一種嗜酸乳桿菌S?層蛋白分子印跡傳感器及其制備方法和應用與流程

本發明屬于材料制備和檢測技術領域，涉及嗜酸乳桿菌s-層蛋白的檢測和富集技術，具體為一種嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器及其制備方法和應用。

背景技術：

s-層蛋白是存在于細胞膜或細胞壁外的一種表層蛋白，是一類由蛋白質亞基組成的單層晶體結構，有多種乳酸菌表面存在s-層蛋白。嗜酸乳桿菌是黏附于腸道內的一種功能性益生菌，其表面的s-層蛋白在黏附中起到重要作用，對嗜酸乳桿菌發揮益生功能有重要貢獻；s-層蛋白可以和腸上皮細胞表面的受體結合，阻斷致病菌與病毒與其結合，因此對致病菌與病毒有一定抑制作用。對s-層蛋白進行快速、有效的檢測可推進其進一步的研究。目前對s-層蛋白的檢測技術主要有質譜技術、氨基酸組分分析技術等，這些方法成本較高且操作復雜。因此開發一種操作簡便、準確快速且高效的檢測方法十分重要。

光子晶體是一種介電常數周期性變化排布的材料，由于具有光學帶隙的特征，與可見光作用可發生bragg衍射。分子印跡技術以特定的目標分子為模板，構建能對該分子進行特異性識別的分子印跡聚合物。傳統的分子印跡技術用于檢測時，多數被檢測物需要被修飾或標記，光子晶體分子印跡傳感器克服了這一障礙，實現了無標記檢測。分子印跡水凝膠與光子晶體結合，形成高度有序的三維孔隙結構，在受到外界環境刺激或與被檢測分子結合后，水凝膠會發生收縮或溶脹，導致晶格間的間距減小或增大，從而使bragg衍射特征峰發生藍移或紅移，使目標分子的狀態直接轉變為刻度的光學信號。

技術實現要素：

解決的技術問題：為了克服現有技術的缺陷，獲得一種簡便、快速、高選擇性及高靈敏度的嗜酸乳桿菌s-層蛋白的檢測、富集方法，本發明提供了一種嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器及其制備方法和應用。

技術方案：一種嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器，所述傳感器以二氧化硅為載體，s-層蛋白為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯劑。

一種嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器的制備方法，包含以下步驟：

(1)將二氧化硅納米顆粒分散于無水乙醇中，形成均一穩定的膠體分散體系，然后經垂直沉降將膠體顆粒自組裝在基片上，形成三維有序的膠體顆粒陣列，待溶劑完全揮發，得到具有三維有序排列結構的膠體晶體，形成光子晶體薄膜；

(2)將光子晶體薄膜依次進行熱處理、羥基化處理、氨基化處理及醛基化反應，然后置于s-層蛋白溶液中，縮合反應實現共價連接；

(3)以甲基丙烯酸為功能單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯劑，甲醇為溶劑配制水凝膠預聚液，向預聚液中加入光引發劑，超聲混勻后通入氮氣排氣體系中的氧氣；

(4)取步驟(2)制得的覆蓋有光子晶體薄膜的基片，在薄膜一邊覆蓋一層有機玻璃，固定后向縫隙中注入步驟(3)制得的預聚液，充分浸透后、冰浴條件下紫外照射反應；

(5)將步驟(4)處理后的光子晶體薄膜浸泡于氫氟酸中，接著采用蛋白洗滌工藝除去薄膜中的s-層蛋白，即可制得嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器。

優選的，步驟(2)中熱處理的條件為500℃、1小時。

優選的，步驟(2)中羥基化處理是采用piranha洗液處理12小時。

優選的，步驟(2)中氨基化處理是采用5％aptes的乙醇溶液處理1小時。

優選的，步驟(2)中醛基化反應是與含有5％戊二醛的pbs溶液反應2.5小時。

所述的嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器在檢測嗜酸乳桿菌s-層蛋白中的應用。

優選的，所述嗜酸乳桿菌s-層蛋白的濃度與bragg衍射峰的位移呈線性關系。

優選的，所述傳感器的響應速度小于3分鐘。

所述的嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器在嗜酸乳桿菌s-層蛋白富集中的應用。

有益效果：(1)本發明所述傳感器以膠體晶體作為模板得到三維有序孔隙結構，通過分子印跡技術在孔隙結構中得到印跡空腔，保證了對目標分子的高度選擇性和靈敏度；(2)所述傳感器內部結構相通，促進目標分子在其中擴散并容易到達識別位點，從而提高傳感器對目標分子的響應時間，實現目標分子的快速檢測和富集。

附圖說明

圖1是本發明所述嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器制備流程圖；

圖2是實施例2所述嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器對不同濃度s-層蛋白響應曲線圖；

圖3是實施例2中嗜酸乳桿菌s-層蛋白的濃度與bragg衍射峰的位移線性關系圖；

圖4是實施例2所述嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器對嗜酸乳桿菌表層蛋白提取液中s-層蛋白的響應圖；

圖5是實施例2中嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器對s-層蛋白的響應速度圖；

圖6是實施例3中嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器富集s-層蛋白的sds-page鑒定圖。

具體實施方式

以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。

實施例1

一種嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器，所述傳感器以二氧化硅為載體，s-層蛋白為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯劑。

一種嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器的制備方法，包含以下步驟：

(1)將單分散性良好的sio2顆粒超聲分散在乙醇溶液中，濃度為0.3g/ml左右。取10ml分散好的sio2乳液至小燒杯，然后載玻片垂直插入燒杯中固定好，通過垂直沉降法，使膠體顆粒自組裝在潔凈的載玻片上，形成三維有序的膠體顆粒陣列，待溶劑完全揮發后，得到具有三維有序排列結構的sio2膠體晶體，形成光子晶體薄膜。

(2)將光子晶體薄膜在500℃條件下處理1h，以增強其機械性能。然后對其進行表面修飾，具體操作為：將其浸泡在piranha洗液中12h，使sio2微球表面暴露出羥基基團，然后用雙蒸水清洗干凈并用氮氣流吹干；接下來將光子晶體薄膜浸泡于含有5％aptes的乙醇溶液中1h，使微球表面產生氨基基團；然后將光子晶體薄膜浸泡于含有5％戊二醛的pbs溶液2.5h，戊二醛一端的醛基與sio2微球上的氨基發生反應，使微球醛基化。然后以pbst洗液多次清洗光子晶體薄膜，并將清洗后的薄膜置于濃度為1mg/mls-層蛋白的pbs溶液中，4℃下保持12h，使s-層蛋白分子上的氨基與sio2微球表面的醛基縮合，實現蛋白在微球表面的共價連接。

(3)配置水凝膠預聚液：甲基丙烯酸0.5ml，二甲基丙烯酸乙二醇酯0.25ml，甲醇1ml，將配置好的預聚液放置在4℃下靜置12h，使其充分混合；然后向預聚液中加入10mg光引發劑偶氮二異丁腈，超聲10min使其混合均勻，并持續通入氮氣10min以排盡其中的氧氣。

(4)取步驟(2)制備的光子晶體基片，在其表面覆蓋一層75mm×25mm的有機玻璃，并用夾子固定好，形成上層為pmaa有機玻璃，中間為光子晶體薄膜，下層為載玻片的三明治結構；用移液槍預聚液緩慢地注入玻璃縫隙，在毛細作用力下預聚液會進入玻璃空隙，直到光子晶體薄膜的顏色變透明則預聚液得到了充分浸透。在冰浴條件下用紫外燈(uv＝365nm)照射30min引發預聚液發生光聚合。

(5)將步驟(4)處理后的光子晶體薄膜浸泡于2％氫氟酸溶液中，除去sio2顆粒，得到三維有序的反蛋白石光子晶體水凝膠膜。接著將水凝膠膜在naoh/naclo(0.5/1.0％)溶液中處理6小時，然后用醋酸的sds溶液反復清洗三次以除去水凝膠膜中的模板蛋白，即獲得嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器。

所述嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器的制備流程如圖1所示。

實施例2

將實施例1制備獲得的嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器應用于檢測嗜酸乳桿菌s-層蛋白。

分別配置1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、1ng/ml的s-層蛋白溶液，將嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器分別浸沒在各蛋白溶液中，室溫下靜置5min，然后用光纖光譜儀檢測bragg衍射峰的位置，得到衍射峰位移大小與蛋白濃度的數量關系，結果如圖2所示。

如圖3所示，在1ng/ml-1mg/ml的范圍內，隨著s-層蛋白濃度的增加，bragg衍射峰的位移逐漸增大；s-層蛋白的濃度與bragg衍射峰的位移有良好的線性關系，線性擬合方程為y＝1.7307x+0.0443，且r²＝0.9935。

嗜酸乳桿菌表層蛋白提取液中s-層蛋白含量的測定：將粗提液稀釋10倍，用嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器對其進行檢測，采用光纖光譜儀分析其bragg衍射峰。圖4顯示bragg衍射峰的位移為10nm。經過線性擬合方程計算可得檢測液中的s-層蛋白濃度為0.056mg/ml，則s-層蛋白粗提液中的s-層蛋白濃度為0.56mg/ml。

為檢測嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器的響應速度，用1μg/ml的s-層蛋白溶液對其進行光譜響應檢測，即將水凝膠膜置于s-層蛋白溶液中，每隔1min進行一次光譜檢測，并記錄其bragg衍射峰的位移值。圖5為嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器對s-層蛋白的響應速度圖，以bragg衍射峰位移為縱坐標，時間為橫坐標，由圖可見，響應時間在3min以內，實現了對s-層蛋白的快速檢測。

實施例3

采用嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器對嗜酸乳桿菌表層蛋白提取液中s-層蛋白的富集：將嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器浸沒在嗜酸乳桿菌表層蛋白提取液中5min，接著浸入pbs溶液振蕩清洗30min，收集清洗所得的pbs溶液，并用sds-page檢測該溶液中是否存在目標蛋白。

圖6為sds-page結果，從圖中可以看出有一條清晰的目標條帶，表明經過pbs溶液振蕩洗滌，有部分s-蛋白被洗脫下來。在s-層蛋白粗提液中存在一些雜蛋白，該結果說明嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器選擇性捕獲了s-層蛋白，不受溶液中其他蛋白的影響。則該嗜酸乳桿菌s-層蛋白分子印跡傳感器可以實現對s-層蛋白的富集所用。