本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種犬瘟熱、犬細小抗體的elisa檢測試劑盒。
背景技術：
在我國，隨著社會經濟發展方式的轉變，養犬業、毛皮動物養殖業和野生動物保護業，其規模在不斷擴大；隨著人們生活質量的不斷提高，寵物犬的飼養量在也逐年增加，而對這些行業發展造成最大影響的就是犬類傳染病的爆發，對于這些傳染病的預防與控制形式也愈加嚴峻。在犬類疫病中，犬瘟熱和犬細小是發病率及死亡率都較高的疫病。犬瘟熱是由犬瘟熱病毒引起的一種高度接觸性傳染病，傳染性極強，死亡率可達80％以上。犬瘟熱初期狗的體溫高達39.5-41攝氏度，食欲不振，精神沉郁，眼鼻流出水樣分泌物，打噴嚏，有腹瀉癥狀。在以后2-14天內再次出現胃腸道疾病，嘔吐、拉稀，有膿性筆體、膿性眼屎，精神高度沉郁，嗜睡。犬瘟熱發病后期會出現典型的神經癥狀，口吐白沫，抽搐，但以冬、春多發，犬是主要的自然宿主。而犬類感染細小病毒后發病急，死亡率高，常呈爆發性流行；不同年齡、性別、品種的犬均可感染，但八月齡以內的幼犬最易感染且死亡率高達70％。病犬和康復帶毒犬經糞便、尿液、唾液和嘔吐物向外界排毒后污染飼料、飲水、食具及周邊環境。健康犬直接接觸病犬或者進入被污染環境通過消化道感染。
我國的犬類疫病防控缺乏有效的綜合防控體系，既不利于犬類疫病防控，也不利于人類的身體健康。犬類經過接種疫苗后往往存在一種情況，即不知道免疫效果如何，導致了有些犬接種疫苗以后仍然發病，而市面上流行的試劑盒往往只能檢測犬瘟熱或犬細小，這兩種常見病通常需要購買2個試劑盒進行檢測，無形中增大了工作量，工作繁瑣。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術的不足，提供一種方便、高效、通過檢測血清抗體來判斷接種疫苗后的犬類免疫保護狀況的犬瘟熱、犬細小抗體的elisa檢測試劑盒。
為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是一種犬瘟熱、犬細小抗原的elisa檢測試劑盒，包括elisa板條、血清稀釋液和濃縮洗滌液、底物顯色液、終止液、酶標單克隆抗體、陽性對照和陰性對照；
上述elisa板條：每個試劑盒裝有1塊elisa微孔板，每塊elisa板條為能自行拆卸的已包被抗原的elisa微孔板，包被抗原為原核表達的h蛋白及vp2基因，規格為6孔×10條；
上述血清稀釋液為即用型；
上述濃縮洗滌液為20倍濃縮；
上述底物顯色液為即用型tmb顯色液，10ml；
上述終止液為2mol/l的h2so4溶液，10ml；
上述酶標單克隆抗體為：辣根過氧化物酶標記的兔抗犬igg多克隆抗體，使用前100倍稀釋；
上述陽性對照為：經高溫滅活的經疫苗免疫后的犬血清稀釋液；
上述陰性對照為：經高溫滅活的未患病，且未經疫苗免疫的犬血清稀釋液。
本發明還公開了上述的檢測犬瘟熱、犬細小抗原的elisa檢測試劑盒在檢測犬瘟熱、犬細小igg抗原中的應用。
本發明一種犬瘟熱、犬細小抗體的elisa檢測試劑盒具有如下優點：兩種檢測方法整合至一個試劑盒，給使用者提供了方便且降低了使用成本。
附圖說明
圖1是本發明中犬瘟熱、犬細小抗原的elisa檢測試劑盒；
其中：1.犬瘟熱病毒h蛋白；2.犬細小病毒vp2基因。
具體實施方式
本發明一種犬瘟熱、犬細小抗原的elisa檢測試劑盒，包括elisa板條、血清稀釋液和濃縮洗滌液、底物顯色液、終止液、酶標單克隆抗體、陽性對照和陰性對照；
上述elisa板條：每個試劑盒裝有1塊elisa微孔板，每塊elisa板條為能自行拆卸的已包被抗原的elisa微孔板，包被抗原為原核表達的h蛋白及vp2基因，規格為6孔×10條；
上述血清稀釋液為即用型；
上述濃縮洗滌液為20倍濃縮；
上述底物顯色液為即用型tmb顯色液，10ml；
上述終止液為2mol/l的h2so4溶液，10ml；
上述酶標單克隆抗體為：辣根過氧化物酶標記的兔抗犬igg多克隆抗體，使用前100倍稀釋；
上述陽性對照為：經高溫滅活的經疫苗免疫后的犬血清稀釋液；
上述陰性對照為：經高溫滅活的未患病，且未經疫苗免疫的犬血清稀釋液。
本發明還公開了上述的檢測犬瘟熱、犬細小抗原的elisa檢測試劑盒在檢測犬瘟熱、犬細小igg抗原中的應用。
一、抗原制備
1.犬瘟熱病毒h蛋白、犬細小病毒vp2基因的表達：
根據genbank中犬瘟熱病毒h基因序列及犬細小病毒vp2基因序列，設計合成2對引物，采用pcr方法從dna中擴增出h基因片段及vp2基因片段，將其克隆到表達載體pet28b中，構建了重組質粒pet-h及pet-vp2基因，測序驗證后轉化入表達宿主菌bl21(de3)，經iptg誘導表達。
2.犬瘟熱病毒h蛋白、犬細小病毒vp2基因的純化：
誘導結束后，離心收集誘導后菌體，用pbs洗滌重懸菌體，超聲裂解，具體為：超聲1.5s，間隔2s，共10min。然后10000rpm離心，分別收集上清和沉淀，進行sds-page分析。蛋白純化時使用鎳離子親和層析柱，純化后，經sds-page、westernblotting鑒定，獲取到單一條帶，并具備較好的抗原性。使用bca法測定純化后蛋白含量，犬瘟熱病毒h蛋白純化后od值為2.05，與標準品比較后，其濃度為1500μg/ml；犬細小病毒vp2純化后od值為1.85，與標準品比較后，其濃度為1200μg/ml。
二、辣根過氧化物酶標記兔抗犬igg的制備：
1.純化犬igg的制備：
取經檢驗合格的犬作為采血用犬，采血前體況較好，體溫、食欲、大小便正常，無其他疾病。消毒后，頸靜脈采血，分離血清，純化igg方案為辛酸-硫酸銨沉淀法。
取1份預處理過的血清加2份0.06mol/lph為5.0的醋酸緩沖液，用1mol/lhcl調節ph至4.8；按每毫升稀釋血清加11ul辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，于30分鐘內加完，4℃靜置2小時，取出后12000r/min離心30min，棄沉淀；上清液經尼龍篩過濾，尼龍篩孔徑為125um，加入1/10體積的0.01mol/lpbs，用lmol/lnaoh溶液調ph至7.2；在4℃下加入飽和硫酸銨至45％飽和度，輕輕混勻30min，靜置1小時；12000r/min離心30分鐘，棄上清；沉淀溶于適量pbs中，對50-100倍體積的pbs透析，4℃過夜；取出后，12000r/min離心30min，除去不溶性沉淀，分裝，凍存備用。
2.兔抗犬igg多克隆抗體的辣根過氧化物酶標記：
以上述制備的純化犬igg作為免疫原，免疫成年健康家兔，心臟采血后，純化獲得兔抗犬igg多克隆抗體。
純化后的多克隆抗體的酶標記物的制備方案為過碘酸鈉法，具體步驟如下：
稱取5mghrp溶解于1ml蒸餾水中；向其中加入0.2ml新配的0.1mnaio4溶液，室溫避光攪拌20分鐘；對1mmph為4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜；向其中再加入20μl、0.2m、ph為9.5的碳酸鹽緩沖液，使以上醛化物的ph升高到9.0，然后立即加入溶于0.01m碳酸鹽緩沖液的多克隆抗體純品5mg，濃度為10mg/ml，室溫避光輕柔攪拌2小時；加入0.1ml新配的4mg/mlnabh4溶液，混勻，4℃放置2小時；所得產物在0.1m、ph為7.4的pbs中4℃透析過夜。
透析完成后，在攪拌中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃下1小時。3000r/min離心30min，棄上清液。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mph為7.4的pbs中。將溶液裝入透析袋中，對0.1mph為7.4的pbs緩沖液透析，取出銨離子，10000r/min離心30min去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，凍存。
三、試劑盒的建立：
1.本發明試劑盒的檢測原理：
采用間接elisa法，將重組的犬瘟熱蛋白h、犬細小病毒蛋白vp2基因包被于微孔板中，包被方式如附圖1所示，其中：1為犬瘟熱病毒h蛋白；2為犬細小病毒vp2基因。用1％bsa將酶標板封閉，加入待測樣本及標準陽性對照、陰性對照。樣本或標準品中的犬瘟熱、犬細小igg抗體與酶標板中包被的h、vp2基因發生抗原反應，加入酶標兔抗犬igg多克隆抗體后，酶標抗體與上一步反應結束的h、vp2基因抗原-抗體復合物結合。隨后，加入辣根過氧化物酶底物tmb顯色，終止液終止反應，通過酶標儀在450nm波長下，測定各孔吸光度值，od值的大小(終止顯色反應后顏色的深淺)與待測樣本中犬細小igg抗體的含量成正比。
2.本發明試劑盒的組成：
a)酶標板的最佳制備方法：
用ph9.6的0.05m的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，將上述制備的純化后重組h、vp2基因稀釋后，按100ul/孔加入微孔板中，保證每孔中的h、vp2基因含量為0.15ug。4℃包被過夜，次日，棄去包被液，按200ul/孔加入1％bsa的封閉液，37℃靜置2小時，洗滌甩干。室溫干燥后裝入包裝袋，加入干燥劑，真空保存。
b)工作試劑的配置：
ph為7.4，濃度為0.15m的pbs洗滌液中各組分及含量如下：kh2po40.2g，na2hpo4-12h2o2.9g，nacl8.0g，kcl0.2g，tween-20(0.05％)0.5ml，加蒸餾水至1000ml。濃縮成25倍作為存儲液。
血清稀釋液：牛血清白蛋白0.1g，加洗滌液至100ml；
底物緩沖液：0.2mna2hpo425.7ml，0.1m檸檬酸24.3ml，加蒸餾水50ml，ph為5.0；
四甲基聯苯胺tmb顯色液：tmb(10mg/5ml無水乙醇)0.5ml，底物緩沖液10ml，0.75％h2o232ul：
終止液：蒸餾水178.3ml，逐滴加入質量濃度為98％的濃硫酸21.7ml。
c)檢測犬瘟熱、犬細小igg抗體的elisa試劑盒的組建：
組建檢測犬瘟熱、犬細小病毒igg抗體的elisa試劑盒，包含以下組分：
h蛋白、vp2基因包被的60孔酶標板；
辣根過氧化物酶標記的兔抗犬igg多克隆抗體；
陽性對照；
陰性對照；
濃縮洗滌液；
血清稀釋液；
tmb底物；
終止液；
產品說明書。
四、樣品中犬瘟熱、犬細小igg抗體的檢測：
1.用上述制備的試劑盒進行檢測：
1)將待測血清、陽性對照及陰性對照用抗體稀釋液按比例稀釋，每孔100μl加入酶標板，37℃孵育1小時。洗滌液清洗3-5次。
2)每孔加入稀釋后酶標兔抗犬igg多克隆抗體100μl，37℃孵育30min，洗滌液清洗3-5次。
3)每孔加入tmb底物液100μl，室溫避光反應10-15分鐘。
4)每孔加入100μl2mh2so4終止反應，酶標儀檢測450nm吸光度值。
2.檢測結果分析：
1)檢測中陽性對照血清(pc)的od值與陰性對照血清(nc)的od值之差必須大于0.4時，檢測被認為有效。
pc-nc≥0.4；
cutohh＝nc+0.05；
其中nc＝陰性對照血清od值；
pc＝陽性對照血清od值；
2)檢測時使用復孔，最終使用od值為兩個的平均值。
當血清樣本的od值低于cutohh值時，該樣本為犬細小病毒igg抗體陰性。
當血清樣本的od值高于cutohh值時，該樣本為犬細小病毒igg抗體陽性。
實例2：
一、抗原制備：
1.犬瘟熱病毒h蛋白、犬細小病毒vp2基因的表達：
根據genbank中瘟熱病毒h基因序列及犬細小病毒vp2基因序列，設計合成2對引物，采用pcr方法從dna中擴增出h基因片段以及vp2基因片段，將其克隆到表達載體pet28b中，構建了重組質粒pet-h及pet-vp2基因，測序驗證后轉化入表達宿主菌bl21(de3)，經iptg誘導表達。
2.犬瘟熱病毒h蛋白、犬細小病毒vp2基因的純化：
誘導結束后，離心收集誘導后菌體，用pbs洗滌重懸菌體，超聲裂解，具體過程為：超聲1.0s，間隔1s，共10min；然后10000rpm離心，分別收集上清液和沉淀，進行sds-page分析。蛋白純化時使用鎳離子親和層析柱，純化后，經sds-page、westernblotting鑒定，獲取到單一條帶，并具備較好的抗原性。使用bca法測定純化后蛋白含量，犬瘟熱病毒h蛋白純化后od值為2.25，與標準品比較后，其濃度為1600μg/ml；犬細小病毒vp2純化后od值為1.75，與標準品比較后，其濃度為1100μg/ml。
二、辣根過氧化物酶標記兔抗犬igg的制備：
1.純化犬igg的制備：
取經檢驗合格的犬作為采血用犬，采血前體況較好，體溫、食欲、大小便正常，無其他疾病。消毒后，頸靜脈采血，分離血清，純化igg方案為辛酸-硫酸銨沉淀法。
取1份預處理過的血清加2份0.06mol/lph為5.0的醋酸緩沖液，用1mol/lhcl調節ph至4.8；按每毫升稀釋血清加11ul辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，于30分鐘內加完，4℃靜置2小時，取出后12000r/min離心30min，棄沉淀；上清經尼龍篩過濾(125um)，加入1/10體積的0.01mol/lpbs，用lmol/lnaoh調ph至7.2；在4℃下加入飽和硫酸銨至45％飽和度，輕輕混勻30min，靜置1小時；12000r/min離心30分鐘，棄上清液；沉淀溶于適量pbs中，對50-100倍體積的pbs透析，4℃過夜；取出12000r/min離心30min，除去不溶性沉淀，分裝，凍存備用。
2.兔抗犬igg多克隆抗體的辣根過氧化物酶標記：
上述制備的純化犬igg作為免疫原，免疫成年健康家兔，心臟采血后，純化獲得兔抗犬igg多克隆抗體。
純化后的多克隆抗體的酶標記物的制備方案為過碘酸鈉法，具體步驟如下：
稱取5mghrp溶解于1ml蒸餾水中；向其中加入0.2ml新配的0.1mnaio4溶液，室溫避光攪拌20分鐘；對1mmph4.4的醋酸鈉緩沖液中透析，4℃過夜；向其中再加入20μl0.2mph為9.5的碳酸鹽緩沖液，使以上醛化物的ph升高到9.0，然后立即加入溶于0.01m碳酸鹽緩沖液的多克隆抗體純品5mg，濃度為10mg/ml，室溫避光輕柔攪拌2小時；加入0.1ml新配的4mg/mlnabh4，混勻，4℃放置2小時；所得產物對0.1mph為7.4pbs中4℃透析過夜。
透析完成后，在攪拌中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃下1小時。3000r/min離心30min，棄上清液。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mph為7.4的pbs中。將上述溶液裝入透析袋中，對0.1mph7.4的pbs緩沖液透析，取出銨離子，10000r/min離心30min去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，凍存。
三、試劑盒的建立：
1.本發明重試劑盒的檢測原理：
采用間接elisa法，將重組的犬瘟熱蛋白h、犬細小病毒蛋白vp2基因包被于微孔板中，包被方式如附圖1所示，其中：1為犬瘟熱病毒h蛋白；2為犬細小病毒vp2基因。用1％bsa將酶標板封閉，加入待測樣本及標準陽性對照、陰性對照。樣本或標準品中的犬瘟熱、犬細小igg抗體與酶標板中包被的h、vp2基因發生抗原反應，加入酶標兔抗犬igg多克隆抗體后，酶標抗體與上一步反應結束的h蛋白及vp2基因抗原-抗體復合物結合。隨后，加入辣根過氧化物酶底物tmb顯色，終止液終止反應，通過酶標儀在450nm波長下，測定各孔吸光度值，od值的大小(終止顯色反應后顏色的深淺)與待測樣本中犬細小igg抗體的含量成正比。
2.本發明試劑盒的組成：
a)酶標板的最佳制備方法
用ph為9.6的0.05m的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，將上述制備的純化后重組h蛋白、vp2基因稀釋后，按100ul/孔加入微孔板中，保證每孔中的h蛋白、vp2基因含量為0.15ug。4℃包被過夜，次日，棄去包被液，按200ul/孔加入1％bsa的封閉液，37℃靜置2小時，洗滌甩干。室溫干燥后裝入包裝袋，加入干燥劑，真空保存。
b)工作試劑的配置：
濃度0.15m，ph為7.4的pbs洗滌液：kh2po40.2g，na2hpo4-12h2o2.9g，nacl8.0g，kcl0.2g，tween-20(0.05％)0.5ml，加蒸餾水至1000ml。濃縮成25倍作為存儲液。
血清稀釋液：牛血清白蛋白0.1g，加洗滌緩沖液至100ml；
底物緩沖液：0.2mna2hpo425.7ml，0.1m檸檬酸24.3ml，加蒸餾水50ml；
四甲基聯苯胺tmb底物顯色液：tmb(10mg/5ml無水乙醇)0.5ml，底物緩沖液10ml，0.75％h2o232ul；
2mh2so4終止液：蒸餾水178.3ml，逐滴加入質量濃度為98％的濃硫酸21.7ml；
c)檢測犬瘟熱、犬細小igg抗體的間接elisa試劑盒的組建：
組建檢測犬瘟熱、犬細小病毒igg抗體的elisa試劑盒，包含以下組分：
h蛋白、vp2基因包被的60孔酶標板；
辣根過氧化物酶標記的兔抗犬igg多克隆抗體；
陽性對照；
陰性對照；
濃縮洗滌液；
血清稀釋液；
tmb顯色液；
終止液；
產品說明書。
四、樣品中犬瘟熱、犬細小igg抗體的檢測：
1.用上述制備的試劑盒進行檢測：
1)將待測血清、陽性對照及陰性對照用抗體稀釋液按比例稀釋，每孔100μl加入酶標板，37℃孵育1小時。洗滌液清洗3-5次。
2)每孔加入稀釋后酶標兔抗犬igg多克隆抗體100μl，37℃孵育30min，洗滌液清洗3-5次。
3)每孔加入tmb底物液100μl，室溫避光反應10-15分鐘。
4)每孔加入100μl2mh2so4終止反應，酶標儀檢測450nm吸光度值。
2.檢測結果分析
1)檢測中陽性對照血清(pc)的od值與陰性對照血清(nc)的od值之差必須大于0.4時，檢測被認為有效。
pc-nc≥0.4；
cutohh＝nc+0.05；
其中nc＝陰性對照血清od值；
pc＝陽性對照血清od值；
2)檢測時使用復孔，最終使用od值為兩個的平均值。
當血清樣本的od值低于cutohh值時，該樣本為犬細小病毒igg抗體陰性。
當血清樣本的od值高于cutohh值時，該樣本為犬細小病毒igg抗體陽性。
實例3：
一、抗原制備：
1.犬瘟熱病毒h蛋白、犬細小病毒vp2基因的表達：
根據genbank中瘟熱病毒h基因序列及犬細小病毒vp2基因序列，設計合成2對引物，采用pcr方法從dna中擴增出h基因片段以及vp2基因片段，將其克隆到表達載體pet28b中，構建了重組質粒pet-h及pet-vp2基因，測序驗證后轉化入表達宿主菌bl21(de3)，經iptg誘導表達。
2.犬瘟熱病毒h蛋白、犬細小病毒vp2基因的純化：
誘導結束后，離心收集誘導后菌體，用pbs洗滌重懸菌體，超聲裂解，具體過程如下：超聲1.0s，間隔2s，共15min；然后12000rpm離心，分別收集上清液和沉淀，進行sds-page分析。蛋白純化時使用鎳離子親和層析柱，純化后，經sds-page、westernblotting鑒定，獲取到單一條帶，并具備較好的抗原性。使用bca法測定純化后蛋白含量，犬瘟熱病毒h蛋白純化后od值為2.15，與標準品比較后，其濃度為1500μg/ml；犬細小病毒vp2純化后od值為1.55，與標準品比較后，其濃度為900μg/ml。
二、辣根過氧化物酶標記兔抗犬igg的制備：
1.純化犬igg的制備：
取經檢驗合格的犬作為采血用犬，采血前體況較好，體溫、食欲、大小便正常，無其他疾病。消毒后，頸靜脈采血，分離血清，純化igg方案為辛酸-硫酸銨沉淀法。
取1份預處理過的血清加2份0.06mol/lph為5.0醋酸緩沖液，用1mol/lhcl調節ph至4.8；按每毫升稀釋血清加11ul辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，于30分鐘內加完，4℃靜置2小時，取出后12000r/min離心30min，棄沉淀；上清液經尼龍篩過濾，篩網孔徑為125um，加入1/10體積的0.01mol/lpbs，用lmol/lnaoh調節ph至7.2；在4℃下加入飽和硫酸銨至45％飽和度，輕輕混勻30min，靜置1小時；12000r/min離心30分鐘，棄上清；沉淀溶于適量pbs中，對50-100倍體積的pbs透析，4℃過夜；取出12000r/min離心30min，除去不溶性沉淀，分裝，凍存備用。
2.兔抗犬igg多克隆抗體的辣根過氧化物酶標記：
上述制備的純化犬igg作為免疫原，免疫成年健康家兔，心臟采血后，純化獲得兔抗犬igg多克隆抗體。
純化后的多克隆抗體的酶標記物的制備方案為過碘酸鈉法，具體步驟如下：
稱取5mghrp溶解于1ml蒸餾水中；向其中加入0.2ml新配的0.1mnaio4溶液，室溫避光攪拌20分鐘；對1mmph為4.4的醋酸鈉緩沖液中透析，4℃過夜；向其中再加入20μl0.2mph為9.5的碳酸鹽緩沖液，使以上醛化物的ph升高到9.0，然后立即加入溶于0.01m碳酸鹽緩沖液的多克隆抗體純品5mg，濃度為10mg/ml，室溫避光輕柔攪拌2小時；加入0.1ml新配的4mg/mlnabh4，混勻，4℃放置2小時；所得產物對0.1mph為7.4pbs中4℃透析過夜。
透析完成后，在攪拌中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃下1小時。3000r/min離心30min，棄上清液。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mph為7.4的pbs中。將上述溶液裝入透析袋中，對0.1mph7.4的pbs緩沖液透析，取出銨離子，10000r/min離心30min去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，凍存。
三、試劑盒的建立：
1.本發明試劑盒的檢測原理：
采用間接elisa法，將重組的犬瘟熱蛋白h、犬細小病毒蛋白vp2基因包被于微孔板中，包被方式如附圖1所示，其中：1為犬瘟熱病毒h蛋白；2為犬細小病毒vp2基因。用1％bsa將酶標板封閉，加入待測樣本及標準陽性對照、陰性對照。樣本或標準品中的犬瘟熱、犬細小igg抗體與酶標板中包被的h蛋白、vp2基因發生抗原反應，加入酶標兔抗犬igg多克隆抗體后，酶標抗體與上一步反應結束的h蛋白、vp2基因抗原-抗體復合物結合。隨后，加入辣根過氧化物酶底物tmb顯色，終止液終止反應，通過酶標儀在450nm波長下，測定各孔吸光度值，od值的大小(終止顯色反應后顏色的深淺)與待測樣本中犬細小igg抗體的含量成正比。
2.本發明試劑盒的組成：
a)酶標板的最佳制備方法：
用ph為9.6的0.05m的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，將上述制備的純化后重組h蛋白、vp2基因稀釋后，按100ul/孔加入微孔板中，保證每孔中的h、vp2基因含量為0.15ug。4℃包被過夜，次日，棄去包被液，按200ul/孔加入1％bsa的封閉液，37℃靜置2小時，洗滌甩干。室溫干燥后裝入包裝袋，加入干燥劑，真空保存。
b)工作試劑的配置：
濃度為0.15m，ph為的7.4pbs洗滌液：kh2po40.2g，na2hpo4-12h2o2.9g，nacl8.0g，kcl0.2g，tween-20(0.05％)0.5ml，加蒸餾水至1000ml。濃縮成25倍作為存儲液。
血清稀釋液：牛血清白蛋白0.1g，加洗滌緩沖液至100ml；
底物緩沖液(ph5.0磷酸檸檬酸)：0.2mna2hpo425.7ml，0.1m檸檬酸24.3ml，加蒸餾水50ml；
四甲基聯苯胺tmb底物顯色液：tmb(10mg/5ml無水乙醇)0.5ml，底物緩沖液10ml，0.75％h2o232ul；
2mh2so4終止液：蒸餾水178.3ml，逐滴加入質量濃度為98％的濃硫酸21.7ml；
c)檢測犬瘟熱、犬細小igg抗體的間接elisa試劑盒的組建：
組建檢測犬瘟熱、犬細小病毒igg抗體的elisa試劑盒，包含以下組分：
h蛋白、vp2基因包被的60孔酶標板；
辣根過氧化物酶標記的兔抗犬igg多克隆抗體；
陽性對照；
陰性對照；
濃縮洗滌液；
血清稀釋液；
tmb底物；
終止液；
產品說明書。
四、樣品中犬瘟熱、犬細小igg抗體的檢測：
1.用上述制備的試劑盒進行檢測：
1)將待測血清、陽性對照及陰性對照用抗體稀釋液按比例稀釋，每孔100μl加入酶標板，37℃孵育1小時。洗滌液清洗3-5次。
2)每孔加入稀釋后酶標兔抗犬igg多克隆抗體100μl，37℃孵育30min，洗滌液清洗3-5次。
3)每孔加入tmb底物液100μl，室溫避光反應10-15分鐘。
4)每孔加入100μl2mh2so4終止反應，酶標儀檢測450nm吸光度值。
2.檢測結果分析：
1)檢測中陽性對照血清(pc)的od值與陰性對照血清(nc)的od值之差必須大于0.4時，檢測被認為有效。
pc-nc≥0.4；
cutohh＝nc+0.05；
其中nc＝陰性對照血清od值；
pc＝陽性對照血清od值；
2)檢測時使用復孔，最終使用od值為兩個的平均值。
當血清樣本的od值低于cutohh值時，該樣本為犬細小病毒igg抗體陰性。
當血清樣本的od值高于cutohh值時，該樣本為犬細小病毒igg抗體陽性。