檢測A型副雞嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒及其檢測方法及其應用與流程
本發明涉及生物檢測技術領域，尤其涉及一種檢測a型副雞嗜血桿菌抗體的間接elisa試劑盒及其檢測方法及其應用。
背景技術：
副雞嗜血桿菌(haemophilusparagallinarum，hpg)是雞傳染性鼻炎的病原，該病臨床癥狀為雞的急性上呼吸道感染，鼻腔和鼻竇發炎，眼結膜發炎，流淚，病雞產蛋量下降，生長緩慢。雞傳染性鼻炎頻發于世界的各個地區，呈地方流行性，雖然該病致死率相對較低，但副雞嗜血桿菌可在雞群長期存在，降低雞的生產性能，導致產蛋率降低，育成雞生長遲緩，并且降低了病雞抵御其它疾病的能力，在抵抗力較弱的情況下極易繼發其它傳染病而死亡，給養殖戶造成巨大的經濟損失，嚴重阻礙了養殖業的發展。
目前關于副雞嗜血桿菌分子病原學的研究資料還很少，相關報道集中于診治。對于雞傳染性鼻炎的診斷方法和疫苗免疫效果的評價方法如臨床診斷、血凝試驗等不適合大范圍的樣品檢測，對于雞傳染性鼻炎疫情監測以及疫苗的有效評估均需要建立更為靈敏、快捷的檢測方法。血凝素(ha)是hpg抗原中重要的成分，也是hpg分型的基礎，具有較好的抗原反應性，可與hpg的陽性血清發生反應，對于雞傳染性鼻炎的流行病學檢測以及免疫效果的監測具有廣泛的應用前景。
技術實現要素：
有鑒于此，本發明實施例提供了一種檢測a型副雞嗜血桿菌抗體的間接elisa試劑盒及其檢測方法及其應用，主要目的是提供一種簡便、快速及準確檢測a型副雞嗜血桿菌抗體的方法。
為達到上述目的，本發明主要提供了如下技術方案：
一方面，本發明實施例提供了一種檢測a型副雞嗜血桿菌抗體的間接elisa試劑盒，所述試劑盒包括：包被酶標板、洗滌液、血清稀釋液、底物顯色液、兔抗雞酶標二抗、終止液、a型hpg標準陽性血清和a型hpg標準陰性血清；其中，所述包被酶標板是以a型副雞嗜血桿菌重組血凝素蛋白作為包被抗原。
作為優選，所述a型副雞嗜血桿菌重組血凝素蛋白的核苷酸序列表為seq.id.no.1。
作為優選,所述a型副雞嗜血桿菌重組血凝素蛋白的制備方法包括：
設計合成引物，以a型副雞嗜血桿菌hpg-8菌株的基因組為模板，通過pcr擴增得到血凝素的擴增產物，所述擴增產物連接其表達載體并同時進行雙酶切以構建重組質粒；將挑選的陽性重組質粒轉化大腸桿菌bl21(de3)感受態細胞，獲得陽性質粒單克隆菌，所述陽性質粒單克隆菌在iptg誘導下進行蛋白表達得到誘導產物，所述誘導產物依次經純化和復性后得到重組血凝素蛋白；其中，所述合成引物為：
上游引物：5'-cgcggatccatgaaaaaaactgcaatcg-3'，
下游引物：5'-ccgctcgagctcgttacctttaactgagat-3'。
作為優選,所述洗滌液為含0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，ph為7.4。
作為優選,所述血清稀釋液為含50g/l脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液；所述底物顯色液為含有過氧化氫的四甲基聯苯胺溶液。
作為優選,所述終止液為2m硫酸溶液。
作為優選,所述包被抗原的包被濃度為5.0μg/ml；所述包被酶標板經50g/l脫脂奶粉pbst封閉，裝入密封袋中置于4℃保存。
作為優選,所述兔抗雞酶標二抗的稀釋倍數為1:2500。
另一方面，本發明實施例提供了上述檢測a型副雞嗜血桿菌抗體的間接elisa試劑盒的檢測方法，所述檢測方法包括以下步驟：
用血清稀釋液以體積比1：200的比例稀釋待檢血清得到稀釋血清；
向96孔酶標板每孔中加入100μ所述稀釋血清，向酶標板各添加兩孔a型hpg標準陽性血清和a型hpg標準陰性血清作為對照，于37℃孵育1h，棄去反應孔中液體，再向每孔加入300μl洗滌液并洗滌3次，每次5分鐘，棄洗滌液，最后一次拍干；
向96孔酶標板每孔中加入100μl以體積比1:2500稀釋后的兔抗雞酶標二抗，于37℃孵育1h，棄去反應孔中液體，向每孔中加入300μl洗滌液并洗滌3次，每次5分鐘，棄洗滌液，最后一次拍干；
向96孔酶標板每孔中加入100μl底物顯色液，室溫下避光作用10分鐘；
向96孔酶標板每孔加入100μl終止液以終止顯色反應；
用酶標儀在450nm波長下測定各孔吸光光度(od)值；
根據od值判定，當od450值≥0.34時，判定a型hpg抗體水平為陽性，當od450值＜0.34時，判定a型hpg抗體水平為陰性。
又一方面，本發明實施例提供了上述檢測a型副雞嗜血桿菌抗體的間接elisa試劑盒在檢測a型副雞嗜血桿菌抗體中的應用。
與現有技術相比，本發明的有益效果是：
本發明的間接elisa試劑盒，使用a型副雞嗜血桿菌(hpg)重組血凝素(ha)蛋白作為包被抗原，該蛋白為a型hpg重組ha基因擴增產物，以pet-28a-ha為表達載體的表達產物，易于制備和純化，其免疫反應性良好；該重組ha蛋白純化后作為包被抗原，其濃度易于確定和控制，有利于該試劑盒的大量生產與成本控制。
本發明的試劑盒用于檢測a型副雞嗜血桿菌的抗體，具有高效、靈敏特異性和重復性均良好的優點，該試劑盒操作簡便、快速、成本低廉，適合于在臨床應用中進行推廣，為a型副雞嗜血桿菌的快速檢測提供可靠的技術手段。
附圖說明
圖1是本發明實施例1提供的pet-28a-ha/b2l表達菌陽性單克隆鑒定核酸瓊脂糖凝膠電泳圖(圖中，m是dm2000plusdnamarker，1是pet-28a-ha雙酶切分析，2是ha基因擴增產物)；
圖2是本發明實施例1提供的a型副雞嗜血桿菌ha重組蛋白的誘導表達及表達形式的分析和純化圖(圖中，m是廣譜蛋白marker，1是未誘導pet-28a-ha，2-4分別誘導4h、5h及6h的pet-28a-ha，5是純化的ha重組蛋白)；
圖3本發明實施例1提供的westernblot鑒定圖(圖中，m是預染蛋白marker，1是a型副雞嗜血桿菌陽性血清，2是spf雞血清)。
具體實施方式
為更進一步闡述本發明為達成預定發明目的所采取的技術手段及功效,以下以較佳實施例，對依據本發明申請的具體實施方式、技術方案、特征及其功效，詳細說明如后。下述說明中的多個實施例中的特定特征、結構、或特點可由任何合適形式組合。
實施例1
1.a型副雞嗜血桿菌ha(ha指血凝素)蛋白表達載體的構建：
提取副雞嗜血桿菌hpg-8菌株(購自中國獸藥監察所)的基因組dna，設計合成引物haf:5'-cgcggatccatgaaaaaaactgcaatcg-3'(下劃線為bamhi酶切點)，har:5'-ccgctcgagctcgttacctttaactgagat-3'(下劃線為xhoi酶切位點)，擴增獲得ha基因擴增產物，擴增產物長度為1032bp，其核苷酸序列詳見seq.id.no.1,膠回收ha基因目的片段(擴增產物)，連接克隆載體peasy-tl，16℃連接過夜，連接產物轉化trans5α克隆感受態細胞，并涂布至卡那霉素抗性(100mg/ml)的lb平板，于37℃培養過夜，挑取單克隆，于卡那霉素抗性的lb培養基中振蕩培養10h后，提取質粒，酶切鑒定；
選取鑒定正確的peasy-t1-ha質粒，pet-28a空質粒，分別用bamhi和xhoi雙酶切，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收pet-28a載體條帶和ha基因目的條帶，將回收產物16℃連接過夜；連接產物轉化trans5α克隆感受態細胞，常規化選取陽性克隆，提取菌體質粒酶切鑒定，鑒定為陽性質粒送公司測序；將測序正確的重組質粒命名為pet-28a-ha，如圖1所示。
2.重組質粒的誘導表達
將構建正確的重組質粒pet-28a-ha轉入大腸桿菌感受態細胞bl21，常規化選取陽性克隆，提取菌體質粒酶切鑒定，陽性質粒命名為pet-28a-ha/bl21，按體積分數1％轉接至5ml新鮮含卡那霉素抗性的lb培養基，振蕩培養至對數生長期(3.5h左右)，加入0.1％iptg進行誘導，繼續誘導培養6h，取1ml菌液，4℃、12000r/min離心5min收集沉淀，加入100μlpbs(磷酸緩沖液，ph為7.4))重懸菌體后，加入25μlsds-page上樣緩沖液，沸水煮10min，12000r/min離心10min，進行sds-page電泳分析，電泳結果參照蛋白分子質量標準，可見誘導表達獲得蛋白大小為37ku，如圖2所示，與預測結果相符，證明該重組質粒在大腸桿菌中得到了誘導表達；
取1ml誘導6h的菌液，8000r/min離心5min收集菌體沉淀，加入100μlpbs重懸，超生裂解，4℃、12000r/min離心10min離心分離上清液和包涵體，用sds-page上樣緩沖液分別處理上清液和沉淀，進行sds-page電泳分析，由電泳結果可見重組ha蛋白已在沉淀中表達。
3.a型副雞嗜血桿菌重組ha蛋白的westernblot試驗
取誘導后6h菌液進行page-sds電泳，將電泳后的page-sds電泳凝膠，不經染色，直接用轉印裝置將蛋白以150ma轉印到padf膜上，轉印1.5h，轉膜完畢后，小心取出padf膜，在tbst中漂洗一下，置于封閉液(含2.5％脫脂奶粉的tbst)中室溫封閉1h(緩慢搖動)；棄封閉液，溫育后的padf膜用tbst洗3次，每次10min，把padf膜放入用封閉液合適比列稀釋的一抗(雞a型hpg陽性血清)中，4℃孵育過夜(緩慢搖動)，棄一抗，孵育后的padf膜tbst洗3次，每次10min，把padf膜放入用封閉液稀釋的二抗(酶標抗雞lgg二抗)，平穩搖動，室溫孵育1h。棄二抗，用padf膜用tbst洗3次，每次10min，按照eeclwesternblotkit說明書進行顯色，暗室壓片曝光。
4.重組ha蛋白的純化復性
將pet-28a-ha/bl21加入5mllb培養基，活化培養過夜，取5ml菌液加入500mllb培養基中，培養至對數期，加入0.1％iptg(iptg是指異丙基硫代半乳糖苷，一種誘導劑)后，誘導培養6h，收集菌液5000rpm離心10min，棄上清，再加入200mlpbs(磷酸鹽緩沖液，ph＝7.4)重懸，再次5000rpm離心10min，棄上清；將加入50ml的細菌裂解液重懸菌體，超生破碎，12000rpm離心10min，收集沉淀；用包涵體洗滌液重懸沉淀，12000rpm離心10min，棄上清，共洗3次；加入5ml的含8mol/l尿素的包涵體溶解液，室溫溶解30min，12000rpm離心10min，取上清用0.45μm濾器過濾，加入到proteinisoni-nta進行純化，用180mmol/l的咪唑進行洗滌，收集1ml洗滌液，用300mmol/l的洗脫液進行洗脫，每次收集1ml的洗脫液，連收集10次，經sds-page檢驗，可見純化效果良好，該蛋白易于制備和純化；
將一定量的蛋白裝入截留分子質量為15ku的透析袋中，用不同濃度的尿素(6，4，2和1mol/l)的透析液a、透析液b(20mmol/ltris-hci，0.6mmol/ll-精氨酸，10％甘油，2mmol/ledta，0.5mol/l尿素，ph8.0)和透析液c(20mmol/ltris-hci，25mmol/lnac1，0.2mol/l尿素)中進行蛋白的梯度復性，共六個階段，每個階段12h，于4℃緩慢的磁力攪拌；透析結束，收集復性蛋白，并用微量蛋白濃度測量儀測定蛋白濃度為1mg/ml，可見該蛋白易于純化復性。
5.樣品稀釋液、洗滌液、終止液的配制
包被液為0.05m碳酸鹽緩沖液：na2co31.59g，nahco32.93g，加蒸餾水定容至1000ml，ph為9.6；
樣品稀釋液為含50g/l脫脂奶粉的洗滌液；
洗滌液為含0.05％tween-20的0.01mph為7.4的磷酸鹽緩沖液，其配方為：
nacl：8.5g，nah2po4·2h2o：0.356g，nah2po4·12h2o：2.772g，將其混合后，再用蒸餾水溶解并定容至1000ml，再向其中加入0.5ml吐溫-20得到上述洗滌液；
終止液為含2m硫酸溶液：將21.8ml濃硫酸稀釋定容至200ml得到上述2m硫酸溶液。
6.抗原(重組ha蛋白)的最適包被濃度和血清的最適稀釋度的確定
采用正交試驗來確定抗原最適包被濃度，血清最適稀釋度和酶標二抗最佳工作濃度；將純化復性后的重組ha蛋白用包被液依次稀釋為2.5μg/ml、5.0μg/ml和7.5μg/ml三個稀釋度，以100μl/孔的量滴加到96孔聚苯乙烯微量反應板中，組成方陣，4℃包被過夜；棄去抗原液，用洗滌液充分洗滌3次，300μl/孔，5min/次，用50g/l脫脂乳封閉，200μl/孔，37℃作用1h；棄去封閉液，用上述方法進行洗滌；將a型hpg標準陽性血清、陰性血清一次做1:50、1:100、1:200、1:400倍稀釋后，以100μl/孔的量滴加到96孔聚苯乙烯微量反應板中，37℃作用1h；棄血清，用上述方法洗滌，加入1:2500倍稀釋的酶標二抗，以100μl/孔的量滴加到96孔聚苯乙烯微量反應板中，于37℃作用1h；棄去酶標二抗，用上述方法洗滌，加入底物顯色液，100μl/孔，37℃避光顯色10min，最終加入終止液終止反應；用酶標儀在450nm波長下測定od值；比較陰、陽性血清的od450值，即選擇陽性樣品od450值(p值)約為1.0，陰性樣品od450值(n值)在0.1左右，并且p/n值最大時為最佳抗原包被濃度及血清和二抗稀釋度。
正交試驗結果顯示當抗原的稀釋度為5.0μg/ml每孔，血清以1:200倍稀釋，酶標二抗以1:2500倍稀釋時，陽性樣品od450值(p值)約為1.0，陰性樣品od450值(n值)在0.1左右，并且p/n值為10.93最大，因此確定重組ha蛋白的最佳包被濃度為5.0μg/ml，血清最佳稀釋度為1:200，酶標二抗最佳稀釋度為1:2500，下述表1為間接elisa正交試驗結果。
7.作用時間的優化
以抗原、血清和酶標二抗最佳作用濃度為基礎，優化抗原的最佳封閉時間(37℃1h、1.5h和2h)、血清反應時間(37℃0.5h、1h、1.5h)、酶標二抗最佳孵育時間(37℃0.5h、1h、1.5h)以及最佳顯色時間(37℃，10min、20min、30min)等條件，取陽性樣品od450值(p值)約為1.0，陰性樣品od450值(n值)在0.1左右，并且p/n值最大時，為最佳的作用時間，最終確定抗原的最佳封閉時間為1h，血清反應時間為1h，酶標二抗最佳孵育時間為1h，最佳顯色時間為10min。
8.陰陽性標準臨界值的確定
取25份a型副雞嗜血桿菌抗體為陰性的血清樣品，按照確定的條件進行間接elisa，用酶標儀在450nm波長下測定od值，計算od450的平均值
9.間接elisa操作程序的確定(試劑盒的檢測方法的確定)
按照以上各項所確定的最佳操作條件，確定間接elisa操作程序為：取出已包被并封閉好的elisa板條，用血清稀釋液將待檢血清做1：200倍稀釋，加入酶標板各孔，每孔100μl，各加一孔，a型副雞嗜血桿菌陰性、陽性血清各加兩孔，37℃作用1h；棄去孔內液體，每孔用300μl洗滌液洗滌3次，每次5min，最后一次洗滌完后，在吸水紙上拍打，棄盡孔內液體；每孔加入100μl酶標二抗，37℃作用1h；棄去孔內液體，每孔用300μl洗滌液洗滌3次，每次5min，最后一次洗滌完后，在吸水紙上拍打，棄盡孔內液體；每孔加入100μltmb(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)底物顯色液后，室溫避光顯色10min，加入100μl終止液；用酶標儀在450nm波長讀取各孔od值，判定結果。
表1.間接elisa正交試驗結果
實施例2
elisa試劑盒的特異性試驗：
按已建立的間接elisa操作方法，利用elisa試劑盒分別檢測已知的a型副雞嗜血桿菌、雞新城疫、禽流感、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌和大腸桿菌陽性血清樣品；用酶標儀在450nm波長下測定各孔od值，確定該間接elisa檢測方法的特異性；
檢測結果表明，只有a型副雞嗜血桿菌陽性血清的od450>0.34，其他各分血清od450均小于0.34，說明該間接elisa檢測結果特異性良好。
實施例3
elisa試劑盒同批內的重復試驗：
使用同批誘導純化制備的a型副雞嗜血桿菌重組ha蛋白，按照最佳包被濃度包被酶標板，用已建的間接elisa操作方法，檢測a型副雞嗜血桿菌抗體水平不同的陽性血清和a型副雞嗜血桿菌陰性血清各3份，在不同時間分別檢測該6份隨機選擇的血清，用酶標儀在450nm波長下測定od值；根據每孔的od450值，計算各份血清的平均值
實施例4
elisa試劑盒批間重復性實驗：
使用不同批次純化復性后的a型副雞嗜血桿菌重組ha蛋白，按照最佳抗原包被濃度包被酶標板，用已建立的間接elisa操作方法，檢測同1份a型副雞嗜血桿菌陽性血清和1份a型副雞嗜血桿菌陰性血清，每孔設置4個重復，用酶標儀在450nm波長下測定od值；根據每孔的od450值，計算各份血清的平均值
本發明的間接elisa試劑盒，使用a型副雞嗜血桿菌(hpg)重組血凝素(ha)蛋白作為包被抗原，該蛋白為a型hpg重組ha基因擴增產物，pet-28a-ha表達載體的表達產物，易于制備和純化，其免疫反應性良好；該重組ha蛋白純化后作為包被抗原，其濃度易于確定和控制，有利于該試劑盒的大量生產與成本控制。
本發明的試劑盒用于檢測a型副雞嗜血桿菌的抗體，具有高效、靈敏特異性和重復性均良好的優點，該試劑盒操作簡便、快速、成本低廉，適合于在臨床應用中進行推廣，為a型副雞嗜血桿菌的快速檢測提供可靠的技術手段。
本發明實施例中未盡之處，本領域技術人員均可從現有技術中選用。
以上公開的僅為本發明的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應以上述權利要求的保護范圍為準。
sequencelisting
<110>楊凌職業技術學院，興平市眾和現代生態農牧有限公司
<120>檢測a型副雞嗜血桿菌抗體的間接elisa試劑盒及其檢測方法及其應用
<160>1
<210>1
<211>1032
<212>dna
<213>a型副雞嗜血桿菌
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