Arl13b蛋白在癌癥診斷中的應用的制作方法

本發明屬于分子生物學技術領域，特別涉及基因診斷。

背景技術：

隨著人類生活環境、生活水平和生活方式的變化，惡性腫瘤成為日益常見且嚴重威脅人類生命和生活質量的主要疾病之一。全球每年新發癌癥1400多萬例，其中較為常見的是肺癌、乳腺癌；每年全球有820萬人死于癌癥，最常見的死因為肺癌。癌癥發病地圖顯示，雖然我國癌癥發病率在為全球中等水平，為2.8％，但死亡率卻處于中等偏上水平，為27％。我國癌癥的發病情況具有一定特點：肝癌發病為50.5％，死亡率為51.4％，均占全球肝癌發病、死亡的一半；食管癌、胃癌同樣占全球發病、死亡的近50％；肺癌比例較高，約占全球新發病例1/3。globocan對全球癌癥發病、死亡進行預測，到2020年，預計約1714萬人將罹患癌癥，1005萬人將死于癌癥。

雖然近年來癌癥病人不斷增加，但是癌癥的五年生存率顯著提高。與1995年-1999年相比，我國2005年-2009年主要癌癥的5年生存率得到了較明顯的提高，比如：胃癌由15.3％增加至31.3％，結腸癌由33.5％增加至54.6％，直腸癌由28.9％增加至53.2％，肝癌由2.4％增加至12.5％，肺癌由7.5％增加至17.5％，乳腺癌由53.8％增加至80.9％，宮頸癌由40.1％增加至59.9％。治療技術進步如手術技術水平的提高；先進的化療藥物和放療技術的應用和越來越多的高效靶向藥物的發現等是癌癥治愈率提高的一個重要原因。但是人們更多地將其歸功于對癌癥病灶的早發現、早診斷和早治療。

arl13b是一個小分子gtp酶，其特異性地在多種器官的初級纖毛中聚集。arl13b對初級纖毛的形成和功能的發揮起著非常關鍵的作用，參與囊泡運輸、細胞分化、細胞運動和細胞骨架形成等過程。在arl13b蛋白缺失的情況下，纖毛短小且結構受損。在人類中，arl13b基因的突變會導致joubert綜合癥。arl13b基因缺失的小鼠有纖毛結構受損和hedgehog信號通路活性異常等現象，并表現出與joubert綜合癥病人相似的癥狀。近期，有文獻報道arl13b調節腫瘤細胞的生長。

因此，研究發明出對于癌癥的準確和特異性的診斷試劑或試劑盒有迫切的需求。

技術實現要素：

本發明的目的是提供能夠準確診斷癌癥的指標、診斷試劑或試劑盒、arl13b蛋白的診斷試劑盒的用途，以及體外檢測其表達量的方法。

本發明的一個目的是，提供了一種癌癥診斷的指標。

本發明的第二個目的是，提供了一種癌癥診斷試劑盒。在該方面的一個優選例中，抗arl13b抗體偶聯有可檢測基團，可檢測基團選自生色團、化學發光基團、熒光團或同位素。

本發明的第三個目的是，提供了一種癌癥診斷試劑盒。在該方面的一個優選例中，含有arl13b蛋白特異性的核酸探針偶聯有可檢測基團，可檢測基團選自生色團、化學發光基團、熒光團或同位素。

本發明的第四個目的是，arl13b蛋白或其核酸序列在制備診斷試劑或試劑盒的用途。在該方面的一個優選例中，癌癥診斷試劑是抗arl13b蛋白特異性抗體或arl13b蛋白特異性核酸探針。

本發明的第五個目的是，提供了一種體外檢測特異性arl13b蛋白表達的方法，包括：用抗arl13b蛋白特異性抗體或arl13b特異性核酸探針與細胞樣品反應，以正常細胞為對照；比較抗體或探針的結合量，其中高于對照的量表明該細胞為癌細胞，低于或等于對照的量表明該細胞為正常細胞。在該方面的一個優選例中，結合量是通過檢測與探針或抗體偶聯的可檢測基團測得的。

本發明具有以下優點：(1)arl13b作為腫瘤的標志物，可用于腫瘤的病情診斷和預后判斷；(2)arl13b可作為腫瘤的潛在的治療靶點。

附圖說明

圖1為沉默arl13b對腫瘤細胞增殖能力的影響。

圖2為過表達arl13b對腫瘤細胞增殖能力的影響。

圖3為沉默arl13b對腫瘤細胞侵襲能力的影響。

圖4為過表達arl13b對腫瘤細胞侵襲能力的影響。

圖5為沉默arl13b對腫瘤細胞遷移能力的影響。

圖6為過表達arl13b對腫瘤細胞遷移能力的影響。

圖7為arl13b沉默抑制胃癌細胞在裸鼠體內的生長。

圖8為arl13b過表達促進胃癌細胞在裸鼠體內的生長。

圖9為westernbolt法檢測胃癌組織與癌旁組織中arl13b的表達量。

圖10為kaplan–meier生存分析不同程度arl13b的表達與總生存期和無疾病生存期的關系。

以上圖中，n-shh：n-shh刺激液；control：對照培養基；vector：對照胃癌細胞；arl13b-kd：穩定胃癌細胞mkn45；gapdh：甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

具體實施方式

下面將提供實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，下列實施例僅用于舉例說明本發明，而不應被視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件進行。

實施例1：平板克隆法檢測arl13b對腫瘤細胞增殖能力的影響。

取對數生長期的arl13b沉默的穩定胃癌細胞mkn45(arl13b-kd)和對照胃癌細胞(vector)或過表達arl13b的穩定胃癌細胞mkn28(arl13b)和對照胃癌細胞(vector)，去除培養基，加胰酶充分消化2-3min后加入500μl含10％血清的dmem高糖培養基中和胰酶，吹打混勻細胞，使細胞分離成單細胞。取1000個細胞/孔接種到6孔板中，加n-shh刺激液(n-shh)或對照培養基(control)，并使細胞均勻分散。放置于37℃，5％co2培養箱中培養14-20天。當觀察到肉眼可見的克隆時，終止培養。除去培養基，加4％多聚甲醛溶液37℃固定10min。除去固定液后，經pbs洗滌3次后，加入0.2％的結晶紫染色20-30min。pbs多次洗去染色液至pbs澄清后置于空氣干燥。將6孔板倒置于專業掃描儀進行掃描。使用imagej軟件去除背景并對單位面積(1cm²)的結晶紫染色克隆數進行計算，**表示p<0.01。結果表明，arl13b促進腫瘤細胞的增殖(圖1，圖2)。

實施例2：transwell實驗檢測arl13b對腫瘤細胞侵襲能力的影響。

腫瘤細胞經饑餓處理12h。用50mg/lmatrigel1：8稀釋液包被transwell小室底部膜的上室面，4℃風干。吸出培養板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/lbsa的無血清培養液，37℃，30min。將transwell小室放入24孔板中，在上室加入300μl預溫的無血清培養基，室溫下靜置15－30min，使基質膠再水化。再吸去剩余培養液。消化arl13b沉默的穩定胃癌細胞mkn45(arl13b-kd)和對照胃癌細胞(vector)或過表達arl13b的穩定胃癌細胞mkn28(arl13b)和對照胃癌細胞(vector)，終止消化后離心棄去培養液，用pbs洗1－2遍，用含bsa的無血清培養基重懸，調整細胞密度至1－10×10⁵。取細胞懸液200μl加入transwell小室，24孔板下室加入500μl含20％fbs的培養基，加n-shh刺激液(n-shh)或對照培養基(control)，培養24h。將小室轉移至新的培養孔中，水洗至適當顏色，用棉簽擦拭去小室內部未穿過上室膜面的細胞。往小室內加入100μlpbs，倒置顯微鏡觀察穿過去的細胞，200×光鏡下計數10個視野的侵襲細胞數，取其平均值，以侵襲細胞的相對數目表示腫瘤細胞的侵襲能力，**表示p<0.01。結果顯示，arl13b促進腫瘤細胞的侵襲(圖3，圖4)。

實施例3：migration實驗檢測arl13b對腫瘤細胞遷移能力的影響。

用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻的劃橫線，大約每隔0.5～1cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。在孔中加入約5×10⁵個arl13b沉默的穩定胃癌細胞mkn45(arl13b-kd)和對照胃癌細胞(vector)或過表達arl13b的穩定胃癌細胞mkn28(arl13b)和對照胃癌細胞(vector)，，接種原則為過夜后融合率達到100％。第二天用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜(不同孔之間最好使用同一只槍頭)。pbs洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清的n-shh刺激液(n-shh)或無血清對照培養基(control)。放入37℃5％co2培養箱，培養。可按0，12，24h時間點取樣，拍照(具體時間依實驗需要而定)。使用imagej軟件打開圖片后，隨機劃取6至8條水平線，計算細胞間距離的均值，**表示p<0.01。結果表明，arl13b促進腫瘤細胞的遷移(圖5，圖6)。

實施例4：arl13b促進胃癌細胞在體內的生長。

購買24只balb/c-nu雌性裸鼠，4-6周齡，體重18-22g；通過隨機數字表將24只裸鼠分為兩組：①慢病毒沉默對照組(vector)+arl13b沉默組(arl13b-kd)；②慢病毒過表達對照組(vector)+arl13b過表達組(arl13b)；并稱量每只裸鼠的體重。用0.25％胰蛋白酶消化arl13b沉默的穩定胃癌細胞mkn45(arl13b-kd)和對照胃癌細胞(vector)或過表達arl13b的穩定胃癌細胞mkn28(arl13b)和對照胃癌細胞(vector)，1000r/min離心，pbs洗滌2次，用pbs配制約i×10⁸細胞/ml。用帶6號針頭的注射器抽取0.2ml含2×10⁷個活細胞的細胞懸液，接種于每只裸鼠的大腿內側皮膚(左右分別為對照組，干擾或過表達組)。注射后第七天時，對照組和處理組瘤體大致相等時開始實施引用水中加入多西環素(2mg/ml)誘導表達，每2天換水一次，給藥3-4周:每三天用游標卡尺測量一次移植瘤的體積(v)：v＝a×b²/2(a為長徑，b為短徑)，并觀察裸鼠精神、活動情況等生理指標的變化。3-4周后，麻醉無痛處死裸鼠，切取移植瘤，并稱量其重量。與對照組(vector)相比，穩定下調arl13b組(arl13b-kd)小鼠的瘤體更小，瘤重更輕(圖7)。然而，與對照組(vector)相比，在穩定過表達arl13b組(arl13b)實驗中，我們觀察到過表達arl13b后瘤體更大，瘤重更重(圖8)。

實施例5：檢測胃癌組織與癌旁組織中arl13b的表達量。

準備好碎冰，5ml離心管稱重并做好標記，與pbs一起冰上預冷。隨機取8例胃癌病人的癌組織及其對應的癌旁組織組織凍存管用裝有液氮的保溫杯轉移，剪取部分組織，放入預冷的離心管內，剩余的組織放回凍存管內，放回原處；稱重組織，記錄；用預冷的pbs洗滌組織，2-3次，洗去粘附的血液；剪碎組織，加入含有1：100蛋白酶抑制劑和1mmpmsf的ripabuffer，加入比例組織：buffer＝1:10(g/ml)；在組織破碎儀上勻漿組織，13000g，10s，至組織較碎；組織要時刻保持在冰上；旋轉儀上，4℃旋轉30min，使組織充分裂解；裂解液轉入ep管，離心，4℃，12000g，15min；取上清，即得所需組織蛋白裂解液；取100μl蛋白定量及做westernblot，其余若暫時不用放-80℃保存。bca蛋白定量，根據所得的數值，定量擬合曲線，得出線性方程和稀釋后的蛋白濃度，計算實際的蛋白濃度。取適量的蛋白western上樣檢測正常組織與癌組織中arl13b的蛋白含量。結果表明arl13b在癌組織中表達量比正常組織高(圖9)。

實施例6：arl13b的表達量與胃癌病人的病情和預后相關。

選取的154例胃癌病例中病理保存有石蠟包埋樣本，組織類型經1名有經驗的病理科醫生對入選蠟塊來源的組織切片he染色進行確定。對154例胃癌標本(包括154例對應的癌旁組織)進行免疫組化分析。免疫組化評分依照“德國半定量評分系統”進行評分，依照0～12分評分標準，劃定0～6分為陰性及低表達，>6分為中高表達。依照arl13b分高低將每個指標評分為兩組并與臨床病理特征進行性相關性分析。分析結果見表1，結果提示：高表達arl13b與腫瘤大小，浸潤深度有關。

為明確arl13b在胃癌組織中高表達對患者預后的影響，我們對納入研究的患者進行隨訪。設定觀察時間為總生存期(overallsurviva)，及無疾病生存期(disease-freesurvival)。運用kaplan–meier分析進行單因素生存分析發現：arl13b高表達能顯著影響患者os及dfs，評分越高患者生存期越短(圖10)。表明arl13b與臨床預后具有顯著的相關性。

表1arl13b與臨床病理特征間的關系

綜合上述具體實施例測定結果，arl13b在腫瘤組織高表達，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。

因此，arl13b蛋白或其核酸序列可被用于制備診斷癌癥的試劑或試劑盒。將抗arl13b蛋白特異性抗體或arl13b蛋白特異性核酸探針作為癌癥診斷試劑與細胞樣品反應，通過檢測與探針或抗體偶聯的可檢測基團獲得抗體或探針的結合量，與正常細胞的結合量進行比較，可用于癌癥的診斷。