本發明屬于生物試劑盒材料領域，具體涉及一種用于糖類抗原242的定量檢測試劑盒及檢測方法，可快速、簡便、高效、靈敏地對人血清樣本中糖類抗原242的定性定量檢測。
背景技術：
：糖類抗原242（carbohydrateantigen242,ca242）是一種唾液酸化的粘蛋白型糖類抗原，在健康人群和良性疾病患者的血清中含量很低，消化道等發生惡性腫瘤（如胰腺癌、結腸癌、胃癌、卵巢癌、子宮癌、肺癌等）時其含量明顯上升，胰腺癌和結直腸癌時尤為明顯。作為一種腫瘤標志物，糖類抗原242的優點主要在于惡性腫瘤時升高明顯，而良性疾病時一般不升高。糖類抗原242與癌胚抗原（cea）聯合檢測，可增加對結、直腸癌的早期診斷敏感性，對監測術后復發亦是一個很好的診斷指標。糖類抗原242是胰腺癌病人中首先出現的一種與腫瘤相關的抗原。在診斷胰腺癌時，比糖類抗原19-9、糖類抗原50更為特異。ca242是一種唾液酸化的糖類抗原，能被結腸癌細胞株經雜交瘤技術得到的一系列單克隆抗體之一ca242所識別，它是一種存在于多器官惡性腫瘤中呈粘蛋白類型的糖蛋白叫canag，即不能與lewisa型抗原反應，也不能與唾液酸化的半乳糖苷反應。免疫化學研究已表明它不同于其他已知的腫瘤相關粘蛋白如：ca199、ca50、ca125、ca153等，健康人和良性疾病血清中含量較低。ca242是近年來應用于臨床較新的一種腫瘤標志物，胰腺癌和結腸癌較好的腫瘤標志物。ca242是一種唾液酸化的鞘糖脂類抗原，幾乎總是和ca50一起表達，但兩者受不同的單克隆抗體識別。在臨床上均被用于消化道惡性腫瘤尤其是胰腺癌、結直腸癌的診斷，與ca19-9、ca50相比，新一代的ca242在胰腺癌、膽囊癌和消化道癌中的靈敏度、特異性更高(ca50、ca19-9易受肝功能以及膽汁郁積的影響，在良性阻塞性黃疸以及肝實質性損害記疾病時常出現假陽性)。為了提高腫瘤診斷水平和改善治療效果，從檢測角度上來說，目前臨床上用于測定ca242抗原的方法主要有放射性免疫技術、酶聯免疫技術、時間分辨熒光免疫分析方法和化學發光技術等。過去以放射性免疫技術為代表的人ca242抗原測定試劑盒由于方法學的限制，其靈敏度和抗干擾能力嚴重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市場；目前應用較多的為酶聯免疫技術、時間分辨熒光免疫分析和化學發光技術，其中化學發光技術興起于上個世紀80年代，是繼酶聯免疫技術和放射性免疫技術之后發展起來的新興技術，由于其高靈敏度、高特異性，同時方法簡便、快速，標記結合物穩定，相對時間分辨熒光免疫法分析成本低廉、操作簡便，無放射性同位素損傷和污染等特點，得到了飛速發展。本試劑盒主要用于對相關惡性腫瘤患者進行動態監測以輔助判斷疾病進程或治療效果，不能作為相關惡性腫瘤早期診斷或確診的依據，不宜用于普通人群的腫瘤篩查。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術提供一種板式化學發光法檢測人血清ca242抗原的試劑盒及其制備方法，研發和優化了與血清學免疫反應原理相關的各種關鍵技術，從而提高了針對臨床患者體內的ca242抗原檢測靈敏度和準確性，開發出靈敏度高、穩定性好、生產便捷、操作方便的板式化學發光診斷試劑。本發明的主要設計思路是在化學發光免疫分析基礎上，通過引入具有抗生物素抗體-生物素體系，從而，穩定性試劑盒檢測特異性的同時，大幅增加了檢測靈敏度。本發明解決上述問題所采用的技術方案為：一種糖類抗原242的板式化學發光法檢測試劑盒，其特征在于：包括的試劑有生物素標記的ca242抗體溶液、抗生物素抗體包被的酶標板、辣根過氧化物酶標記的ca242抗體溶液、ca242校準品a-f、濃縮洗液、底物液a、底物液b。上述生物素標記的ca242抗體溶液的濃度為0.02～8.0μg/ml，所述抗生物素抗體包被的酶標板的抗生物素抗體的包被濃度為0.2～8.0μg/ml，所述辣根過氧化物酶標記的ca242抗體溶液的濃度為0.03～5.0μg/ml，陽性對照稀釋比為1：500～1：10000。上述ca242校準品a-f點是ca242抗原（北京玖峰潤達）以ph值為7.4的tris-hcl緩沖液配制得到的，濃度分別為0,4,16,48,144,288u/ml。上述生物素標記的ca242抗體溶液的制備過程：生物素標記的ca242抗體加入到ph值為7.4的緩沖液中，調節到適宜倍數，混勻得到。上述述辣根過氧化物酶標記的ca242抗體溶液的制備過程：辣根過氧化物酶標記的ca242抗體溶液加入到ph值為7.4的緩沖液中，調節到適宜倍數，混勻得到。上述抗生物素抗體包被的酶標板所用包被液為0.01m的碳酸緩沖液，ph9.6±0.1，所用封閉液的含0.3wt%bsa、0.1%proclin300(v/v)、1wt%羊血清、1wt%魚皮明膠、2wt%海藻糖和10wt%蔗糖的0.1mph7.4tbs緩沖液。針對本發明的抗生物素抗體包被體系，采用0.01m的碳酸緩沖液，并在封閉液中以少量bsa屏蔽了酶標板大部分未結合位點，在緩沖體系的協同作用下，以動物血清消除非特異性結合位點，保證了包被板的精密度和低本底，以蔗糖、海藻糖和魚皮明膠作為穩定體系，強化了包被板對高溫、干燥的抗性，保證了抗生物素抗體包被板的性能。抗生物素抗體包被的酶標板的制備過程為：酶標板采用高溫振蕩式包被，包被溫度為37±1℃，包被時間為1～3小時，采用低速振蕩包被形式，選用的振蕩儀為艾本森科學儀器有限公司微孔板振蕩器，振蕩幅度：3mm，采用水平回轉，轉速為200~500rpm，封閉和干燥溫度為37±1℃，封閉時間為1.5～3小時，干燥時間為2～4小時；采用高溫振蕩式包被工藝，包被板制備時間可控制在5～7小時，跟室溫包被普遍的3～4天制備時間相比，具備明顯的效率優勢，同時提高了反應的靈敏度，降低抗體/抗原使用量的同時，簡化了試劑生產流程，縮短了生產時間。國內包被板技術采用鏈霉親和素包被較多，采用抗生物素抗體尚未見專利文獻報告。另外，低速振蕩包被法相比常規的室溫包被法明顯縮短了包被板的生產時間，提高了試劑生產效率。本發明糖類抗原242的板式化學發光法檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟一、濃縮洗液的配制，步驟如下：1、稱取kcl60g、nacl300g于1l容器中；2、稱取20.0gtween-20于100ml容器中加50ml水使其完全溶解后，倒入上述1l容器中；3、用移液器將proclin-300量取2ml，倒入上述1l容器中；4、用量筒量取適量純化水于上述1l容器中，充分攪拌直至完全溶解；5、調ph，控制其范圍在7.35～7.45之間；6、最后定容至1000ml，完全溶解后用0.2μm濾器過濾即得；二、底物液的配制（一）底物液a的配制1、稱取硼砂11.44g、硼酸4.948g、魯米諾2.0g和對碘苯酚0.2mg于1l燒杯中；2、用量筒量取純化水于1l燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調ph，控制其范圍在7.95-8.05之間；3、用0.2μm濾器過濾收集濾液，用純化水定容至1000ml，混勻后即得；（二）底物溶液b的配制1、稱取硼砂11.44g、硼酸4.948g、過氧化脲0.2g和pc300500μl于1l燒杯中；2、用量筒量取純化水于1l燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調ph控制其范圍在7.95-8.05之間；3、用0.2μm濾器過濾收集濾液，用純化水定容至1000ml，混勻后即得；三、校準品稀釋液的配制方法，步驟如下：1、稱取tris12.11g和hcl7ml于1l的容器中，調節溶液ph,控制其范圍在7.35-7.45之間,定容至1000ml；2、用量筒量取小牛血清300ml，加入上述溶液中，作為校準品稀釋液備用；四、校準品的配制方法，步驟如下：1、校準品a點的配制：取校準品稀釋液，分裝到適宜規格；2、校準品b點的配制：取校準品稀釋液，將ca242抗原溶液稀釋適宜倍數，控制濃度為4u/ml，分裝到適宜規格；3、校準品c點的配制：取；校準品稀釋液，將ca242抗原溶液稀釋適宜倍數，控制濃度為16u/ml，分裝到適宜規格；4、校準品d點的配制：取校準品稀釋液，將ca242抗原溶液稀釋適宜倍數，控制濃度為48u/ml，分裝到適宜規格；5、校準品e點的配制：取校準品稀釋液，將ca242抗原溶液稀釋適宜倍數，控制濃度為144u/ml，分裝到適宜規格；6、校準品f點的配制：取校準品稀釋液，將ca242抗原溶液稀釋適宜倍數，控制濃度為288u/ml，分裝到適宜規格；五、抗生物素抗體包被的酶標板1、配制0.01m的碳酸緩沖液，調節ph至ph9.6±0.1，備用；2、在上述0.01m的碳酸緩沖液中加入抗生物素抗體溶液至終濃度為0.1～5μg/ml攪拌30分鐘至混合均勻；3、將上述混勻后的溶液按包被量為100μl每孔加入酶標板中，采用高溫振蕩式包被，包被溫度為37±1℃，包被時間為1～3小時，采用低速振蕩包被方式，選用的振蕩儀為艾本森科學儀器有限公司微孔板振蕩器，振蕩幅度：3mm，采用水平回轉，轉速為200~500rpm；4、配制0.1mph7.4tbs緩沖液，含0.3%bsa，1%羊血清，0.1%proclin300(v/v)，1%魚皮明膠，2%海藻糖和10%蔗糖，作為封閉液加入到清洗后的包被板中，封閉量為150μl每孔，封閉為37±1℃，封閉時間為2～5小時；5、吸掉封閉液，放置在干燥箱中，干燥溫度控制在37±1℃，干燥時間為2～4小時，再以鋁箔袋真空包裝，貼簽備用；六、辣根過氧化物酶標記ca242抗體溶液的制備（一）酶反應物稀釋液的配制1、取tris4.846g、hcl2900μl于燒杯中，然后在燒瓶中加入純化水，充分攪拌使試劑完全溶解；2、調ph，控制ph在7.35-7.45；3、稱取bsa4g倒入上述燒杯中；4、最后燒杯定容至400ml，用0.2um濾器過濾即得；（二）辣根過氧化物酶（hrp）與ca242抗體的偶聯1、取抗ca242抗體1mg放置于1ml玻璃管中；2、取200μldmso溶解抗體使抗體的終濃度到達5mg/ml，然后充分混勻；3、按照1mol抗體加入10mol的辛二酸二琥珀酰亞胺酯的摩爾比例加辛二酸二琥珀酰亞胺酯到上述2溶液中，37℃恒溫箱中反應1.5小時；4、按照3mol抗體加入1molhrp的摩爾比往上述3的溶液中添加hrp，然后加入1ml的ph為7.4濃度為0.1m的pb緩沖液，置于37℃恒溫箱中反應3小時；5、將上述4配制的溶液用pd-10柱純化，收集純化液，按照1:3000的體積添加自制的酶反應物稀釋液，控制最終使用濃度在0.03-5.0μg/ml，混合均勻即得酶反應物；七：生物素標記的ca242抗體溶液的制備（一）生物素反應物稀釋液的配制1、取tris4.846g、hcl2847μl于燒瓶中，然后在燒瓶中加入純化水，充分攪拌使試劑完全溶解；2、調ph，控制ph在7.35-7.45；3、稱取bsa4g倒入上述燒杯中；4、最后燒杯定容至400ml，用0.2μm濾器過濾即得；（二）取生物素化抗體，以生物素反應物稀釋液稀釋，控制最終使用濃度在0.5μg/ml左右（0.01～5.0μg/ml），混勻，即可得到生物素結合物。本發明試劑盒的檢測方法是，將樣品和生物素標記的ca242抗體加入到抗生物素抗體包被的酶標板中，樣品中的ca242抗原和該抗體結合形成免疫復合物，同時，該免疫復合物通過抗生物素抗體和生物素之間的結合作用被固定到酶標板上。使用洗液清洗酶標板，去除未結合的游離成分。加入辣根過氧化物酶標記的ca242抗體溶液，該酶標抗體通過免疫反應與被固定的免疫復合物結合。再次清洗酶標板后，加入底物液激發化學發光，測定相對光強度rlu，在一定濃度范圍內，rlu值與樣品中ca242抗原含量呈線性正比關系。通過校準品測值，擬合校準曲線，根據曲線計算樣品中ca242抗原濃度，從而評估人血清中是否含有ca242抗原以及ca242抗原的含量。與現有技術相比，本發明的板式化學發光法檢測血清ca242抗原的試劑盒及其制備方法，在化學發光免疫分析基礎上，通過引入具有抗生物素抗體包被的酶標板，并改進了高溫振蕩式抗生物素抗體包被工藝，通過抗生物素抗體-生物素方法體系，提高反應的靈敏度，節省生產成本，從而降低抗體/抗原使用量的同時，簡化了試劑生產流程，縮短了生產時間，簡化了檢測步驟，可為市場提供質優價廉、穩定可靠、重復性好、批間差小、準確度高的新一代檢測試劑盒。具體實施方式以下結合具體實施例對本發明進行說明，所舉的實施例僅是對本發明產品或方法作概括性例示，有助于更好地理解本發明，但并不會限制本發明范圍。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。本實施例的糖類抗原242的板式化學發光法檢測試劑盒主要試劑包括：包括的試劑有生物素標記的ca242抗體溶液、抗生物素抗體包被的酶標板、辣根過氧化物酶標記的ca242抗體溶液、ca242校準品a-f、濃縮洗液、底物液a、底物液b。試劑盒的制備方法一、濃縮洗液的配制，步驟如下：1、稱取kcl60g、nacl300g于1l容器中；2、稱取20.0gtween-20于100ml容器中加50ml水使其完全溶解后，倒入上述1l容器中；3、用移液器將proclin-300量取2ml，倒入上述1l容器中；4、用量筒量取適量純化水于上述1l容器中，充分攪拌直至完全溶解；5、調ph，控制其范圍在7.35～7.45之間；6、最后定容至1000ml，完全溶解后用0.2μm濾器過濾即得。二、底物液的配制（一）底物液a的配制步驟1、稱取硼砂11.44g、硼酸4.948g、魯米諾2.0g和對碘苯酚0.2mg于1l燒杯中；2、用量筒量取純化水于1l燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調ph，控制其范圍在8±0.05之間；3、用0.2μm濾器過濾收集濾液，用純化水定容至1000ml，混勻后即得。（二）底物溶液b的配制1、稱取硼砂11.44g、硼酸4.948g、過氧化脲0.2g和pc300500μl于1l燒杯中；2、用量筒量取純化水于1l燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調ph控制其范圍在8±0.05之間；3、用0.2μm濾器過濾收集濾液，用純化水定容至1000ml，混勻后即得。三、校準品稀釋液的配制方法，步驟如下：1、稱取tris12.11g和hcl7ml于1l的容器中，調節溶液ph,控制其范圍在7.35-7.45之間,定容至1000ml；2、用量筒量取小牛血清300ml，加入上述溶液中，作為校準品稀釋液備用；四、校準品的配制方法，步驟如下：1、校準品a點的配制：取校準品稀釋液，分裝到適宜規格；2、校準品b點的配制：取校準品稀釋液，將ca242抗原（北京玖峰潤達）溶液稀釋適宜倍數，控制濃度為4u/ml，分裝到適宜規格；3、校準品c點的配制：取；校準品稀釋液，將ca242抗原溶液稀釋適宜倍數，控制濃度為16u/ml，分裝到適宜規格；4、校準品d點的配制：取校準品稀釋液，將ca242抗原溶液稀釋適宜倍數，控制濃度為48u/ml，分裝到適宜規格；5、校準品e點的配制：取校準品稀釋液，將ca242抗原溶液稀釋適宜倍數，控制濃度為144u/ml，分裝到適宜規格；6、校準品f點的配制：取校準品稀釋液，將ca242抗原溶液稀釋適宜倍數，控制濃度為288u/ml，分裝到適宜規格。五、抗生物素抗體包被的酶標板6、配制0.01m的碳酸緩沖液，調節ph至ph9.6±0.1，備用；7、在上述0.01m的碳酸緩沖液中加入抗生物素抗體溶液至終濃度為0.3μg/ml攪拌30分鐘至混合均勻；8、將上述混勻后的溶液按包被量為100μl每孔加入酶標板中，采用高溫振蕩式包被，包被溫度為37±1℃，包被時間為1～3小時；9、配制0.1mph7.4tbs緩沖液，含0.3%bsa，1%羊血清，0.1%proclin300(v/v)，1%魚皮明膠，2%海藻糖和10%蔗糖，作為封閉液加入到清洗后的包被板中，封閉量為150μl每孔，封閉溫度為37±1℃，封閉時間為2～5小時；10、吸掉封閉液，放置在干燥箱中，干燥溫度控制在37±1℃，干燥時間為2～4小時，再以鋁箔袋真空包裝，貼簽備用；六、辣根過氧化物酶標記ca242抗體溶液的制備（一）酶反應物稀釋液的配制1、取tris4.846g、hcl2900μl于燒杯中，然后在燒瓶中加入純化水，充分攪拌使試劑完全溶解；2、調ph，控制ph在7.4±0.05；3、稱取bsa4g倒入上述燒杯中；4、最后燒杯定容至400ml，用0.2um濾器過濾即得；（二）辣根過氧化物酶（hrp）與ca242抗體的偶聯1、取抗ca242抗體1mg放置于1ml玻璃管中；2、取200μldmso溶解抗體使抗體的終濃度到達5mg/ml，然后充分混勻；3、按照1mol抗體加入10mol的辛二酸二琥珀酰亞胺酯的摩爾比例加辛二酸二琥珀酰亞胺酯到上述2溶液中，37℃恒溫箱中反應1.5小時；4、按照3mol抗體加入1molhrp的摩爾比往上述3的溶液中添加hrp，然后加入1ml的ph為7.4濃度為0.1m的pb緩沖液，置于37℃恒溫箱中反應3小時；5、將上述4配制的溶液用pd-10柱純化，收集純化液，按照1:3000的體積添加自制的酶反應物稀釋液，控制最終使用濃度在0.5μg/ml，混合均勻即得酶反應物；七：生物素標記的ca242抗體溶液的制備（一）生物素反應物稀釋液的配制1、取tris4.846g、hcl2847μl于燒瓶中，然后在燒瓶中加入純化水，充分攪拌使試劑完全溶解；2、調ph，控制ph在7.35-7.45；3、稱取bsa4g倒入上述燒杯中；4、最后燒杯定容至400ml，用0.2μm濾器過濾即得。（二）取生物素化抗體，以生物素反應物稀釋液稀釋，控制最終使用濃度在0.5μg/ml，混勻，即可得到生物素結合物。八、優化與驗證主要性能指標均符合發光檢測試劑技術評審規范。1、陰性符合率檢測130例貝克曼化學發光試劑檢測的臨床血樣，陰性符合率（-/-）為130/130，符合率100%。2、陽性符合率檢測204份貝克曼化學發光試劑檢測的臨床血樣，陽性符合率（+/+）為201/204，符合率為98.53%,見下表。3、重復性用經國家參考品標化的企業精密度參考品重復檢測10次，其變異系數cv在3.23-3.66%之間，符合不大于10.0%的行業規范（全自動儀器操作）。精密性質控品平均值標準差cv%l4.850.23.58%m68.952.53.66%h226.887.33.23%4、批間差用經國家參考品標化的企業精密度質控品檢測三個批號試劑盒，其批間變異系數（cv）在2.50～4.24%之間，符合行標小于15%的要求（全自動儀器操作）。分析結果如下：精密性質控品平均值標準差cv%l4.790.12.39%m68.612.94.17%h220.9610.14.59%5、穩定性熱穩定性：試劑盒在37℃放置7天后進行檢測，檢測信號與對照相比，變化幅度不超過15%。實施例中試劑盒的一種半自動儀器檢測方法，采用北京濱松光子技術股份有限公司微孔板發光分析儀bhp9504進行檢測，檢測步驟包括（1）取出試劑盒置于室溫，使試劑盒的溫度平衡至室溫（18～25℃）。（2）樣本應混合均勻，若樣本為凍融樣本，平衡至室溫（18～25℃）后再進行檢測。（3）按照濃縮洗液:蒸餾水=1:39的比例配制洗液，混合均勻后，轉入洗液瓶中。（4）取出檢測酶標板板條，設好校準品孔、待檢樣品孔。將其余板條放回鋁箔袋中，封存。（5）按表1順序，進行半自動加樣與反應操作。表1加樣和操作對照表底物液a和b也可在用前等體積混勻后每孔加100μl，如果底物液a和b混勻使用，則混合液應在30分鐘內被使用。實施例中試劑盒的一種半全自動儀器檢測方法，采用全自動化學發光免疫分析儀adcclia200/300/400/500/600以及smart3000/smart300/smart3000s進行檢測，檢測步驟包括（1）在使用全自動化學發光免疫分析儀（以下簡稱“儀器”）時，請務必仔細閱讀儀器的操作手冊，務必按照相應的操作說明對儀器進行設置、檢查和維護，以實現最佳檢測性能。（2）按照儀器的操作手冊說明配置試劑信息，并在“微板布局設置”中設置對照品孔和樣本孔的位置。特別地，請在儀器的“方法編輯”界面按照表2所示參數進行檢測方法配置。（3）按照表2全自動儀器參數設置表，進行參數設置與數據表2全自動化學發光免疫分析儀參數表除上述實施例外，本發明還包括有其他實施方式，凡采用等同變換或者等效替換方式形成的技術方案，均應落入本發明權利要求的保護范圍之內。當前第1頁12