高顯微系統的分辨率，減小艾里斑面積是關鍵。理論上艾里斑是無法通過光學器件減小的，但是可以通過其他手段減小系統最終的等效激發面積，從而達到提高分辨率的目的。同理對于三維超分辨而言，提高顯微鏡分辨率，減小空間聚焦光斑的體積是關鍵。

在本發明方法中，空間光調制器左側加載0～π相位調制圖案右側加載0～2π渦旋相位調制圖案。當光束被0～π相位調制后，根據矢量光場衍射理論，由狄拜積分計算可知，此時光束經顯微物鏡聚焦后的光場，在焦面空間附近為一強度極弱的空心圓柱，圓柱兩端為強度較強的細實心圓柱。。當光束被0～2π渦旋相位調制后，同理可計算得到，此時光束經顯微鏡物鏡聚焦后在焦面空間附近為一個空心圓柱分布，在焦面上為一個甜甜圈形空心光斑

光束首先入射到空間光調制器的左側，此時空間光調制器左側加載的0～π相位圖案只對光束水平方向的分量進行調制，垂直分量未被調制。當光束經偏振旋轉90度后，再次入射到空間光調制器上左側時，之前的水平分量變為垂直分量，其不會被再次調制，之前的垂直分量變為水平分量，被空間光調制器右側加載的0～2π渦旋相位圖案調制。這樣，兩個方向的分量被不同的調制圖案進行調制，此時光束經顯微物鏡聚焦到焦面時，上述兩種空間光場分布疊加，在焦面附近得到近似的空心橢球體光場分布，長軸延光軸方向。該空心橢球激發范圍激發樣品所得信號光強為i1(x,y,z)。

當空間光調制器加載黑色背景是，理論上不對激發光做任何調制，我們可以認為空間光調制器只起到平面反射鏡的作用。此時，由狄拜積分計算可知，光束經顯微成像物鏡聚焦后在焦面附近為一個實心光斑。該實心光斑激發范圍內激發樣品所得信號光強為i2(x,y,z)。根據公式i(x,y,z)＝i2(x,y,z)-r×i1(x,y,z)計算最終信號光強i(x,y,z)。顯然i(x,y,z)所對應的各掃描點處的有效信號光發光體積將小于i2(x,y,z)所對應的各掃描點處發光體積。因此，與常規光學顯微方法相比，本發明減小了有效信號光的發光體積，從而可以實現超衍射極限的分辨率。

相對于現有的技術，本發明具有以下有益的技術效果：

(1)可以實現在較低激發光功率的前提下，提供三維超衍射極限的分辨率；

(2)由于只需要兩次掃描，相比于以往類似方法3次掃描的系統，成像速度提高三分之一。

(3)單激發光路，使得系統緊湊，省去多路調重合的步驟，易于調校。

(4)單空間光調制器加載兩幅調制圖案，簡約成本。

附圖說明

圖1為本發明中基于熒光受激發射微分的三維超分辨裝置示意圖；

圖2為本發明中0～π相位調制圖案；

圖3為本發明中被0～π相位調制后，光束聚焦得到的焦面xy方向及xz方向的光場分布；

圖4為本發明中0～2π渦旋相位調制圖案；

圖5為本發明中被0～2π相位調制后，光束聚焦得到的焦面xy方向及xz方向的光場分布；

圖6本發明中光束經兩次調制后聚焦后的焦面xy方向及xz方向的光場分布；

圖7為普通共聚焦顯微鏡焦面處xy方向光場分布與本發明方法焦面處xy方向光場分布，即普通共焦顯微鏡橫向有效發光面積和本發明系統橫向有效發光面積；

圖8為普通共聚焦顯微鏡焦面處xz方向光場分布與本發明方法焦面處xz方向光場分布，即普通共焦顯微鏡縱向有效發光面積和本發明系統縱向有效發光面積。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖來詳細說明本發明，但本發明并不僅限于此。

如圖1所示三維熒光差分超分辨顯微，包括：激光器1，單模光纖2a，準直器3，起偏器4，反射鏡5a，1/2波片6a，d形反射鏡7，空間光調制器8，1/4波片9a，透鏡10，反射鏡5b，反射鏡5c，1/2波片6b，1/4波片9b，四帶通二色鏡11，振鏡掃描系統12，掃描鏡13，場鏡14，顯微物鏡15，樣品太16，四帶通濾波片17，電動小孔18，單模光纖2b，探測器19，控制系統及pc機20。

其中，單薄光纖2a、準直器3、起偏器4和反射鏡5a依次位于激光器1出射的光軸之上，起偏器4的透光軸方向應使得透射后的光強最大。

其中，d形反射鏡位于折轉后的激光器1光軸之上，并將光束第一次折轉入射至空間光調制器8左側。

其中，1/4波片9a、透鏡10、反射鏡5b位于空間光調制器8折轉后的光束光軸之上，反射鏡5b也位于透鏡10的焦面上。

光束被反射鏡5b反射，并再次經過1/4波片9a、透鏡10入射到空間光調制器右側，第二次經空間光調制器反射至反射鏡5c，由5c對光束進行轉折。其中1/2波片6b，1/4波片9b及四帶通二色鏡11位于經反射鏡5c折轉后的光軸上。

光束被二色鏡11反射進入振鏡掃描系統12，其中掃描鏡13、場鏡14、顯微物鏡15和電動樣品臺16依次位于掃描振鏡系統出射光束的光軸上。電動樣品臺16位于物鏡15焦面處。

四帶通濾波片17、電動小孔18和探測器19位于信號光光軸上。

控制系統及pc機20與空間光調制器8、探測器19及掃描振鏡系統相連接，用于控制空間光調制器8上圖案的切換。空間光調制器在上位pc機及控制系統20的控制下，在相位調制圖案和黑色背景間切換。

上述裝置中，顯微物鏡15的數值孔徑na＝1.49；所用小孔為一電動小孔裝置，其自帶聚焦透鏡和可切換直徑的一系列小孔，在本發明中裝置中使用0.7個艾里斑的小孔；探測器19為光電倍增管(pmt)。

采用圖1所示裝置實現三維超分辨的過程如下：

激光器1發出的光束耦合進單模光纖2a中，通過單模光纖2a導入準直器3，光束從準直器3出射后為平行光，經偏振片4轉換為線偏振光。經過反射鏡5a，1/2波片6a和d形反射鏡7入射到空間光調制器8左側。其中，調節1/2波片快軸，使得光束的偏振方向與水平方向夾角為54.5度。此時空間光調制器8左側加載0～π相位調制圖案，如圖2所示。0～π相位調制的調制函數可以用極坐標表示為，

其中，θmax為入射光半徑的最大值；

此時，偏振方向與水平方向成54.5度的光束的水平分量被上述0～π相位調制函數調制。其在轉化成圓偏光后，經物鏡聚焦后的焦面附近處光場分布如圖3所示。光束被空間光反射，經過1/4波片9a和透鏡10，被反射鏡5b反射后，再次經過透鏡10和1/4波片9a，入射到空間光調制器右側。反射鏡5b位于透鏡10的焦點上，使得反射鏡的面形對光束波前的影響降到最低。調節1/4波片9a的快軸，使得入射偏振光束兩次經過1/4波片9后，偏振方向轉過90度入射到空間光調制器8右側。空間光調制器右側加載0～2π渦旋相位調制圖案，如圖4所示，其相位調制函數可以寫成：

此時，之前被空間光調制器8左側圖案調制的水平分量變為垂直分量，無法被調制。之前未被調制的垂直分量變為水平分量，即被空間光調制器8右側加載的0～2π渦旋相位調制圖案調制。該分量轉化為圓偏光后，經物鏡聚焦后的焦面附近處光場分布如圖5所示。

光束經空間光調制器右側反射后，再被反射鏡5c反射，經過1/2波片6b和1/4波片9b轉化為圓偏光。圓偏振光束經四帶通二色鏡11反射，進入振鏡掃描系統12，再經掃描鏡13和場鏡14進入物鏡15，聚焦到樣品面上，其光場分布如圖6所示，即為圖3和圖5所示光場的疊加。樣品上被圓偏光束激發的區域，發出信號光，經場鏡14、掃描鏡13、振鏡系統12、四帶通二色鏡11、四帶通濾光片17進入電動小孔18，由電動小孔18自帶的透鏡聚焦至小孔，再由單模光纖2b將信號光導入探測器19，進而進入pc機20內存。

控制器及pc機20和空間光調制器8、探測器19、振鏡掃描系統12及電動樣品臺相連。由控制器及pc機20控制振鏡掃描系統12及電動樣品臺16完成三維空間的逐點掃描，并記錄各點信號，從而得到信號光強i1(x,y,z)。

通過控制器調整空間光調制器8上的圖案，使其全屏加載黑色背景，重復上述步驟，得到信號光強i2(x,y,z)。利用公式i(x,y,z)＝i2(x,y,z)-r×i1(x,y,z)得到最終有效信號光強i(x,y,z)。普通共聚焦顯微鏡焦面處xy方向光場分布與本發明所述方法焦面處xy方向光場分布如圖7所示。普通共聚焦顯微鏡焦面處xz方向光場分布與本發明所述方法焦面處xz方向光場分布如圖8所示。

以上所述僅為本發明的較佳實施舉例，并不用于限制本發明，凡在本發明精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。