一種精確熒光定量檢測方法與流程

本發明涉及一種精確熒光定量檢測方法，特別涉及一種利用熒光融合蛋白的精確定量檢測方法。

背景技術：

至上世紀70年代，發明酶標檢測技術平臺以來，免疫診斷行業已發生了翻天覆地的變化，使免疫檢測領域得到了快速成長。但由于酶標檢測體系檢測時間長，中間過程操作煩瑣，試劑檢測范圍窄，靈敏度低等缺點，因此該系統也慢慢的退出了臨床檢測的歷史舞臺。隨之而來的相繼又發明了膠體金標技術平臺，化學發光，時間分辨熒光檢測技術平臺以及免疫芯片技術平臺等。

免疫層析快速檢測技術是近年發達國家發展起來的一種快速免疫分析技術。其原理是樣本液在毛細遷移作用下在硝酸纖維素膜上遷移，其中的待測物與膜上一定區域的抗體(抗原)結合，通過有色標記物，十幾分鐘甚至幾分鐘內即可得到肉眼可見的直觀結果。免疫層析快速檢測技術不需將游離的抗體(抗原)和形成復合物的抗體(抗原)進行分離，省去了繁瑣洗滌步驟，因而操作便捷，出報告時間短，在基層醫療機構、急診、現場、家庭自檢等場所得到了廣泛的應用。常用的標記物為膠體金顆粒、酶、熒光蛋白以及微球等。

其中，熒光標記技術具有靈敏度高、操作簡單等特點，已被廣泛用于生物檢測領域。如dna測序、蛋白表達分析、細胞成像、活體成像、臨床診斷等。熒光微球技術是將聚苯乙烯羧基微球、熒光染料標記系統、激光技術、應用流體學及微球專用流式細胞儀等有機整合在一起的一項新技術，通過熒光微球信號來進行實驗數據采集和分析，具有快速分析多重生物反應的特點及高靈敏度和特異性，可用于抗原抗體、核酸探針檢測等領域的研究。

熒光檢測生物體液中疾病標志蛋白的有干式免疫方法采用熒光微球偶聯抗體，結合疾病標志蛋白，然后用激發光激發熒光物質，光電轉換器轉換光信號為電信號，通過計算機計算電信號強弱來測定疾病標志蛋白含量。例如，實用新型cn205679621u涉及一種心衰疾病檢測系統，具體涉及一種用于心腦血管疾病檢測的免疫熒光檢測儀，包括橫向免疫熒光層析試劑卡和微型數字化檢測儀，微型數字化檢測儀包括冷光源熒光檢測組件、光電強度數字轉換計算組件和顯示器，橫向免疫熒光層析試劑卡活動插接在冷光源熒光檢測組件內，冷光源熒光檢測組件獲取橫向免疫熒光層析試劑卡的熒光信號并將其傳輸至光電強度數字轉換計算組件，所述光電強度數字轉換計算組件將熒光信號轉化為電信號并輸送至顯示器。所述的檢測儀，使檢測者在家就能進行心腦血管疾病檢查，并直接獲取數據結果，可實現快速定量的獲取橫向免疫熒光層析試劑卡的檢測數據。

然而，通常的熒光微球多為表面偶聯抗體，即將抗體分子通過特定的官能團偶聯到微球表面制得，由于熒光微球大小不一致，表面修飾的反應基團量非恒定，熒光均一性較差等不足，采用熒光微球檢測抗體時通常存在以下缺陷，例如：1)不能定量偶聯抗體，熒光值與抗體結合比不固定；2)固定過程中ph，鹽濃度變化等對抗體活性造成影響，一般批量生產后需要對檢測試劑，工藝復雜；3)熒光微球偶聯抗體會導致空間位阻，影響與抗原結合，定量不準確；4)熒光微球為10-100um直徑，在橫向免疫中擴散速度較慢一般需要15分鐘左右時間。因此，如今迫切需要一種新的檢測方法，即可以快速檢測、又可以精確定量，并且還便于攜帶，隨時隨地都可以使用。

抗體結合蛋白a(proteina)來源于金黃色葡萄球菌的一個株系，它含有5個可以和抗體igg分子的fc段特異性結合的結構域。蛋白a作為親和配基被偶聯到瓊脂糖基質上，可以特異性的和樣品中的抗體分子結合，而使其他雜蛋白流穿，具有極高的選擇性，一步親和層析就可達到超過95％的純度。1個蛋白a分子至少可以結合2個igg。蛋白a也可以結合另一些免疫球蛋白，如用于某些種屬的iga、igm的純化。

抗體結合蛋白g是一種源自鏈球菌g族的細胞表面蛋白，為三型fc受體。其通過類似于蛋白a的非免疫機制與抗體的fc段結合。像蛋白a樣，蛋白g可以與igg的fc區域特異性結合，不同的是，proteing瓊脂糖凝膠可以廣泛、更強地結合更多類型的igg，多克隆igg及人igg，同時血清蛋白結合水平更低，純度更高，配基脫落也相對更低。此外，蛋白g還可以和某些抗體的fab和f(ab’)2段結合。

因此可以看出，抗體結合蛋白如(proteina/g)是不同來源抗體純化首選介質，約70-80％的抗體純化使用proteina、proteing親和層析。因此，在本領域的廣泛認知中，蛋白g和蛋白a在抗體領域一般都是用于抗體純化，本領域中還未見利用在熒光檢測中使用抗體結合蛋白如(proteina/g)進行定量標記抗體的報道。

當前，心血管疾病如急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，ami)在世界范圍內已成為成年人最大的潛在殺手，近年來統計，我國心血管病的死亡率在人口死亡中占40％，已高于歐美國家，屬心血管病高發國。因此，只有做到早預防、早發現及早救治，才能最大限度的防止致殘、致死后果，最大限度的改善心血管患者的預后和生活質量。20世紀90年代以來，臨床化學家們逐漸將診斷ami的研究重點轉移到心肌蛋白標志物上。其中心肌肌鈣蛋白(cardiactroponin，ctn)是唯一存在于心肌中的收縮蛋白，對心肌壞死具有高度的敏感性和特異性。

心肌肌鈣蛋白是由ctni、ctnc以及ctnt組成的復合物，在肌肉收縮和舒張過程中起重要調節作用。其中，ctnc沒有心肌特異性，較少用于心肌損傷的檢查。在正常狀態下，ctni和ctnt均不能透過細胞膜進入血液循環，故健康人血內不含或含極低量的ctni、ctnt；當心肌細胞受損后，ctni及ctnt彌散進人細胞間質，較早的出現在外周血中。通常，心肌肌鈣蛋白在發病后3h～5h即可升高，15h～24h達高峰，持續時間久，5d～10d后降至正常。但ctnt在心臟中具有四個亞型，特異性低于ctni，且在腎衰竭、橫紋肌溶解病、肺炎和敗血癥等疾病中，血液中ctnt通常也可增高，故在檢測中會出現假陽性現象。與此相反，ctni在心肌中無其它亞型，特異性高于ctnt，此外其分子量亦小于ctnt，在ami發病時，更早被釋放于血液中，因此，ctni可謂目前診斷ami最好的心肌損傷標志物之一。

現有技術中多用放射免疫法、酶聯免疫吸附法、化學發光法及膠體金免疫層析法等測定ctni。但放射免疫法和酶聯免疫吸附法操作復雜，檢測耗時長；化學發光法對技術要求高，不易在臨床實驗室中進行常規開展。膠體金免疫層析法雖然具有標本用量少，簡便快速，便宜的優勢，然而當遇到某些樣品中抗原或抗體含量極低時，膠體金的顏色將很淺，很難用肉眼來判斷結果，容易出現誤判，靈敏度較低。而普通的熒光免疫層析方法又存在無法定量偶聯抗體、對抗體活性有影響等缺陷。因此基于上述，本發明的發明人還將本發明所述熒光融合蛋白應用到ctni診斷中，從而實現ctni精確定量檢測。

技術實現要素：

在閱讀了優選實施方案和所附權利要求的詳細描述后，本發明的這些和其他目的、優點和用途將對本領域技術人員顯示出來。本發明旨在提供一種精確熒光定量檢測方法，特別涉及一種利用熒光融合蛋白的精確定量檢測方法，還涉及一種熒光融合蛋白，以及一種精確熒光定量檢測試劑條、試劑盒及其制備方法。

申請人出人意料的發現，利用抗體結合蛋白如(proteina/g)在抗體fc段結合2個抗體分子，能定量、定向固定抗體；同時抗體結合蛋白如(proteina/g)上預先通過基因工程技術融合紅色熒光蛋白。該方法能定量標記抗體，且在一般緩沖液中反應；紅色熒光在血液自發光中背景低；由于蛋白分子小，在橫向免疫擴散中穿透速度快，反應時間一般5-8分鐘就可以結束，減少長反應時間中抗原在結合墊中沉積效應。

因此，本發明提供了一種精確熒光定量檢測方法，所述方法包括以下步驟：

a)取血液，混入磷酸鹽緩沖液后加到試紙條的加樣墊上，所述試紙條包含有ctni單克隆抗體熒光蛋白復合物，所述熒光融合蛋白為熒光蛋白-proteing融合蛋白或熒光蛋白-proteina融合蛋白，所述的復合物為熒光融合蛋白和抗體按1:2摩爾比制備而成；

b)將試紙條放入免疫熒光定量分析儀中，定量得出被測物質的濃度；

c)依據參考值判定陰陽性。

在本發明的一個實施方式中，所述的精確熒光定量檢測方法包括以下步驟：

a)用采血管10ul血液，混入90ul磷酸鹽緩沖液后加到試紙條的加樣墊上，所述試紙條包含有ctni單克隆抗體熒光蛋白復合物，所述熒光融合蛋白為熒光蛋白-proteing融合蛋白或熒光蛋白-proteina融合蛋白，所述的復合物為熒光融合蛋白和抗體按1:2摩爾比制備而成；

b)將試紙條放入免疫熒光定量分析儀中，免疫熒光定量分析儀對光學信號進行測量和分析處理，5-8分鐘后讀取數據，定量得出被測物質的濃度；

c)據已知熒光蛋白數量的光學信號值計算血液中抗體結合的抗原量。

優選的，所述熒光融合蛋白為熒光蛋白-proteing融合蛋白或熒光蛋白-proteina融合蛋白。進一步地，所述熒光融合蛋白為氨基酸序列如seqidno：1所示的蛋白。優選的，所述熒光蛋白為紅色熒光蛋白或過渡金屬(如eu²⁺標記)的時間分辨熒光蛋白。

本發明還涉及一種熒光融合蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seqidno：1所示。進一步地涉及編碼所述熒光融合蛋白的dna、載體以及重組菌。

進一步地，本發明還涉及一種精確熒光定量檢測試劑條，以及包含所述試劑條的或試劑盒。所述試劑條包含硝酸纖維素膜(nc膜)-pvc底板、吸水墊、樣品墊、熒光結合墊，所述結合墊中包含抗體-熒光融合蛋白復合物。所述熒光融合蛋白為熒光蛋白-proteing融合蛋白或熒光蛋白-proteina融合蛋白。進一步地，所述熒光融合蛋白的氨基酸序列如seqidno：1所示。優選的，所述熒光蛋白為紅色熒光蛋白或過渡金屬(如eu²+標記)的時間分辨熒光蛋白。

優選地，所述熒光融合蛋白和抗體按固定摩爾比，優選為按照1：2摩爾比混合后，通過分子篩純化形成抗體-熒光蛋白復合物。

優選地，所述硝酸纖維素膜為切成y型細條。

進一步地，所述熒光標記物還可以是熒光微球，熒光分子，過渡元素等。

此外，本申請還涉及一種含熒光融合蛋白的試紙條的制備方法，具體方法如下：

1)硝酸纖維素膜(nc膜)-pvc底板的制備：將硝酸纖維素膜切成y型細條，貼在pvc底板上，將鼠抗人單抗在硝酸纖維素膜上劃線得到檢測線；將兔抗鼠在硝酸纖維素膜上劃線得到質控線，然后將硝酸纖維素膜-pvc底板置于干燥箱干燥；

2)將熒光融合蛋白和抗體1：2摩爾比混合后，通過分子篩純化得到抗體-熒光蛋白復合物，保存備用；

3)結合墊的制備：將結合墊切成細條，將鼠抗人ctni單克隆抗體熒光蛋白復合物按照2：1混合，均勻鋪在結合墊上，放入烘箱烤干；

4)樣品墊的制備：將玻璃纖維膜切成細條；

5)吸收墊的制備：將吸水紙切成細條；

6)組裝：將上述吸水墊、樣品墊、熒光結合墊依次貼在pvc底板上，切成合適形狀的試劑條。

在本發明一個優選的實施方式中，所述的含熒光融合蛋白的試紙條的制備方法，具體方法如下：

1)硝酸纖維素膜(nc膜)-pvc底板的制備：將硝酸纖維素膜切成y型細條(40-60)mm×(2-4)mm，貼在pvc底板上。將鼠抗人單抗在硝酸纖維素膜上劃線得到檢測線；將兔抗鼠在硝酸纖維素膜上劃線得到質控線。然后將硝酸纖維素膜(nc膜)-pvc底板置于干燥箱干燥；

2)將熒光融合蛋白和抗體1：2摩爾比混合后，通過分子篩純化得到抗體-熒光蛋白復合物。保存備用；

3)結合墊的制備：將結合墊切成(40-60)mm×(6-12)mm細條，將鼠抗人ctni單克隆抗體-熒光蛋白復合物按照2：1混合，均勻鋪在結合墊上，放入烘箱烤干；

4)樣品墊的制備：將玻璃纖維膜切成(6-12)mm×(6-12)mm細條；

5)吸收墊的制備：將吸水紙切成(3-6)mm×(6-12)mm細條；

6)組裝：將上述吸水墊、樣品墊、熒光結合墊依次貼在pvc底板上，將貼好的中間物，用激光切割機切成合適形狀的試劑條。

基于上述，本發明利用熒光蛋白融合抗體結合蛋白，能定量標記抗體，且不影響抗體結合的空間位阻，增加了檢測靈敏度，減少反應時間，減少成本。此外，本發明的試劑條采用y型結構，加快流速，減少反應時間，采集熒光利用cmos疊加和mppc單光子技術，增加靈敏度。

附圖說明

圖1表示本發明熒光定量檢測試劑條俯視圖，其中1為樣品墊，2為吸收墊，3為結合墊。

圖2表示本發明熒光定量檢測試劑條側視圖，其中1為樣品墊，2為吸收墊，3為結合墊。

圖3表示本發明的熒光檢測方法與普通熒光檢測方法曲線比較。

圖4表示本發明的熒光檢測方法與普通熒光檢測方法曲線極限值比較。

具體實施方式

需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將結合實施例來詳細說明本發明。

實施例1熒光融合蛋白的制備

1)通過載體序列擴增紅色熒光蛋白基因，同時擴增抗體結合蛋白基因，擴增序列通過平末端連接，然后用pcr擴增融合蛋白基因，引物序列、反應體系以及擴增體系分別見表1和表2。

表1引物序列

表2反應體系以及擴增程序

2)通過基因工程手段，把seqidno：1裝入表達載體，表達熒光蛋白-proteing融合蛋白。把基因序列裝入pet-28a表達載體后，轉化入bl21(de3)菌，用iptg誘導表達，具體步驟如下：

插入pgem-teasy載體，連接體系：pcr產物與pgem-teasy連接：pcr產物15μl，pgem-teasy0.5μl，t4連接酶2μl，連接緩沖液2μl，4℃連接24-48小時。

連接產物取出10μl，加入100μl感受態細胞，靜置30-60分鐘，放入42℃水浴中45-90秒后立刻置冰上2分鐘，然后加入800μllb培養基，37℃搖動1-2小時。取出100μl涂于含有80μg/mlx-gal和100μg/ml氨芐青霉素的lb瓊脂糖培養平板。

挑取白斑后在1ml含有100μg/ml氨芐青霉素的lb培養基中37℃搖動4-12小時，通過測序驗證插入片段序列。選取完全一致序列的克隆，然后在5ml含有100μg/ml氨芐青霉素的lb培養基中37℃搖動24小時。

通過康為抽提質粒試劑盒抽提質粒，獲得5μg質粒后進行酶切。用內切酶bamhi2μl、xhoi2μl、smartcutbuffer5μl、質粒和水40μl、37℃水浴4-12小時。通過瓊脂糖電泳后切取目的條帶，通過膠回收試劑盒提取目的dna片段。

連接pet28a質粒：預切pet28a質粒1μl，融合蛋白dna15μl，t4連接酶2μl連接緩沖液2μl，4℃連接24-48小時。

連接產物取出10μl，加入100μl感受態細胞，靜置30-60分鐘，放入42℃水浴中45-90秒后立刻置冰上2分鐘，然后加入800μllb培養基，37℃搖動1-4小時。取出100μl涂于含有卡那霉素的lb瓊脂糖培養平板。

挑取白斑后在1ml含有50μg/ml卡那霉素的lb培養基中37℃搖動4-12小時，通過測序驗證插入片段序列。選取完全一致序列的克隆，然后在5ml含有50μg/ml卡那霉素的lb培養基中37℃搖動24-48小時。

通過康為抽提質粒試劑盒抽提質粒，獲得5ng-1μg質粒后加入100μlde3感受態細胞，靜置30分鐘，放入42℃水浴中45-90秒后立刻置冰上2分鐘，然后加入800μllb培養基，37℃搖動1-4小時。取出100μl涂于含有50μg/ml卡那霉素的lb瓊脂糖培養平板。

挑取白斑后在1ml含有50μg/ml卡那霉素的lb培養基中37℃搖動4-12小時。然后加入500ml含有50μg/ml卡那霉素的lb培養基，待菌液濃度達到od600＝0.8時，加入iptg試劑誘導。37℃搖動8-12小時。離心收獲菌體。

涉及的裂解緩沖液、清洗液、洗脫液見表3

表3裂解緩沖液、清洗液、洗脫液

3)用gehealthcareni²⁺sepharose4b純化，隨后用sephacryls-200純化43kd融合蛋白，蛋白為深紅色，其純度可達95％以上。具體步驟如下：

5g濕菌體中加入50ml的裂解緩沖液，冰浴并用超聲破碎，4℃12,000g離心30分鐘，收集上清，然后使用gehealthcare的蛋白純化填料ni-sepharose瓊脂純化融合蛋白，4℃過柱平衡過夜，用清洗液洗ni-sepharose瓊脂，清洗20ml后加入洗脫液洗脫蛋白。

所獲純化蛋白用半透膜透析，然后用peg8000稀釋濃縮樣品(10倍濃縮)。融合蛋白和抗體按固定比例混合，4℃混勻過夜。然后樣品用分子篩分離，取最先流出組份。測量濃度后備用。

實施例2熒光定量檢測試劑條或試劑盒的制備

1)硝酸纖維素膜(nc膜)-pvc底板的制備：將硝酸纖維素膜切成y型細條52mm×3mm，貼在pvc底板上。將鼠抗人單抗在硝酸纖維素膜上劃線得到檢測線；將兔抗鼠在硝酸纖維素膜上劃線得到質控線。然后將硝酸纖維素膜(nc膜)-pvc底板置于干燥箱干燥。

2)將熒光融合蛋白和抗體1：2摩爾比混合后，通過分子篩純化得到抗體-熒光蛋白復合物，保存備用。

3)結合墊的制備：將結合墊切成52mm×10mm細條，將鼠抗人ctni單克隆抗體-熒光蛋白復合物、按照2：1比例混合后的純化液，均勻鋪在結合墊上，放入烘箱烤干。

4)樣品墊：將玻璃纖維膜切成10mm×10mm細條。

5)吸收墊：將吸水紙切成5mm×10mm細條。

6)組裝：將上述吸水墊、樣品墊、熒光結合墊依次貼在pvc底板上，將貼好的中間物，用激光切割機切成合適形狀的試劑條，如圖1和圖2所示，1為樣品墊，2為吸收墊，3為結合墊。

實施例3試紙條或試劑盒的檢測標準曲線的建立以及檢測效果評價

3.1標準品建立標準曲線

將購買的ctni熒光蛋白-proteing融合蛋白用50％的小牛血清緩沖液配制0，0.5，2.5，5，10，25，50，100ng/ml八個濃度。在測試區加入100μl樣品后，等待5分鐘，用儀器讀取熒光值。建立標準曲線為：y＝f(x)。y：樣品濃度；x：熒光信號值。每批的每個樣品重復測試5次記錄其相應的熒光信號值。熒光值由機器讀出。待測樣品濃度通過y’＝(mctni/m融合蛋白)*δ*y計算得到。m表示分子量；δ為熒光融合蛋白和抗體的稀釋比例。

3.2試劑條檢測速度評價

稀釋ctni標準品(芬蘭hytest公司)，用不含有ctni的標準血清(芬蘭hytest公司)，制成0.5ng/l的樣品。取十個試劑條加入測試樣品0.5ng/ml后在3分鐘，5分鐘，10分鐘和其他他商業化試劑條15分鐘后通過熒光值判定數值，結果見表4。

表4試紙條檢測速度驗證

結果表明在5分鐘時就可以得到陽性數據，9分鐘達到穩定，比普通商業化試劑的15分鐘要節省40％的時間。

3.3試劑條檢測靈敏度

每批的每個樣品重復測試20次記錄其相應的熒光信號值。

取標準ctni樣品(芬蘭hytest公司)試劑0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0ng/ml點樣，然后讀取熒光值，同時比較普通熒光檢測試劑條，結果見圖3，從圖中可以看出融合蛋白熒光曲線高于普通熒光微球，顯示較高的靈敏度。通過對極限值判讀，見圖4，可以在0.01ng/ml讀出陽性。靈敏度檢測發現在0.01ng/ml的ctni即可檢測到，上述靈敏度對心衰或心肌梗塞診斷有典型的臨床意義(圖3)。

實施例4試紙條或試劑盒的使用方法以及臨床評估

1、用采血管吸取10ul血液，混入90ul磷酸緩沖液后加到試紙條的加樣墊上；

2、將試紙條放入免疫熒光定量分析儀中，8分鐘后讀取數據；

3、采用免疫熒光定量分析儀對光學信號進行測量和分析處理，定量得出被測物質的濃度；

4、依據參考值判定陰陽性。

熒光采集方法：用395nm激光通過光纖在膜表面形成均勻光斑，再成像組件cmos相機用600nm濾鏡過濾，每隔20ms采集一次，每次曝光后圖像疊加優化。共疊加20次。或用光子計數器mppc直接讀取數值。

本發明的融合熒光蛋白方法檢測心梗患者陽性率與一般熒光微球法檢測陽性率進行比較，結果見下表5。可見，本發明的融合熒光蛋白方法陽性檢出率高于一般熒光微球法檢測陽性率，能夠很好地取代一般熒光微球法檢測方法以及試劑條。

表5本發明的融合熒光蛋白方法與熒光微球方法比較

基于上述原理，制備其他疾病標志蛋白的熒光蛋白-proteing/proteina融合蛋白試劑條或試劑盒，檢測結果如準確度、靈敏度均優于所采用的現有市售酶聯免疫或熒光檢測試劑盒，因此，利用本發明提供的熒光融合蛋白檢測試劑盒能夠提供更為準確有效的檢測相關信息。

雖然本發明已作了詳細描述，但對本領域技術人員來說，在本發明精神和范圍內的修改將是顯而易見的。此外，應當理解的是，本發明記載的各方面、不同具體實施方式的各部分、和列舉的各種特征可被組合或全部或部分互換。在上述的各個具體實施方式中，那些參考另一個具體實施方式的實施方式可適當地與其它實施方式組合，這是將由本領域技術人員所能理解的。此外，本領域技術人員將會理解，前面的描述僅是示例的方式，并不旨在限制本發明。

sequencelisting

<110>程秋萍、王云志

<120>一種精確熒光定量檢測方法

<130>2017

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<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>prt

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tyrglyserlysthrpheileasnhisthrglnglyileproaspphe

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phelysglnserpheprogluglyphethrtrpgluargvalthrthr

859095

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115120125

serasnglyprovalmetglnlyslysthrleuglytrpglualaser

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thrgluthrleutyrproalaaspglyglyleugluglyargalaasp

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metalaleulysleuvalglyglyglyhisleuilecysasnleulys

165170175

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180185190

valtyrtyrvalaspargargleugluargilelysglualaasplys

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leuproserlysleuglyhisargglyglyglyglyleulysglyglu

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245250255

glntyralaasnaspasnglyvalaspglyglutrpthrtyraspasp

260265270

alathrlysthrphethrvalthrglulysprogluvalileaspala

275280285

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290295300

lysthrleulysglygluthrthrthrglualavalaspalaalathr

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alaglulysvalphelysglntyralaasnaspasnglyvalaspgly

325330335

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