巰基類化合物的檢測方法及熒光成像方法與流程

本發明涉及生物檢測技術領域，且特別涉及一種巰基類化合物的檢測方法及熒光成像方法。

背景技術：

巰基類化合物在(如半胱氨酸，谷胱甘肽和高半胱氨酸等)生物體內的許多生理過程中發揮著重要作用，例如維持生物體內氧化還原的動態平衡、影響體內生物酶活性等，而且多種疾病的發病機制也與生物體內的巰基化合物水平密切相關。巰基類物質的變化，在人體生命現象中主要表現為：半胱氨酸的缺乏會導致生長緩慢、頭發變白、腦水腫、肝損傷、嗜眠癥、皮膚病變、身體虛弱等；細胞內高半胱氨酸的高表達與心血管疾病及阿爾茨海默有直接關聯；作為三肽化合物的谷胱甘肽，是哺乳動物組織中含量最豐富的細胞內小分子生物巰基化合物之一，在維持生物體還原性內環境方面發揮著重要作用；作為一種抗氧化劑，還原型的谷胱甘肽可以有效阻止自由基或過氧化物對細胞內重要組成部分的損傷，并且與氧化型的谷胱甘肽的比例也是監測細胞內氧化水平的重要參數指標。因此，巰基化合物的檢測對于人體健康和疾病診斷具有重要的意義。

目前，巰基類化合物檢測的方法主要有：酶促法、高效液相色譜法(hplc)和氣相色譜法(gc)、結合電化學檢測的毛細管電泳法、熒光分析與比色法等。上述方法各具優勢，但是作為快速檢測方法，會明顯暴露出缺點，例如，酶促實驗過程復雜，不適宜用于日常分析。hplc的特異性好，但是儀器依賴度高，價格昂貴，耗時較長，可用于能檢測生物巰基的總量，但靈敏度不高，對樣品的需求量較大。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種巰基類化合物的檢測方法，以制備的熒光檢測物質作為探針，可快速、高效的檢測巰基類化合物，專一性強、靈敏度高、抗干擾能力強，對巰基類化合物具有很好的熒光響應。

本發明的另一目的在于提供一種熒光成像方法，將上述熒光探針分子結合到待成像物，檢測熒光。該方法檢測熒光效果明顯，操作簡便，在細胞成像應用中具有良好的效果。

本發明解決其技術問題是采用以下技術方案來實現的。

本發明提出一種巰基類化合物的檢測方法，包括：向含有熒光探針分子的熒光探針溶液中加入待檢測物形成檢測液，檢測檢測液是否存在熒光或熒光母體的特征峰，熒光探針分子由2,4-二硝基苯磺酰氯和如式(i)所示的熒光母體反應而成；

其中，r1表示烷氧基、羧基、硝基、氫基、烷基中任一種，r2表示烷氧基、羧基、硝基、氫基、羥烷基、氨基中任一種，r1、r2的結合位點分別獨立地為苯環上剩余的4個未結合位點中的任一個；

如果存在熒光、特征峰中的一種或兩種，則待檢測物中存在巰基類化合物；如果不存在熒光和特征峰，則待檢測物中不存在巰基類化合物。

本發明還提供了一種熒光成像方法，將上述熒光探針分子結合到待成像物，使巰基類化合物與熒光探針分子反應以使待成像物產生熒光，利用成像儀檢測待成像物產生的熒光；熒光探針分子由2,4-二硝基苯磺酰氯和如式(i)所示的熒光母體反應而成；

其中，r1表示烷氧基、羧基、硝基、氫基、烷基中任一種，r2表示烷氧基、羧基、硝基、氫基、羥烷基、氨基中任一種，r1、r2的結合位點分別獨立地為苯環上剩余的4個未結合位點中的任一個。

本發明實施例的一種巰基類化合物的檢測方法及熒光成像方法的有益效果是：

本發明以制備的熒光探針分子配制熒光探針溶液，向熒光探針溶液中加入待檢測物質進行熒光檢測。熒光探針分子中的苯磺酸酯鍵與半胱氨酸分子結構中的巰基發生專一性化學反應后，由于影響激發態分子內質子轉移(excited-stateintramolecularprotontransfer，esipt)過程的羥基官能團的2,4-二硝基苯磺酸基從母體分子脫離，熒光母體的熒光性質恢復，出現特征發射峰。該檢測方法可快速、高效的檢測巰基類化合物，專一性強、靈敏度高、抗干擾能力強，對巰基類化合物具有很好的熒光響應。一種熒光成像方法，將上述熒光探針分子結合到待成像物，檢測熒光。該方法檢測熒光效果明顯，操作簡便，在細胞成像應用中具有良好的效果。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發明的某些實施例，因此不應被看作是對范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。

圖1為本發明實施例4的熒光探針在兩組細胞內的透射電鏡圖；

圖2為本發明實施例8的熒光探針溶液與不同濃度的半胱氨酸的熒光光譜圖；

圖3為本發明實施例8的熒光探針溶液與相同濃度的半胱氨酸及不同物質混合物的熒光光譜圖。

具體實施方式

為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。

下面對本發明實施例的巰基類化合物的檢測方法及熒光成像方法進行具體說明。

本發明實施例提供的一種巰基類化合物的檢測方法，包括：

步驟s101：由如式(i)所示的熒光母體與2,4-二硝基苯磺酰氯反應制備熒光探針分子。

其中，r1表示烷氧基、羧基、硝基、氫基、烷基中任一種，r2表示烷氧基、羧基、硝基、氫基、羥烷基、氨基中任一種，r1、r2的結合位點分別獨立地為苯環上剩余的4個未結合位點中的任一個。在本發明的實施例中，具體地，熒光母體為2-(2-羥基苯基)苯并咪唑，其可以通過購買直接獲得，也可通過實驗制備獲得。具體地，熒光母體2-(2-羥基苯基)苯并咪唑的制備方法包括：

將水楊醛溶于一定量的乙醇溶劑中，加入亞硫酸氫鈉后，為了溶解的充分，磁力攪拌1.5～2.5h；

再加入溶有鄰苯二胺的乙醇溶劑，升溫加熱至回流后，繼續反應3～5h；

反應結束后，將反應產物置于冰水浴中，靜置3～5h待無固體繼續析出后，過濾得固體，該固體為粗產品；

為了得到純物質，將過濾后的固體真空干燥，以體積比為1:4～6的乙酸乙酯和石油醚作為淋洗劑，進行柱層析提純，產物即為2-(2-羥基苯基)苯并咪唑。

其中，水楊醛、乙醇、亞硫酸氫鈉、鄰苯二胺的用量比為1mmol:15～35ml:1～1.5mmol:1～1.5mmol。

在本發明實施例中，作為熒光母體的2-(2-羥基苯基)苯并咪唑與2,4-二硝基苯磺酰氯的反應包括：

在冰水浴中，將熒光母體充分溶于二氯甲烷溶劑中，加入縛酸劑三乙胺；在本發明的實施例中，溶劑也可以選用其他有機試劑，如乙醇等；

為了讓反應更加充分，在磁力攪拌的條件下，逐滴滴加溶有2,4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷；

在冰水浴中反應18～24h，反應結束后，通過減壓蒸餾得粗產品，再通過柱層析提純產物。提純過程中，以乙酸乙酯和石油醚的混合液作為淋洗劑，乙酸乙酯與石油醚的體積比為1:2～4。較優的，在本發明實施例中，冰水浴的溫度為-10～0℃。

其中，熒光母體、溶劑、三乙胺、2,4-二硝基苯磺酰氯的用量比為1mmol:30～50ml:1～2mmol:1～2mmol。該范圍值是發明人經過創造性勞動并結合自身經驗得到的優選值。

步驟s102：制得熒光探針分子后，配制熒光探針溶液。

在本發明實施例中，熒光探針溶液由熒光探針分子及熒光探針溶劑混合而成。具體地，熒光探針溶劑由體積比為1:1～2的乙腈和含有4-羥乙基哌嗪乙磺酸的緩沖液混合而成。其中，含有4-羥乙基哌嗪乙磺酸的緩沖液由水及4-羥乙基哌嗪乙磺酸混合而成，較優的，4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為15～35mmol/l。當緩沖液的ph值為7～7.5時，熒光探針分子對巰基類化合物的檢測較為靈敏。

步驟s103：向熒光探針溶液中加入待檢測物形成檢測液，對檢測液進行過熒光測試，檢測檢測液中是否存在熒光或熒光母體的特征峰。

本發明將可產生激發態分子內質子轉移(excited-stateintramolecularprotontransfer，esipt)機理的羥基光能團用2,4-二硝基苯磺酰氯封閉，使熒光母體熒光關閉。在檢測物質的作用下，使2,4-二硝基苯磺酰氯從熒光探針分子脫離，從而將熒光打開，再通過檢測熒光、特征峰中的一種或兩種起到檢測的效果。

如果存在熒光、特征峰中的一種或兩種，則待檢測物中存在巰基類化合物；如果不存在熒光和特征峰，則待檢測物中不存在巰基類化合物。

在本發明實施例中，巰基類化合物包括半胱氨酸。在一些實施例中，巰基類化合物包括選自天冬氨酸、丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、亮氨酸、絲氨酸、異亮氨酸中的任一種的氨基酸與半胱氨酸的混合物。在本發明的其他實施例中，巰基類化合物包括選自鉀鹽、鎂鹽、鈉鹽、鈣鹽、鋅鹽中的任一種的水溶性鹽與半胱氨酸的混合物。更進一步地，巰基類化合物包括上述任一種的水溶性鹽、上述任一種的氨基酸以及半胱氨酸的混合物。

在本發明實施例中，鉀鹽、鎂鹽、鈉鹽、鈣鹽、鋅鹽均指的是水溶性鹽，例如，kcl、nacl、mgcl2、caso4、znso4。

本發明實施例還提供了一種熒光成像方法，將上述熒光探針分子結合到待成像物，使巰基類化合物與熒光探針分子反應以使待成像物產生熒光，利用成像儀檢測待成像物產生的熒光。

熒光探針分子具有(a)所示的結構，

本發明實施例中，熒光探針分子由2,4-二硝基苯磺酰氯和如式(i)所示的熒光母體反應而成，

其中，r1表示烷氧基、羧基、硝基、氫基、烷基中任一種，r2表示烷氧基、羧基、硝基、氫基、羥烷基、氨基中任一種，r1、r2的結合位點分別獨立地為苯環上剩余的4個未結合位點中的任一個。

其中，將熒光探針分子結合到待成像物的方式例如可以是，將熒光探針分子配制為溶液，然后把待成像物浸泡于上述溶液中，或者進一步地，還可以在浸泡后撈出在適當的溫度下干燥。或者，還可以是通過噴涂的形式將探針分子固體粉末附著到待成像的物體表面。

將熒光探針分子結合到待成像物后，再將巰基類化合物固體粉末或者溶液轉移到待成像物表面，使熒光探針分子和巰基類化合物接觸并反應。

在其他實施例中，可以將熒光探針分子和巰基化合物配制為培養液，再將待成像物(組織、細胞等等)在上述培養液中進行培養。

本發明實施例提供的上述探針分子可應用于細胞成像、分子識別方面。

以下結合實施例對本發明的特征和性能作進一步的詳細描述。

實施例1

本實施例提供了一種熒光母體，通過以下步驟制得：

將水楊醛溶于乙醇溶劑中，加入亞硫酸氫鈉后，磁力攪拌2h；

再加入溶有鄰苯二胺的乙醇溶劑，升溫加熱至回流后，繼續反應4h；

其中，水楊醛、乙醇、亞硫酸氫鈉、鄰苯二胺的用量比為1mmol:25ml:1.2mmol:1.2mmol；

反應結束后，將反應產物置于冰水浴中，靜置4h過濾得固體；

將過濾后的固體真空干燥，以體積比為1:5的乙酸乙酯和石油醚作為淋洗劑，進行柱層析提純，產物即為2-(2-羥基苯基)苯并咪唑。提純，產物即為2-(2-羥基苯基)苯并咪唑。

實施例2

本實施例提供了一種熒光探針分子，通過以下步驟制得：

在冰水浴條件下，將實施例1的熒光母體2-(2-羥基苯基)苯并咪唑充分溶于二氯甲烷中；加入三乙胺得混合溶液；

在磁力攪拌的條件下，將溶有2,4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷逐滴滴加至混合溶液中；

在0℃的條件下反應18h后，通過減壓蒸餾、柱層析提純產物。提純過程中，乙酸乙酯與石油醚的體積比為1:2。

其中，熒光母體、二氯甲烷、三乙胺、2,4-二硝基苯磺酰氯的摩爾比為1mmol:15ml:1mmol:1mmol。

實施例3

本實施例提供了一種熒光探針分子，通過以下步驟制得：

在冰水浴條件下，將實施例1的熒光母體2-(2-羥基苯基)苯并咪唑充分溶于二氯甲烷中；加入三乙胺得混合溶液；

在磁力攪拌的條件下，將溶有2,4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷逐滴滴加至混合溶液中；

在-10℃的條件下反應24h后，通過減壓蒸餾、柱層析提純產物。提純過程中，乙酸乙酯與石油醚的體積比為1:4。

其中，熒光母體、二氯甲烷、三乙胺、2,4-二硝基苯磺酰氯的摩爾比為1mmol:30ml:2mmol:2mmol。

實施例4

本實施例提供了一種熒光探針分子，通過以下步驟制得：

在冰水浴條件下，將實施例1的熒光母體2-(2-羥基苯基)苯并咪唑充分溶于二氯甲烷中；加入三乙胺得混合溶液；

在磁力攪拌的條件下，將溶有2,4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷逐滴滴加至混合溶液中；

在-5℃的條件下反應21h后，通過減壓蒸餾、柱層析提純產物。提純過程中，乙酸乙酯與石油醚的體積比為1:3。

其中，熒光母體、二氯甲烷、三乙胺、2,4-二硝基苯磺酰氯的摩爾比為1mmol:20ml:1.2mmol:1.2mmol。

實施例5

本實施例提供了一種巰基類化合物的檢測方法，包括：

將4-羥乙基哌嗪乙磺酸與水混合配制濃度為15mmol/l的緩沖液，該緩沖液的ph值為7.2；

將緩沖液與乙腈以體積比為1:1.5混合配制熒光探針溶劑；

將熒光探針溶劑與實施例4的熒光探針分子混合配制熒光探針溶液；

將待檢測物加入熒光探針溶液中進行熒光測試。

實施例6

本實施例提供了一種巰基類化合物的檢測方法，包括：

將4-羥乙基哌嗪乙磺酸與水混合配制濃度為35mmol/l的緩沖液，該緩沖液的ph值為7.5；

將緩沖液與乙腈以體積比為1:2混合配制熒光探針溶劑；

將熒光探針溶劑與實施例4的熒光探針分子混合配制熒光探針溶液；

將待檢測物加入熒光探針溶液中進行熒光測試。

實施例7

本實施例提供了一種巰基類化合物的檢測方法，包括：

將4-羥乙基哌嗪乙磺酸與水混合配制濃度為15mmol/l的緩沖液，該緩沖液的ph值為7.2；

將緩沖液與乙腈以體積比為1:1.5混合配制熒光探針溶劑；

將熒光探針溶劑與實施例4的熒光探針分子混合配制熒光探針溶液；

將待檢測物加入熒光探針溶液中進行熒光測試。

實施例8

本實施例提供了一種巰基類化合物的檢測方法，包括：

將4-羥乙基哌嗪乙磺酸與水混合配制濃度為25mmol/l的緩沖液，該緩沖液的ph值為7；

將緩沖液與乙腈以體積比為1:1混合配制熒光探針溶劑；

將熒光探針溶劑與實施例4的熒光探針分子混合配制熒光探針溶液；

將待檢測物加入熒光探針溶液中進行熒光測試。

實施例9

本實施例提供了一種熒光成像方法，其采用實施例8制備的熒光探針溶劑配制濃度為20μm的熒光探針溶液，同時用實施例8的熒光探針溶劑配制濃度為20μm的半胱氨酸溶液。分別用dmem培養基(市售產品)培養2組hela細胞(海拉細胞)。在第一組細胞中只加入熒光探針溶液，在37攝氏度下培養30分鐘。在第二組細胞中加入熒光探針溶液和半胱氨酸溶液，相同條件下培養30min。兩組細胞中加入的液體體積相同。培養結束后，分別用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次1分鐘，將細胞置于成像儀下觀察，觀察加入探針前后的熒光變化，結果見圖1。

由圖1可知，兩組細胞在明場像中可同時觀察到細胞，但在熒光場中，無法看到第一組細胞，但可以清楚的看到第二組細胞。說明實熒光探針溶液中的熒光探針分子可準確的檢測出半胱氨酸，即巰基類化合物。本發明的巰基類化合物的檢測方法可應用于熒光成像中，且具有良好的效果。

需要說明的是，成像儀可以采用市售設備，如熒光顯微鏡，特別地，本實施例中，成像儀為激光共聚焦顯微鏡。

試驗例1

對實施例2～實施例4制備的熒光探針分子進行產率計算，實施例2制備的熒光探針分子的產率為79％，實施例3制備的熒光探針分子的產率為84％，實施例4制備的熒光探針分子的產率為89％。故實施例5～8均采用實施例4制備的熒光探針分子進行熒光探針溶液的配制。

試驗例2

分別配制熒光探針分子濃度相同的實施例5～8的熒光探針溶液，均加入相同濃度相同體積的半胱氨酸，進行熒光檢測，觀察發現，實施例8的熒光探針溶液較靈敏，對半胱氨酸具有較好的熒光響應。

試驗例3

配制16份熒光探針分子濃度為40μm的實施例8的熒光探針溶液，分別加入濃度依次為2.5、5、7.5、10、20、30、40、50、60、70、80、120、160、200、300、400μm的半胱氨酸。對16份待測樣品進行熒光測試，測試結果如圖2。

由圖2可知，初始條件下，熒光探針分子在350nm激發波長下無發射峰。熒光探針分子中的苯磺酸酯鍵與半胱氨酸分子結構中的巰基發生專一性化學反應后，由于影響esipt過程的羥基官能團的2,4-二硝基苯磺酸基從母體分子脫離，熒光母體的熒光性質恢復，在452nm處出現特征發射峰。在熒光探針分子濃度相同、半胱氨酸濃度不同的條件下，熒光強度隨著半胱氨酸濃度的提高而逐漸增加。說明實施例8的熒光探針溶液較為靈敏、準確的檢測巰基類化合物。

試驗例4

配制14份熒光探針分子濃度為20μm的實施例8的熒光探針溶液，分別加入含有不同干擾物質的溶液，檢測熒光探針分子對半胱氨酸的選擇性。分別加入的物質為：1.cys；2.cys+k⁺；3.cys+mg²⁺；4.cys+na⁺；5.cys+ca²⁺；6.cys+zn²⁺；7.cys+asp；8.cys+ala；9.cys+val；10.cys+phe；11.cys+his；12.cys+leu；13.cys+ser；14.cys+ile。測試結果如圖3。

由圖3可知，14份含有不同干擾物質的熒光探針溶液均檢測出特征光譜峰，且峰值均較高，說明熒光探針分子對半胱氨酸的選擇性好、專一性強，能夠有效的抵抗其他分子和離子的干擾。

綜上所述，本發明以制備的熒光探針分子配制熒光探針溶液，向熒光探針溶液中加入待檢測物質進行熒光檢測。熒光探針分子中的苯磺酸酯鍵與半胱氨酸分子結構中的巰基發生專一性化學反應后，由于影響esipt過程的羥基官能團的2,4-二硝基苯磺酸基從母體分子脫離，熒光母體的熒光性質恢復，出現特征發射峰。該檢測方法可快速、高效的檢測巰基類化合物，專一性強、靈敏度高、抗干擾能力強，對巰基類化合物具有很好的熒光響應，在細胞成像應用中具有良好的效果。

以上所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發明的實施例的詳細描述并非旨在限制要求保護的本發明的范圍，而是僅僅表示本發明的選定實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。