一種牛源肌酸激酶同工酶膠體金免疫層析快速檢測試紙條的制作方法

本發明涉及膠體金免疫層析快速檢測領域，具體涉及一種牛源肌酸激酶同工酶(ck-bb)膠體金免疫層析快速檢測試紙條及方法。
背景技術：
：近年來我國奶牛業發展十分迅速，然而不孕癥對奶牛養殖業的發展有著重要的影響。大量資料表明，不孕癥占奶牛疾病的20％～30％，子宮內膜炎占不孕癥的40％～60％。引起奶牛子宮內膜炎的病因較多，但主要原因是產后的早期感染所致，有研究表明奶牛產后的早期階段有93％的牛發生子宮感染細菌，到46-60天時感染率降低到39％。奶牛子宮內膜炎使受精卵不能著床或胚胎早期死亡，延遲了產犢間隔，嚴重影響奶牛的繁殖和生產能力及效率，給奶牛生產造成極大的經濟損失。據資料報道，美國每年有12.19％的奶牛由于不孕癥或繁殖疾病而被淘汰，占淘汰母牛的52.37％，每年因不孕癥損失高達2.7億美元；北京農業大學對北京、南京、上海等16個城市調查，子宮內膜炎占不孕奶牛的68.34％，國內每年淘汰的不孕奶牛占淘汰總數的60％-70％。肌酸激酶(creatinekinase,ck；ec2.7.3.2)分子量81000～82000da，是由兩個亞基(m和b)組成的二聚體，可逆催化肌酸與atp之間的轉磷酰基反應，在肌酸和磷酸肌酸的轉化反應中起著重要的作用。比如在能量代謝最旺盛的肌肉組織和腦組織中，ck的活性是最高的。在內臟器官中，子宮是ck第三活躍的器官，頭兩位是骨骼肌和心肌。根據其同工酶亞基和分布位置的不同，在牛中存在有三種ck同功酶，其中：ck-mm(特異存在于骨骼肌)、ck-mb(特異存在于心肌)和ck-bb(從牛腦中獲得)。以上這些同功酶都存在于細胞質中，galitzer和oehme(1985)對牛所有器官的ck進行檢測發現，內臟器官中含有的ck要遠遠少于骨骼肌和心肌，并且大部分的ck屬于同功酶ck-bb。健康牛血清中的ck組成幾乎全部由ck-mm構成，但研究發現在懷孕中和產后婦女、懷孕豚鼠的血清中還存在有可檢測到的ck-bb(腦源或平滑肌源)和ck-mb(clarketal.,1994)。造成以上現象的原因很有可能是在懷孕后期對能量(新陳代謝)更高的需求(clarketal.,1994)，即子宮組織在分娩前后對其機械性和新陳代謝有更高的要求(abramovetal.,1996)。我們研究表明子宮內膜感染發炎后血清肌酸激酶活性顯著增高，據研究結果其可作為奶牛子宮內膜炎的重要診斷指標。目前，奶牛子宮內膜炎的診斷主要依靠視診、觸診和子宮探針為主的傳統方法，存在早期診斷確診率低和導致植入性病原菌二次感染的問題。因此，迫切需要研究建立一種適用于奶牛子宮內膜炎早期排查的快速、靈敏、經濟適用、操作簡便的現場快速檢測方法。免疫膠體金技術是一種應用較廣的免疫學方法，該技術是一種將膠體金顆粒與包括抗原、抗體在內的許多蛋白質標記形成免疫金復合物的技術。使用免疫金標技術制備的標記物作為檢測系統中的指示試劑，應用在檢測傳染病、環境污染物、毒品、早孕以及獸醫等領域，這種技術的應用很大程度上提高了體外診斷技術的簡便性和快速性。在層析材料上發生的免疫反應，具備免疫反應的高特異性、高效率性、高親合性的特點。具體的過程是，含有待測物的樣品溶液通過纖維層析材料的毛細作用沿著層析材料上移，與固定在層析材料上的針對待測物的受體(抗原或抗體)結合發生特性性免疫反應，在些過程中抗原抗體復合物不斷的被積累富集，通過酶反應標記物或直觀可視標記物(如膠體金)使之顯色，從而達到檢測目的物質的目的。技術實現要素：本發明根據奶牛子宮內膜炎與血清肌酸激酶活性的正相關性，通過重組表達牛源肌酸激酶同工酶(ck-bb)，制備篩選鼠源單克隆抗體，進一步利用膠體金包被和免疫層析原理研制了一種快速檢測牛源肌酸激酶同工酶(ck-bb)的試紙條，用于田間監測奶牛肌酸激酶同工酶(ck-bb)的變化。本發明的目的是提供一種牛源肌酸激酶同工酶(ck-bb)膠體金免疫層析快速檢測試紙條及方法，由此快速即時檢測子宮內膜炎，通過膠體金免疫層析定量檢測的方法，檢測牛血清中肌酸激酶同工酶(ck-bb)的濃度，從而用于評估奶牛子宮內膜炎情況，準確，快速，靈敏度高，無需專業人員操作，成本較低，便于推廣使用。雙抗體夾心法的工作原理如下：待測物的兩個不同抗原位點分別針對單克隆金標抗體和檢測線單克隆抗體。例如一個陽性樣本，待測物可同時與金標單抗和檢測線單抗結合成一個雙抗體夾心待測物的大分子，這個巨型分子由于固定在檢測線的單抗而在檢測線(t)聚集，當聚集足夠多的膠體金時可被肉眼觀察。隨著待測物的增多多余的金標抗體繼續層析，質控線包被的是金標抗體的二抗，當多余的金標抗體層析到質控線(c)時，與c線上的二抗結合并不斷積累直到顯色。所呈現的陽性結果為：t線、c線雙顯色；陰性結果為：t線消失，c線顯色。檢測線和質控線均不顯色則為失效。為達到上述目的，本發明采用第一技術方案：一種抗牛源肌酸同工酶膠體金免疫層析檢測試紙條，其特征在于其包括：背襯、設置在試劑背襯上的樣品墊、金標結合墊、層析膜和吸收墊，其中設置在背襯一端的樣品墊、一端與樣品墊抵靠接觸的金標結合墊、一端與金標結合墊另一端抵靠接觸的層析膜、以及與層析膜另一端接觸的吸收墊，其中金標結合墊上包含膠體金納米顆粒標記的鼠抗牛源肌酸同工酶的第一抗體，而層析膜上分布了不重合的檢測線和質控線，其中檢測線上包含了鼠抗牛源肌酸同工酶的第二抗體，質控線上包含了抗第一抗體的第三抗體。在第一技術方案的基礎上，進一步包括如下附屬技術方案：所述第二抗體為只有在有ck-bb存在的情況下才和ck-bb及第一抗體特異性結合，而第三抗體在任何情況下都能和第一抗體結合。所述樣品墊和金標結合墊至少部分重疊，而金標結合墊和層析膜至少部分重合。所述膠體金粒徑為10-100nm，且膠體金顆粒的制備使用恒溫回流加熱法。所述檢測線靠近膠金墊一端，所述質控線靠近吸收墊一端，所述檢測線和質控線相隔距離在0.5-1.5cm之間。所述所述試劑盒包括相互匹配并扣合的上下半卡殼，所述卡殼具有加樣孔和觀察孔，加樣孔位于金標結合墊和樣品墊處并局部裸露樣品墊，而觀察孔位于層析膜上方并裸露檢測線和質控線。進一步的，牛血清樣本加樣后，膠體金免疫層析試劑盒結合膠體金讀取儀檢測血清樣本中含有的ck-bb的濃度水平。進一步的，所述膠體金讀取儀采用膠體金免疫層析定量讀取儀，屬于一種由光、機、電組成的精密儀器，掃描讀取檢測線和質控線的信號強度值，將信號強度值通過光電及模/數轉換，轉為數字信號，內置優化好的ck-bb光度-濃度標準曲線，數字信號在標準曲線中計算后，獲得所檢測得到的濃度值。所述膠體金讀取儀掃描檢測線與質控線時，吸收光掃描范圍根據膠體金粒徑大小。與現有技術相比，本發明的有益效果至少在于：試劑盒中，作為檢測標記物ck-bb的單克隆抗體，采用目前被廣泛使用的膠體金作為標記物質，標記條件成熟穩定無毒，試劑盒本身分辨率、靈敏度、穩定較強，可以選擇用肉眼做半定量檢測，也可配合膠體金讀取儀的使用做定量檢測。本發明的ck-bb膠體金免疫層析快速檢測試紙條及檢測系統，操作簡單直接加血清樣本、檢測時間短，適合于推廣使用，克服了現有酶聯免疫方法及化學發光法，價格昂貴，檢測耗時且需要投入專業操作人員的缺點。本發明結合了膠體金讀取儀體積小、重量輕、便于攜帶、并能獨立處理數據從而定量檢測的優點，特別適合牛血清ck-bb水平在基層牧場的檢測。本發明通過臨床驗證、評價和對本方法的完善，提高檢測血清肌酸激酶指標揭示和反應奶牛子宮內膜感染炎癥程度的靈敏性、準確性，最終建立奶牛子宮內膜炎早期快速診斷新方法，做到不需要專業儀器，通過簡單操作，實現在田間進行奶牛子宮內膜炎現場快速檢測和輔助臨床檢查做出早期快速診斷。附圖說明下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述：圖1：以牛心源肌酸激酶(ck-mb)為標準物采用sds-page電泳，檢測子宮內膜炎牛血清樣本，圖中的ck標準物為商品牛源ck-mb和兔源ck；圖2：樣本牛血清與ck-bb多克隆抗體wb檢測，圖2-a為正常曝光時間拍得wb照片，圖2-b為長時間曝拍得wb照片；圖2-c表明所有樣本血清中的均與抗ck-bb多克隆抗體有特異性反應；圖3：質粒pet28b-ck-bb經ndei和xhoi雙酶切；圖4：牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白誘導結果：1：誘導前總蛋白，2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀；圖5：牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白蛋白純化sds-page分析圖，m：proteinmarker；1：上樣；2：流出；3：10mmimidazole洗脫組分；4：20mmimidazole洗脫組分；5-9：50mmimidazole洗脫組分；10-12：500mmimidazole洗脫組分；圖6：牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白蛋白sds-page分析圖，m：proteinmarker；1：目的蛋白；圖7：牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白westernblot分析圖m：proteinmarker；1：目的蛋白；圖8：蛋白濃度測定曲線圖；圖9：膠體金免疫層析試紙條結構示意圖；圖10：標準品檢測結果：從左往右依次為1、0.5、0.2、0.1、0ppm；圖11：膠體金免疫層析快速檢測試紙條判定方法；圖12：膠體金免疫層析快速檢測試紙條檢測，梯度用pbs稀釋表達蛋白至0、0.5、1、5、10、40ppm；圖13：采用膠體金免疫層析快速檢測試紙條檢測31組血清樣本結果。具體實施方式實施例1.奶牛血清中肌酸激酶與子宮內膜炎的相關性研究取得通過常規方法確診為患有子宮內膜炎牛的血清，檢測其肌酸激酶(ck)值，通過對照與陽性組的比較，確定牛子宮內膜炎與ck的相關性。采集到來自呼和浩特和包頭周邊牛場的多份臨床癥狀為奶牛子宮內膜炎患牛血清，進行生化分析檢測肌酸激酶活力并得到相關數據。以牛心源肌酸激酶(ck-mb)為標準物采用sds-page電泳，檢測子宮內膜炎牛血清樣本(圖1)，通過觀察目的條帶的大小和顏色的深淺判斷臨床血清樣本ck與牛心源肌酸激酶(ck-bb)為標準物的一致性和符合度。初步研究結果如下：1、臨床診斷為奶牛子宮內膜炎的病牛血清樣本中的ck活性比健康牛值顯著增高。正常牛只的血清肌酸激酶活性在80-200u/l，主要集中在100-200u/l，感染牛只在200-1796u/l。2、圖中的ck標準物為商品牛源ck-mb和兔源ck，與臨床血清樣本ck有較大差異，結合有關人和動物的ck監測結果，基本判定與臨床確診為子宮內膜炎相關的病牛血清樣本ck本質是ck-bb。我們還從牛場采集到的臨床癥狀符合奶牛子宮內膜炎的病牛血清6份，進行ck活力檢測(表1)，同時采用蛋白免疫印跡方法wenstern-blot，以兔抗重組表達ck-bb的多克隆抗體檢測臨床樣本血清中ck與重組表達ck-bb多克隆抗體的特異性結合率(圖2)，以考察重組表達ck-bb與臨床血清樣本ck的相關性，結果顯示：1、6個臨床確診子宮內膜炎病牛血清中肌酸激酶ck活性均增高。2、重組表達ck-bb的兔源多克隆抗體與臨床確診子宮內膜炎病牛血清中肌酸激酶ck有特異性的結合，為研制膠體金免疫層析試紙條奠定了理論基礎。表1樣本牛血清ck活力檢測綜合奶牛血清中肌酸激酶與子宮內膜炎的相關性研究結果及重組牛肌酸激酶同工酶(ck-bb)蛋白免疫印跡(western-blot)分析結果，可以確定由重組牛肌酸激酶同工酶(ck-bb)開始研制檢測牛肌酸激酶同工酶(ck-bb)膠體金免疫層析試紙條，在此基礎上進一步研發奶牛子宮內膜炎早期快速診斷試劑盒。實施例2.全基因合成牛肌酸激酶同功酶ck-bb由于牛子宮內膜炎與血清中牛肌酸激酶同功酶ck-bb具有高相關性，因此采用牛肌酸激酶同功酶ck-bb作為抗原制備相關單抗和多抗。在本發明中，關鍵的試劑牛腦源或平滑肌源肌酸激酶ck-bb的短缺，嚴重制約了實驗的開展。由于ck-bb的應用較小，市面上的牛源肌酸激酶大多數是以ck-mb為主要成分，沒有ck-bb的商品，給研究造成了困難。為了解決ck-bb不足的問題，發明人研究決定采用全基因合成的方法合成牛源ck-bb基因，并對其進行原核表達。通過ncbi查詢到牛肌酸激酶ck-bb的氨基酸序列，序列號為：genbank:aax08725.1并對其進行適用于大腸桿菌bl21的密碼子優化，采用二步法人工合成牛ck-bb的全基因，接下來將合成好的全基因連接到表達載體pet28b，轉化入大腸桿菌bl21(de3)，經小量表達試驗測得有大量目的蛋白表達，成功制備了牛肌酸激酶同功酶ck-bb的大腸桿菌工程菌，為后期大量制備牛ck-bb奠定了堅實的基礎。實驗過程簡述如下：2.1ck-bb基因遺傳密碼子改造及引物的設計和人工合成根據牛肌酸激酶同功酶ck-bb的氨基酸序列(genbank:aax08725.1)，在bioedit軟件的輔助下推導出該基因的核苷酸序列，將起始密碼子atg和終止密碼子taa分別添加于ck-bb序列的5’端和3’端；使用dnaworks軟件以大腸桿菌密碼子使用頻率為基準，對該基因的密碼子進行優化，引物設計合成54條互相重疊的40bp的引物，從中選取引物ck-1和ck-54(表2)分別引入ndei和xhoi酶切位點。引物合成后經脫鹽、page純化后備用。引物名稱引物序列ck-1gcctggtgccgcgcggcagccatatgcctttcagcaack-54cagtggtggtggtggtggtgctcgagtttctgc表2ck-bb全基因合成和擴增編碼dna引物序列2.2牛肌酸激酶同功酶ck-bb的全基因合成首先對合成ck-bb全基因測序結果，隨后人工合成改造后的牛肌酸激酶同功酶ck-bb全基因序列，合成的質粒pet28b-ck-bb可經ndei和xhoi雙酶切(圖3)。2.3通過原核表達系統，小量表達重組牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白。pet28b-ck-bb陽性質粒轉化原核表達宿主菌bl21和rosetta，涂布于對應固體培養基，37℃培養12-16h。挑取單菌落于對應液體培養基培養12-16h，保存甘油菌于-80℃。菌種活化：復蘇菌種，37℃過夜培養活化。誘導表達：次日，菌種以1：50擴大培養5ml，37℃培養至od600＝0.4-0.6，收取2.5ml菌種經處理作為誘導前對照。剩余2.5ml加入0.5mm的iptg，37℃誘導表達3h，離心收集的菌體經處理作為誘導后樣品，sds-page鑒定蛋白的表達情況。原核表達載體信息：復蘇pet28b-ck-bb(bl21)菌種，37℃過夜培養活化。次日，菌種以1：50擴大培養800ml，37℃培養至od600＝0.4-0.6，加入0.5mm的iptg，37℃誘導表達5h。8000rpm、4℃離心5min，收集菌體。加100ml破碎液進行超聲波裂解。裂解條件：溫度冰浴、功率60％、超聲2s、間隔2s、時間15min。12000rpm、4℃離心15min，收集上清和沉淀。sds-page檢測，判斷目的蛋白的表達形式。利用高親和性ni樹脂純化上清，收集流穿液、洗脫液，sds-page檢測蛋白純化效果。將純化的目的蛋白透析去除咪唑，sds-page檢測蛋白透析效果。檢測效果如下：(1)牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白誘導結果通過對重組表達樣品進行sds-page分析(圖4)，由sds-page圖可以看出，在37℃沉淀中有明顯表達。(2)牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白蛋白鎳瓊脂糖親和層析sds-page結果(圖5)通過圖sds-page分析圖可以看出，目的蛋白50mm、100mm和500mmimidazole時被陸續洗脫下來，在500mm處時目的蛋白的純度較好。取10-12處的蛋白加0.3％skl透析至10mmpbs，0.1％skl，ph8.0中。濃縮，過濾除菌，分裝后于-80℃保存。(3)牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白最終純化sds-page分析(圖6)(4)牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白westernblot分析(圖7)(5)牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白濃度測定用sk3071非干擾型蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度:2.012mg/ml，結果如圖8所示。實施例3.ck-bb單克隆抗體的制備1.小試：pet28b-ck-bb陽性質粒轉化bl21和rosetta宿主菌，小試均有明顯表達。2.抗原制備：大量誘導表達pet28b-ck-bb(bl21)，目的蛋白在上清和包涵體明顯表達，優先純化上清，上清經純化、透析，最終得到ck-bb重組蛋白5mg，蛋白純度＞90％。3.多抗制備：制備了多克隆抗體，效價1:243000。4.單抗制備：制備了單克隆抗體，篩選到陽性細胞株5株。5.抗體制備與純化：植腹水，純化得到單克隆抗體。6.抗體配對篩選：使用elisa方法對抗體進行配對篩選，獲得能配對的抗體對。7.elisa條件優化：選取效果最好的抗體對進行elisa條件優化。8.金標條件優化：篩選效果最好的一對抗體進行金標條件優化。制備方法簡述如下：取2月齡雌性新西蘭大白兔一只進行免疫，共進行三次免疫，采取大腿肌肉多點注射。每次每只新西蘭大白兔抗原免疫用量為500ug，初次免疫用等量弗氏完全佐劑乳化，第二次免疫用等量弗氏不完全佐劑乳化，第三次免疫用等量生理鹽水混合，耳靜脈注射。第二次免疫后14天靜脈采血，通過間接法測抗體效價，以此確定是否有針對目標的抗體生成。效價達標之后第三次進行加強免疫；效價不達標，則第三次繼續弗氏不完全佐劑皮下進行免疫，28天后第四次進行加強免疫。加強免疫14天后取血。取6周齡雌性balb/c小鼠四只進行免疫，共進行三次免疫，采取批下多點注射。每次每只小鼠抗原免疫用量為25ug，初次免疫用等量弗氏完全佐劑乳化，第二次免疫用等量弗氏不完全佐劑乳化，第三次免疫用等量生理鹽水混合，腹腔注射。第二次免疫后10天尾靜脈采血，通過間接法測抗體效價，以此確定是否有針對抗原的抗體生成。比較四只小鼠效價，最后選擇抗體效價較高的小鼠用于細胞融合。融合前三天，用抗原直接加強免疫一次，劑量同前。從液氮中取出凍存骨髓瘤細胞細胞，立即放入37℃水浴中融化，離心，棄上清，用少量完全培養液打散細胞團，加入約完全培養基于凍存管中，用吸管吹打均勻，全部吸出轉至細胞培養瓶中，置于37℃二氧化碳培養箱中培養。待細胞長滿瓶底后傳至另一細胞瓶中培養，在倒置顯微鏡下觀察其細胞狀態，狀態良好的細胞備做融合用。取效價最高且加強免疫的小鼠，眼球摘除采血，分離血清作為檢測時的陽性對照血清。將小鼠頸椎脫臼致死，浸泡于酒精消毒，移入超凈工作臺內，固定于解剖板上，用滅菌剪刀、鑷子分別剪開左側皮膚和腹膜，無菌取出脾臟置于已盛有基礎培養液的無菌平皿中清冼，剝離被膜上的結締組織。將脾臟移入另一盛約有基礎培養液的平皿內的濾膜中，用兩個注射器上的彎針頭將脾臟刺孔，然后其中一個彎針頭固定濾膜，另一個彎針頭擠壓濾膜，使脾細胞完全釋放到平皿中的基礎培養液中。用無菌滴管吹打細胞制成單細胞懸液，收獲脾細胞懸液。將平皿中脾細胞懸液轉移到離心管中，離心，棄上清，用細胞培養液離心洗滌一次。用peg將分離得到的脾細胞與提前復蘇備用的骨髓瘤細胞進行融合，離心，棄上清，用細胞培養液離心洗滌一次，加入用hat的細胞培養液吹打成單細胞懸液，鋪入96孔細胞培養板。細胞融合后第7天，培養板孔底長出肉眼可見的克隆，首先通過elisa間接法對所有細胞孔進行初次篩選，記錄呈現強陽性的細胞孔。對初篩呈陽性的各細胞孔應及時在24孔細胞培養板中進行擴大培養和克隆化。采用有限稀釋法將細胞懸液連續稀釋至統計上每孔加樣僅含單個細胞，轉移至96孔板培養，經過數次克隆化操作，直至所有克隆化細胞孔檢測陽性率為100％時，即可確定已獲得分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。將獲得的陽性雜交瘤細胞在細胞培養瓶中擴大培養，而后凍存及制備腹水等。取6周齡健康雌性小鼠，腹腔注射0.5ml液體石蠟致敏，一到兩周后，每只小鼠腹腔注射1-2x106個雜交瘤細胞，觀察小鼠狀態7-10天后待小鼠腹腔明顯膨大后收集腹水，離心上清液即為腹水，分裝、標記，備用。腹水離心15min(4000rpm，室溫)，取上清，在4℃攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸銨至半飽和，繼續攪拌30min，離心30min(13000rpm，4℃)，棄上清；沉淀溶于適量pbs(0.01m,ph7.4)；在4℃攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸銨至33％，繼續攪拌30min，離心30min(13000rpm，4℃)，棄上清；沉淀溶于適量pbs(0.01m,ph7.4)，4℃透析過夜，測定抗體含量，-20℃凍存備用。硫酸銨沉淀后繼續采用proteing小柱進行純化，新柱子先用5ml超純水過柱，再用5ml0.4mpb緩沖液(ph7.0)平衡純化小柱；抗體過柱，過程中要求緩慢過柱，以求抗體蛋白更好的結合在結合位點上；繼續10ml0.4mpb緩沖液(ph7.0)平衡純化小柱；5ml0.1m甘氨酸-鹽酸緩沖液(ph2.7)洗脫結合位點上的抗體，并加入1mtris-hcl(ph8.0)中和甘氨酸，使ph保持為適合抗體保存的中性。應用小鼠抗體亞型鑒定試劑盒進行測定以及應用間接elisa方法測定抗體效價。實施例4.膠體金免疫層析試紙條的制備1.金標配對篩選對抗體進行配對篩選，選擇假陽性低、靈敏度高的抗體對。雙抗夾心的膠體金試紙方法如下：a、膠體金制備b、抗體標記c、噴金與劃膜a)將包被抗原稀釋至適當濃度劃于t線，羊抗鼠二抗劃于c線，烘干待用；b)標記好的膠體金噴于預處理過的金標墊，烘干待用。d、組裝與測試a)將不用編號的金與膜兩兩組合，檢測配對效果。2.膠體金速測試紙條件優化對劃膜、膠體金標記和反應條件等進行優化，得到合適的條件，并編寫工藝文件。3.產品生產根據編寫的工藝文件，進行膠體金速測試紙的生產(圖9)。噴金：將純化好的金標抗體使用濃度為：2.0μl/cm用點金標(膜)機均勻的噴在處理過的金標墊上，37℃烘干24小時，待用。劃膜：選取cn140的nc膜用點金標(膜)機將濃度為2.0mg/ml的fl155-1#鼠單抗以1.0μl/cm劃t線，濃度為1mg/ml的羊抗鼠二抗以1.0μl/cm劃c線，37℃烘干24小時，待用。抗體配對篩選：篩選單克隆抗體相互交叉配對，最終選擇fl155-1#、fl155-2#鼠單抗，其中fl155-1#劃膜，fl155-2#抗體標記。對制備的膠體金免疫層析試紙進行標準品檢測：配置0、0.2、0.5、1μg/ml的牛ck-bb表達蛋白于1.5ml離心管中，將檢測條按照箭頭插離心管中，在10分鐘后讀取結果(圖10)，檢測重組蛋白靈敏度可達到0.2ppm。實施例5.ck-bb牛血清樣本檢測報告1、ck-bb牛血清樣本檢測方法采用雙抗夾心金標法對實際樣本進行檢測，操作步驟如下：(1)測試前請完整閱讀使用說明書，并將速測試紙和待檢樣本溶液恢復至常溫；(2)從包裝袋中取出速測試紙后請盡快使用；(3)將速測試紙從試紙桶中取出，直接插入樣品槽中，開始計時；(4)結果應在10-15分鐘讀取，其他時間判讀無效；(5)讀取結果時，速測試紙水平置于觀察者正面，如圖11所示。2、表達蛋白測試用pbs稀釋表達蛋白至0、0.5、1、5、10、40ppm，如圖12所示：3、實際樣本檢測3.1根據酶標的檢測結果，將血清樣本直接滴加測試；3.2樣本檢測結果提供3組樣本進行檢測。ck-bb血清樣本檢測結果結論：3組共31個樣本，基本都能檢測出陽性(圖13)。當然上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人能夠了解本發明的內容并據以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍。凡根據本發明主要技術方案的精神實質所做的等效變換或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。當前第1頁12