一種細胞因子免疫層析試紙及其制備方法與流程

本發明屬于生物醫學檢測領域，具體涉及一種細胞因子免疫層析試紙及其制備方法。

背景技術：

細胞因子(cytokine，ck)是免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導多種細胞產生的低分子量可溶性蛋白質，具有調節固有免疫和適應性免疫、血細胞生成、細胞生長、apsc多能細胞以及損傷組織修復等多種功能。細胞因子可被分為白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長因子等。細胞因子具有重要的生物學功能，例如白介素6(il-6)是一種由免疫系統細胞、血管內皮細胞及脂肪細胞產生的多效應細胞因子。它能在免疫反應、急性反應、造血作用、腫瘤發生和炎癥反應中起到關鍵作用，il-6水平在自身免疫性疾病、心血管疾病、急性感染、燒傷、急性髓樣白血病、器官移植排斥等疾病中均有改變，且il-6水平變化與病程密切相關。因此，對il-6等細胞因子進行快速、靈敏檢測能夠對病情變化進行監測，及早發現異常并采取治療措施，具有重大意義。

目前，如細胞因子這樣的蛋白質小分子的檢測方法主要有elisa、免疫熒光檢測、免疫電化學檢測、表面等離子共振等，這些方法均涉及抗體孵育、樣品孵育、標記以及許多洗脫的步驟，操作繁瑣，難以達到快速、簡便的檢測，并且難以在空間和設備有限的條件下進行檢測。

但目前免疫層析試紙條的檢測限通常在幾十ng/ml，靈敏度不足，難以檢測水平較低的細胞因子。超順磁納米顆粒(superparamagneticnanobead,spmnb)是一種新興的納米材料，具有良好的磁學性質和磁分離特性，在磁場存在下可被固定，而撤銷磁場時又能快速重懸，分散于溶液中。利用修飾相應的細胞因子抗體的超順磁納米顆粒，可以簡便的實現細胞因子免疫層析試紙的快速、可視化檢測。

技術實現要素：

為了克服現有技術上的問題，本發明提供了一種細胞因子免疫層析試紙及其制備方法，在高靈敏度檢測的同時大大縮短了檢測時間，并且可以及時給出定量結果，檢測儀器簡單可靠，操作簡易，方便實用。

本發明提供以下技術方案：

一種細胞因子免疫層析試紙，依次包括樣品區、結合區、檢測區，在所述樣品區，檢測液添加在樣品墊上，用于檢測液在結合墊上均勻分布并去除樣品中的雜質顆粒；

在所述結合區樣品墊部分疊壓在結合墊之上，結合墊表面涂布納米顆粒與目標細胞因子單克隆抗體的偶聯物，檢測液中的目標細胞因子與所述單克隆抗體特異性結合，結合墊用于吸附部分所述偶聯物；

在所述檢測區結合墊部分疊壓在蛋白持留用膜上，所述蛋白持留用膜先后間隔設有檢測線和質控線，所述檢測線包被有目標細胞因子的多克隆抗體，當檢測液中的目標細胞因子與所述多克隆抗體結合后，檢測線處顯色，目標細胞因子被檢出；所述質控線上包被與所述單克隆抗體特異性結合的二抗抗體，當檢測液中所述偶聯物的單克隆抗體抗體與所述二抗抗體結合，質控線處顯色，效驗檢測過程是否有效。

進一步地，在檢測區下游還設有吸收區，在所述吸收區吸收墊部分疊壓在蛋白持留用膜上，吸收墊用于控制檢測液流速、促進虹吸作用，及避免檢測液滯留在檢測區表面。

進一步地，所述樣品墊和結合墊的材質為玻璃纖維、無紡布、聚酯膜或纖維素濾紙；所述吸收墊為濾紙或層析紙。

進一步地，所述納米顆粒為超順磁納米顆粒，所述超順磁納米顆粒的直徑為100-300nm，結合墊涂布濃度為10μl/cm-30μl/cm。

進一步地，所述蛋白持留用膜為硝酸纖維素膜、pvdf膜或尼龍膜。

進一步地，所述細胞因子為白細胞介素、干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、趨化因子或生長因子。

進一步地，目標細胞因子為白介素6，所述超順磁納米顆粒表面修飾氨基，通過碳二亞胺法與白介素6的單克隆抗體共價偶聯，所述檢測線包被白介素6多克隆抗體。

進一步地，檢測線和質控線顯色結果通過灰度處理進行目標細胞因子的半定量分析。

進一步地，通過磁性分析儀mar對檢測線和質控線的磁性進行定量分析。

一種細胞因子免疫層析試紙的測試試紙條，所述測試試紙條包括測試卡槽、試紙條本體、試紙條蓋板，所述試紙條本體由下至上依次為寬度相同、長度不同的底板條、蛋白持留用膜、結合墊、樣品墊和吸收墊，所述結合墊部分疊壓在所述蛋白持留用膜一端上部，所述樣品墊依次部分疊壓在所述結合墊延長端上部，所述吸收墊部分疊壓在所述蛋白持留用膜另一端上部；

試紙條本體置于測試卡槽內部，試紙條蓋板與所述測試卡嵌合將試紙條本體固定其中，在所述測試卡上設有樣品區通孔和檢測區通孔，所述樣品區通孔對應所述樣品墊位置；所述檢測區通孔對應所述蛋白持留用膜位置，在試紙條蓋板上檢測線和質控線的對應位置分別設有檢測線和質控線標識。

一種測試試紙條的制備方法，包括以下步驟：

步驟一制備結合墊，將超順磁納米顆粒懸浮液洗滌、活化，將超順磁納米顆粒與目標小分子蛋白質單克隆抗體混合、偶聯，對偶聯物液體進行封閉、重懸、保存，定量噴涂在結合墊上，

步驟二制備蛋白持留用膜，對蛋白持留用膜進行包被，在檢測線上包被目標小分子蛋白的多克隆抗體，在質控線上包被與單克隆抗體特異性結合的二抗抗體，檢測線與質控線之間設有間隔；

步驟三組裝測試試紙條，將底板條、蛋白持留用膜、結合墊、樣品墊和吸收墊依次疊放成試紙條本體，將試紙條本體置于測試卡槽內部，將試紙條蓋板壓蓋在試紙條本體上與測試卡槽嵌合，真空密封保存。

采用上述技術方案，本發明具有如下有益效果：

1、本發明可以完成液體中目標細胞因子的檢測，超順磁納米顆粒與目標細胞因子的單抗偶聯，對目標細胞因子進行檢測，高效、精準、測試時間短，本發明試紙適多種細胞因子的檢測，靈敏度優于傳統試紙條檢測。

2、本發明試紙能夠實現可視化半定量檢測，優于傳統的膠體金免疫層析試紙條，方便快捷，通常20分鐘可進行信號讀取。

3、本發明的試紙的檢測結果可以通過磁性分析儀進行分析，檢測結果可靠且便攜，適合現場及時檢測，檢測信號穩定性好，便于長期保存。

附圖說明

圖1是本發明細胞因子免疫層析試紙的結構示意圖；

圖2是本發明測試試紙條的結構示意圖。

其中：1-樣品墊、2-結合墊、3-蛋白持留用膜、4-檢測線、5-質控線、6-吸收墊、7-底板、8-樣品區通孔、9-檢測區通孔、10-測試卡槽、11-試紙條蓋板。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的結構圖及具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

實施例1

一種細胞因子免疫層析試紙，依次包括樣品區、結合區、檢測區，如圖1所示，在樣品區，檢測液添加在樣品墊1上；在結合區樣品墊部分疊壓在結合墊2之上，結合墊表面涂布納米顆粒與目標細胞因子單克隆抗體的偶聯物，檢測液中的目標細胞因子與單克隆抗體特異性結合。

在檢測區結合墊部分疊壓在蛋白持留用膜3上，蛋白持留用膜先后間隔設有檢測線4和質控線5，檢測線包被有目標細胞因子的多克隆抗體，當檢測液中的目標細胞因子與所述多克隆抗體結合后，檢測線處顯色，目標細胞因子被檢出；質控線上包被與所述單克隆抗體特異性結合的二抗抗體，當檢測液中所述偶聯物的單克隆抗體抗體與二抗抗體結合，質控線處顯色，效驗檢測過程是否有效。

優選地，在檢測區下游還設有吸收區，在吸收區吸收墊6部分疊壓在蛋白持留用膜上，吸收墊用于控制檢測液流速、促進虹吸作用，及避免檢測液滯留在檢測區表面。

樣品墊和結合墊的材質為玻璃纖維、無紡布、聚酯膜或纖維素濾紙；吸收墊為濾紙或層析紙。樣品墊中還可以添加表面活性劑等改性劑。

優選地，納米顆粒可以為超順磁納米顆粒，超順磁納米顆粒的直徑為100-300nm，結合墊涂布濃度為10μl/cm-30μl/cm。蛋白持留用膜為硝酸纖維素膜、pvdf膜或尼龍膜，在本發明中對蛋白持留用膜的材質不作限定，能夠實現該功能的膜都可被使用。本發明的細胞因子為白細胞介素、干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、趨化因子或生長因子，或者其他生物小分子蛋白。

本發明利用超順磁納米顆粒偶聯單克隆抗體，簡化了操作步驟，提高檢測效力和檢測精度。

例如使用本發明磁性免疫層析試紙條進行il-6檢測，當待測樣品中含有il-6時，il-6蛋白先與結合墊上的超順磁顆粒-抗體偶聯物結合。隨著層析作用的進行，當進過檢測線t時，結合有偶聯物的il-6蛋白與檢測線上多抗結合并停留在t線上，未結合il-6的偶聯物則繼續流動，當流經質控線c時，偶聯物與c線上的二抗結合并停留在c線處。整個層析反應大約在30分鐘內完成，一般反應5分鐘后可在檢測線t和質控線c上出現肉眼清晰可見的棕色顯色條帶。檢測線和質控線顯色結果通過灰度處理進行目標細胞因子的半定量分析。或者通過磁性分析儀mar對檢測線和質控線的磁性進行定量分析。

實施例2

圖2是本發明測試試紙條的結構示意圖，如圖2所示，測試試紙條包括測試卡槽10、試紙條本體、試紙條蓋板11，試紙條本體由下至上依次為寬度相同、長度不同的底板條、蛋白持留用膜、結合墊、樣品墊和吸收墊，結合墊部分疊壓在蛋白持留用膜一端上部，樣品墊依次部分疊壓在結合墊延長端上部，吸收墊部分疊壓在蛋白持留用膜另一端上部；

試紙條本體置于測試卡槽內部，試紙條蓋板與測試卡嵌合將試紙條本體固定其中，在測試卡上設有樣品區通孔和檢測區通孔，樣品區通孔對應樣品墊位置；檢測區通孔對應蛋白持留用膜位置，在試紙條蓋板上檢測線和質控線的對應位置分別設有檢測線t和質控線標識c。

實施例3

il-6的檢測方法。

a.抗體的篩選：篩選商品化的il-6的單克隆抗體和多克隆抗體，且能夠配對進行elisa實驗的抗體。

b.超順磁顆粒-抗體偶聯物的活化：選用直徑為100-300nm的商品化超順磁納米顆粒，取1mg磁顆粒到1.5ml離心管中，用500ulmest(ph6.0，0.05％tween20)洗滌3次，磁分離后移除上清；加入新配置的100uledc(5mg/ml)和100ulnhs(5mg/ml)溶液到裝有磁顆粒的離心管中，并加入300ulpbst溶液；4℃活化8h或25℃活化30～60min或37℃活化4～5h，該期間保持磁顆粒的懸浮狀態；離心管置于磁分離架上磁分離，移除上清，加入500ulmest，將磁顆粒移到新的離心管中，并使用500ulmest洗滌3次，磁分離后移除上清；

c.超順磁納米顆粒與抗體共價偶聯：加入40ul(1mg/ml)的單克隆抗體到裝有磁顆粒的離心管中，并加入460ulpbst溶液，混勻磁顆粒和單克隆抗體；4℃偶聯8h或25℃偶聯4～5h或37℃偶聯3h，該期間保持磁顆粒的懸浮狀態；

d.超順磁納米顆粒-抗體偶聯物的封閉：偶聯結束后，將離心管置于磁分離架上分離，移除上清；加入500ulpbst(ph7.4，含1％bsa)重懸偶聯物；4℃封閉12～15h或25℃封閉1～2h或37℃封閉30min，該期間保持磁顆粒的懸浮狀態；

e.超順磁納米顆粒-抗體偶聯物的重懸：封閉結束后，將離心管置于磁分離架上分離，移除上清；使用500ulpbst洗滌3次，磁分離后移除上清；加入250ulpbst(ph7.4，含0.02％nan3，0.5％bsa)重懸。

f.將制備好的磁顆粒抗體偶聯物使用定量噴液裝置以10μl/cm-20μl/cm的量噴涂于結合墊上；

g.硝酸纖維素膜的包被：使用包被緩沖液將針對il-6表面蛋白的多克隆抗體以及羊抗小鼠igg稀釋到0.5-2mg/ml濃度，使用定量噴液裝置分別將二者以0.4-0.8cm的間隔噴印于硝酸纖維素膜上，晾干后于干燥處(濕度20％～40％)封存備用，保存溫度為4℃～25℃，避免陽光直射；

h.試紙條的組裝：在底板上依次相互交錯2mm地貼上包被有抗體的硝酸纖維素膜、磁顆粒結合墊、樣品墊、吸收墊、然后根據要求寬度切割即得到試紙條

i.檢測卡槽的組裝：將上述組裝好的試紙條放置于塑料檢測卡槽內，蓋上蓋板后緊壓，確保試紙條固定無偏斜，與干燥劑一并放入鋁箔袋中真空密封保存。

以上所述實施例僅表達了本發明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。