本發明涉及生物
技術領域：
，具體而言，涉及用于檢測結核感染t細胞的抗原、試劑盒及應用。
背景技術：
：結核病是主要經呼吸道傳播的、嚴重危害我國和全世界的重要傳染病之一。據世界衛生組織，全世界有17-20億的結核分枝桿菌感染者，每年至少200萬人死于本病(謝建平，結核分枝桿菌功能基因組研究的方法學，微生物通報.2001.28(5):92-97)。因此，準確篩檢感染者的方法在結核病的防治甚至最終的消滅中扮演極其重要的作用。現有的診斷技術對結核分枝桿菌感染者的診斷非常難。近幾十年來，臨床上采用結核菌素試驗(tst)來診斷結核分枝桿菌感染者。但tst活性成份是純蛋白衍生物(purifiedproteinderivativeoftubercμlin，ppd)，是結核分枝桿菌培養上清液的粗提物，含有200多種成分，與卡介苗(bacilluscalmette-guerin，bcg)接種和環境分枝桿菌感染存在交叉反應。tst檢測結果可被現在臨床廣泛使用的疫苗—卡介苗免疫所干擾[p.andersen，etal.lancet356(2000)1099-1104.]。從1921年及明卡介苗到現在為止，全世界已有35億人接種卡介苗。因此tst對感染者的診斷價值受到很大的影響，導致tst診斷的準確性較低，因此我們無法根據其結果判斷是否真正存在結核分枝桿菌感染。對結核病病人的診斷技術中，痰涂片抗酸染色或痰菌培養，培養困難，耗時較長；肺部x射線檢查肺部病理改變，也僅在具有典型的臨床癥狀后才能診斷；其他血清學診斷方法和分子診斷方法缺乏特異性，假陽性率較高。有關研究人員指出，不同診斷性檢查方法的敏感性和特異性如下：分枝桿菌培養(分別為73％和100％)；pcr(分別為42％和100％)；胸部x線(分別為67％～77％和66％～76％)；結核菌素試驗(分別為94％和20％)；血清學(分別為33％和87％)。由此可見，現有的分枝桿菌檢測方法的敏感性和特異性無法同時達到最優。結核分枝桿菌感染人體后，首先會被人體的免疫系統識別，激活機體的t細胞免疫應答，分泌產生γ干擾素(ifn-γ)，后者發揮抗結核感染作用。部分t細胞轉化為免疫記憶細胞，當再次與結核分枝桿菌相遇后，會再次分泌產生ifn-γ，發揮抗結核感染作用。抗原特異的ifn-γ產生量與機體是否感染或發病密切相關。因此，如果采用結核分枝桿菌特異的抗原在體外刺激感染者和患者的t細胞，可誘導這些t細胞產生高水平的結核分枝桿菌特異的ifn-γ，而非結核分枝桿菌感染者或非結核病患者產生的ifn-γ的量與未用抗原刺激產生的量相近，從而實現診斷的目的。由此可見，尋找并發現結核分枝桿菌特異性抗原，對發展新一代的診斷試劑具有重要價值和意義。1996年，stover等通過減數雜交的方法確定了bcg在體外傳代過程中丟失的域，定義為缺失區(regionofdifference，rd)，rd區域存在于結核分枝桿菌中，而在bcg和大多數環境分枝桿菌中缺失[程渝,李茂全.結核分枝桿菌的實驗室診斷進展.國外醫學臨床生物化學和檢驗學分冊.2002；23(6)：342-343.]。其中，rd1區域編碼的早期分抗原靶6kd(earlysecretingantigentarget6kd，esat-6)和培養濾液蛋白10kd(cμltufiltrateprotein10kd，cfp-10)是兩種小分子量分泌蛋白，它們是t細胞最主要的抗原之一，可以誘導較強的細胞免疫反應。對于兒童或者免疫低下樣本，有文獻報道，僅以esat-6和cfp-10或其多肽作為刺激原，其靈敏度約為73.5％-88.9％(孫琳，elispot檢測技術在兒童結核病診斷中的應用，標記免疫分析與臨床.2008.6:349-353；鐘華清，干擾素-γ釋放試驗在兒童結核感染中的應用價值，檢驗醫學.2016.3:176-179；李海，應用酶聯免疫斑點法快速診斷兒童結核分枝桿菌感染的研究，中國婦幼保健，2012.11:1703-1706)。對于一些特殊樣本，如兒童、免疫低下及新近感染樣本，esat-6和cfp-10多肽及衍生物試劑盒結核分枝桿菌樣本檢出依然不高，仍不能滿足臨床需求。技術實現要素：針對現有檢測方法對于一些特殊樣本，如兒童、免疫低下及新近感染結核分枝桿菌樣本的檢出不足，本發明的目的在于提供一種用于檢測結核分枝桿菌感染t細胞的抗原組合物，該抗原組合物協同esat-6和cfp-10多肽及衍生物共同作用，特異性刺激結核分枝桿菌感染的新鮮全血，能特異性的分泌ifn-γ，增加檢測靈敏度，有效提高檢出率，有效避免漏檢。一種用于檢測結核感染t細胞的抗原組合物，該抗原組合物包括esat-6、cfp-10和含有氨基酸序列如seqidno.1～seqidno.29中所示的任八條多肽或任八條以上的多肽組合。如上所述的的抗原組合物，優選地，所述的八條多肽或任八條以上的多肽組合采用與所述seqidno.1～seqidno.28中任一所示序列具有85％同源性的多肽，或采用esat-6-cfp-10替換所述esat-6、cfp-10。如上所述的的抗原組合物，優選地，所述esat-6的氨基酸序列如seqidno.29所示，所述cfp-10的氨基酸序列如seqidno.30所示，所述esat-6-cfp-10的氨基酸序列如seqidno.31所示。如上所述的抗原組合物，優選地，所述多肽是人工合成的或是天然分離的。一種用于檢測結核感染t細胞的試劑盒，包括如上所述的抗原組合物和檢測γ-干擾素的試劑。如上所述的試劑盒，優選地，所述檢測γ-干擾素的試劑包括酶聯免疫吸附試劑、化學發光法檢測試劑、免疫熒光檢測試劑。如上所述試劑盒的應用，用于檢測t細胞經過如上所述的抗原組合物刺激后分泌的細胞因子，所述細胞因子為γ-干擾素。如上所述試劑盒的應用，優選地，所述t細胞來源于外周血、腦脊液、胸水或腹水。如上所述試劑盒的應用，優選地，所述抗原組合物中所述esat-6和cfp-10或所述esat-6-cfp-10的終濃度各為4～200μg/ml，所述多肽的終濃度為40～1000μg/ml。如上所述試劑盒的應用，優選地，所述檢測γ-干擾素的試劑還包括用磷酸鹽緩沖液作陰性對照，其檢測結果記為n；用所述抗原組合物作為體外刺激物，其檢測結果記為t；用外源凝集素和牛血清白蛋白作陽性對照，其檢測結果記為p。如上所述試劑盒的應用，優選地，對于所述γ-干擾素的含量，檢測結果t-n≥0.15～0.5iu/ml，判斷感染結核分枝桿菌；檢測結果t-n＜0.15～0.5iu/ml，判斷未感染結核分枝桿菌。本發明提供的用于檢測結核t細胞的抗原及試劑盒，具有以下特點：(1)對于免疫低下樣本陽性檢出率高，靈敏度高。針對現有檢測方法對于一些特殊樣本，如兒童、免疫低下及新近感染樣本或潛伏感染者的檢出不足，本發明提供用于敏感性和特異性高的結核分枝桿菌感染的抗原多肽組合，該多肽組合合并esat-6和cfp-10，實現對結核病病人或早期感染者或潛伏感染者(未出現結核病病癥)的快速、特異的檢測，在阻斷結核病的傳播和流行，以及對結核病的控制具有重大意義。采用本發明的多肽組合結合esat-6和cfp-10進行新鮮全血樣本刺激，具有良好的診斷符合率。(2)檢測用時短，操作方便，診斷快速。與傳統結核分枝桿菌檢測相比，利用本發明提供的多肽組合物合并ifn-γ的特異性抗原蛋白檢測用時短，診斷快速。傳統結核分枝桿菌培養診斷需時間1-2月，tst檢測需要3天，本發明全部檢測時間在1-2天內可完成。(3)對結核分枝桿菌感染能進行早期檢測。由于結核分枝桿菌一旦感染人體，首先就被機體的免疫系統所識別，激活體液和細胞免疫應答，發病時間在感染后1-2個月，因此，利用本發明提供的多肽池合并全血ifn-γ的特異性抗原蛋白的細胞免疫學檢測方法即可快速做出診斷，診斷出樣本是否感染結核分枝感染。而現有的技術中，x光片診斷只有在感染者肺部出現明顯的病理改變后才可做出診斷，這通常需要很長的時間。抗原抗體檢測也只有在疾病癥狀處于活動期的情況下檢測，但環境中分枝桿菌廣泛存在，其與結核分枝桿菌的共同抗原，可干擾實驗的診斷結果。可見，本發明對結核分枝桿菌新近感染或免疫低下者的早期檢測有重要意義，對結核病的控制和消滅具有積極的意義。本發明還提供了一種用于結核分枝桿菌感染檢測的方法，實驗證明，本發明可直接利用外周血進行抗原刺激，無需分離外周血單個核細胞，實驗數據表明本發明用于結核分枝桿菌感染檢測具有較高的靈敏度和特異性，有效避免假陰性，且操作簡便，檢測成本較低，具有較高的臨床應用價值。具體實施方式本發明的檢測原理：機體感染結核分枝桿菌后，血液中所形成的“記憶性”t淋巴細胞，其會在再次接觸結核分枝桿菌的特異性抗原時，產生和分泌相應的細胞因子(γ-干擾素)。通過對γ-干擾素的定量檢測，可以判斷是否存在針對結核分枝桿菌特異性的t淋巴細胞免疫反應。根據這個原理，選取存在于結核分枝桿菌，但在卡介苗和大多數非結核分枝桿菌中普遍缺失的esat-6、cfp-10及特異性多肽，應用基因工程技術將esat-6和cfp-10融合表達，和特異性多肽片段共同成為檢測試劑盒中應用的結核分枝桿菌特異性刺激抗原，與新鮮采取的淋巴細胞充分混合后孵育，收集血漿，應用雙抗體夾心酶聯免疫法原理檢測淋巴細胞中γ-干擾素的濃度，計算樣品中γ-干擾素的濃度，從而判斷是否感染結核分枝桿菌。本發明提供的特異性多肽，合并esat-6和cfp-10組成試劑盒的特異性刺激部分，可以提高對一些特殊樣本，如兒童、免疫低下及新近感染樣本的檢出率。其中，t淋巴細胞來源于外周血、腦脊液、胸水或腹水，本發明以肝素抗凝的全血為例來說明本發明。以下結合實施例對本發明作進一步說明，但是本發明的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發明構思的改變或等同替代均包括在本發明的保護范圍之內。下列實施例中未特別說明的具體條件的實驗方法是按常規實驗方法；試驗試劑如無特別說明均為市售購買產品。以下所用的市售試劑盒為武漢海吉力生物科技有限公司的結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒(酶聯免疫法)，本發明所涉及的結核感染樣本為志愿者病例，其篩選標準為：根據衛生部發布的《肺結核診斷標準》國家標準(ws288-2008)，臨床表現癥狀、體征及胸部影像學檢查診斷為肺結核的患者，其中細菌學陽性或陰性結核病患者是指臨床診斷為結核病的患者中，經細菌學檢查(痰涂片抗酸染色顯微鏡檢查和/或羅氏固體培養基細菌固體培養)陽性或陰性的結核病患者；以及肺外結核(如骨結核、腎結核、腸結核、淋巴結核等)患者。健康樣本為健康志愿者，其篩選標準為：無結核臨床癥狀、無其他疾病或感染。實施例1多肽刺激有效性篩選為了實現本發明的目的，本發明篩選了致病結核分枝桿菌的特異性蛋白質如：rv3615、rv3873、rv3878、rv3879c、tb7.7，這些蛋白質中能針對淋巴細胞的結合位點的多肽，篩選的多肽均能特異性刺激結核分枝桿菌感染的病人新鮮全血特異性的分泌γ-干擾素(ifn-γ)。通過反復的臨床驗證實驗，這些多肽合并esat-6和cfp-10能提高檢測靈敏度，該合并刺激劑可特異性作用于結核分枝桿菌感染樣本的全血中的淋巴細胞表位，通過檢測全血中釋放的細胞因子ifn-γ，從而間接地反應機體是否感染過結核分枝桿菌。發明人通過大量試驗研究，最終獲得核苷酸序列如seqidno.1～seqidno.28所示的特異性多肽片段，任取其中的八種多肽與esat-6和cfp-10或esat-6-cfp-10結合使用，配制成刺激劑溶液，用于刺激新鮮全血，檢測刺激后全血中的γ-干擾素，可判斷全血是否感染結核分支桿菌。本發明的多肽片段，seqidno.1～seqidno.28，其氨基酸序列如下所示，這些多肽片段可通過人工合成的或是天然分離，本實施例及以下實施例中用的多肽是通過人工合成的，其中，seqidno.1～seqidno.7來自rv3615，seqidno.8～seqno.13來自rv3873，seqidno.14～seqidno.20來自rv3878，seqidno.21～seqidno.25來自rv3879c，seqidno.26～seqidno.28來自tb7.7。seqidno.1：algsslhtagvdlaseqidno.2：rlgvlashhdnaavseqidno.3：nvyltahnalgsslseqidno.4：ithgpycsqfndtlseqidno.5：shhdnaavdassgvseqidno.6：riaakiyseadeawrseqidno.7：nalgsslhtagvdlaseqidno.8：alaavvelgsfdaaseqidno.9：lmagagpapmlaaaseqidno.10：aaldaqaveltarlseqidno.11：lmsqliekpvapsvseqidno.12：slpeiaanhitqavseqidno.13：mqataqaaaytqamseqidno.14：klaglvfpqppapiseqidno.15：qqaaqsaqggsgpmseqidno.16：vqmsqnaspiaqtiseqidno.17：sqatqllstpvsqvseqidno.18：etmpsieslvsdglseqidno.19：aelaprvvatvpqlseqidno.20：yafgssgeglagvaseqidno.21：msitrptgsyarqmseqidno.22：lavqawaafhdmtlseqidno.23：slvtathganvslvseqidno.24：ylasadhaipvdeiseqidno.25：mlwfelmkpmtstaseqidno.26：llaaadelvggppvseqidno.27：alaartllaaadelseqidno.28：ravaeshgvaavlf。需要說明的是，與上述序列具有85％同源性的多肽均可實現本發明的目的。且用esat-6-cfp-10替換esat-6、cfp-10的檢測效果相同。本發明所用的esat-6序列為seqidno.29:mteqqwnfagieaaasaiqgnvtsihslldegkqsltklaaawggsgseayqgvqqkwdatatelnnalqnlartiseagqamastegnvtgmfa；cfp-10序列為seqidno.30:maemktdaatlaqeagnferisgdlktqidqvestagslqgqwrgaagtaaqaavvrfqeaankqkqeldeistnirqagvqysradeeqqqalssqmgf；esat-6-cfp-10序列為seqidno.31：mteqqwnfagieaaasaiqgnvtsihslldegkqsltklaaawggsgseayqgvqqkwdatatelnnalqnlartiseagqamastegnvtgmfanvamaemktdaatlaqeagnferisgdlktqidqvestagslqgqwrgaagtaaqaavvrfqeaankqkqeldeistnirqagvqysradeeqqqalssqmgf。實施例2檢測試劑盒制備用于檢測結核感染的t細胞的試劑盒，包括如上實施例1中所述的抗原組合物和檢測γ-干擾素的試劑，其中，檢測γ-干擾素的試劑包括酶聯免疫檢測試劑、化學發光法檢測試劑、免疫熒光檢測試劑。下面具體介紹這幾種試劑盒：一種體外釋放酶聯免疫法檢測機體是否感染結核分枝桿菌的檢測試劑盒，該試劑盒以實施例1中的esat-6和cfp-10或esat-6-cfp-10分別與實施例1中seqidno.1～seqidno.28中的特異性多肽為結核分枝桿菌特異性刺激抗原，(即esat-6和cfp-10與實施例1中seqidno.1～seqidno.28中的特異性多肽，或esat-6-cfp-10與實施例1中seqidno.1～seqidno.28中的特異性多肽作為結核分枝桿菌特異性刺激抗原)，與新鮮采取的肝素抗凝全血充分混合后孵育，收集血漿，應用雙抗體夾心酶聯免疫法原理檢測人血漿中γ-干擾素的濃度，計算樣品中γ-干擾素的濃度，從而判斷是否感染結核分枝桿菌，首先，采集全血，分裝于刺激培養管中(刺激部分(陰性對照培養管(n)、結核刺激培養管(t)、陽性對照培養管(p))，培養之后，用檢測部分檢測γ干擾素含量。其由以下成分組成:刺激部分包括：陰性對照培養管(n)：濃度為20mm的磷酸鹽緩沖液、結核刺激培養管(t)：終濃度為4～200μg/ml的esat-6和cfp-10或esat-6-cfp-10融合抗原分別與濃度為40～1000μg/ml的實施例1中所述的seqidno.1～seqidno.26任意八條多肽、陽性對照培養管(p)為濃度為0.5mg/ml～5mg/ml的外源凝集素，10％的牛血清白蛋白；檢測部分包被酶標板、γ-干擾素校準品、校準品稀釋液、酶標試劑、濃縮洗滌液、顯色劑a液、顯色劑b液和終止液，其中，酶標板包被有抗人γ-干擾素抗體、γ-干擾素校準品含有重組人γ-干擾素和牛血清白蛋白、校準品稀釋液為濃度為加有酪蛋白(鈉)的磷酸鹽緩沖、酶標試劑為辣根過氧化物標記的抗人γ-干擾素單克隆抗體和牛血清、濃縮洗滌液(20倍比)：為含有吐溫-20的磷酸鹽緩沖液、顯色劑a液為過氧化氫、顯色劑b液為四甲基聯苯胺鹽酸，終止液為10％硫酸。一種體外釋放化學發光法檢測機體是否感染結核分枝桿菌的試劑盒，本試劑盒以esat-6和cfp-10或esat-6-cfp-10分別與實施例1中的特異性多肽為結核分枝桿菌特異性刺激抗原，與新鮮采取的肝素抗凝全血充分混合后孵育，收集血漿，應用雙抗體夾心免疫法原理檢測人血漿中γ-干擾素的濃度，計算樣品中γ-干擾素的濃度，從而判斷是否感染結核分枝桿菌，首先采集全血，分裝于刺激培養管中(刺激部分(陰性對照培養管(n)、結核刺激培養管(t)、陽性對照培養管(p))，進行培養，之后用檢測部分檢測γ干擾素含量。其由以下成分組成：刺激部分：陰性對照培養管(n)中為濃度為20mm的磷酸鹽緩沖液、結核刺激培養管(t)為終濃度為4～200μg/ml的esat-6和cfp-10或esat-6-cfp-10融合抗原分別與濃度為40～1000μg/ml的實施例1中所述seqidno.1～seqidno.26任意八條多肽，和濃度為20mg/ml～100mg/ml的人血白蛋白、陽性對照培養管(p)為0.5mg/ml～5mg/ml的外源凝集素，10％的牛血清白蛋白；檢測部分包被發光板、γ-干擾素校準品、校準品稀釋液、酶標試劑、濃縮洗滌液、發光劑a液和發光劑b液，其中，發光板為可拆卸微孔板條發光板包被有抗人γ-干擾素抗體，γ-干擾素校準品為含有重組人γ-干擾素和牛血清白蛋白，校準品稀釋液為含有酪蛋白(鈉)的磷酸鹽緩沖液、酶標試劑為辣根過氧化物標記的抗人γ-干擾素單克隆抗體和牛血清、濃縮洗滌液(20倍)含有吐溫-20的磷酸鹽緩沖液、發光劑a液為過氧化脲和發光劑b液為魯米諾。一種體外釋放免疫熒光法檢測機體是否感染結核分枝桿菌的檢測試劑盒，本試劑盒以esat-6、cfp-10及特異性多肽為結核分枝桿菌特異性刺激抗原，與新鮮采取的肝素抗凝全血充分混合后孵育，收集血漿，應用雙抗體夾心免疫法原理檢測人血漿中γ-干擾素的濃度，計算樣品中γ-干擾素的濃度，從而判斷是否感染結核分枝桿菌，首先采集全血，分裝于刺激培養管中(刺激部分(陰性對照培養管(n)、結核刺激培養管(t)、陽性對照培養管(p))，培養之后用檢測部分檢測γ干擾素含量。其由以下成分組成：刺激部分(陰性對照培養管(n)：濃度為20mm的磷酸鹽緩沖液、結核刺激培養管(t)：終濃度為4～200μg/ml的esat-6和cfp-10或esat-6-cfp-10融合抗原分別與40～1000μg/ml的實施例1中seqidno.1～seqidno.28任意八條多肽、陽性對照培養管(p)為濃度為0.5mg/ml～5mg/ml的外源凝集素，10％的牛血清白蛋白)，檢測部分包括：測試卡、熒光免疫試劑、id芯片，其中，測試卡的t線包被有抗人γ-干擾素抗體，c線包被羊抗兔抗體，熒光免疫試劑為熒光微球標記的抗人γ-干擾素單克隆抗體，兔igg抗體，含有酪蛋白(鈉)的tris-hcl緩沖液保存。實施例3用本發明試劑盒對體外全血檢測的檢測方法采用實施例2中制備的試劑盒進行檢測，先進行體外全血刺激：在檢測前，要確保恒溫培養箱37℃，將陰性對照培養管(n)、結核刺激培養管(t)、陽性對照培養管(p)進行3000～5000轉/分鐘離心1分鐘，分別在3種培養管上做好標記，建議加上樣本編號或姓名。然后打開生物安全柜的紫外燈，照射15～20分鐘。1、采集：采用靜脈穿刺術，使用肝素鋰抗凝的真空采血管采集全血標本，采集量不低于4ml。2、分裝：將采集全血樣本的采血管顛倒混勻5～10次，按1ml/管順序分裝于“n”、“t”、“p”管中。3、培養：將培養管輕柔顛倒混勻5～10次，迅速放入37℃恒溫培養箱培養16～24小時，培養過程中保持培養管直立。4、離心：將培養后的培養管于3000～5000轉/分鐘離心2分鐘，取血漿于ep管中(注意不可吸到細胞層)，做好標記，為待檢血漿樣品，血漿可于4℃條件保存一周，-20℃可保存一年。采用三種檢測試劑盒時，刺激部分相同。下面分別介紹三種試劑盒檢測部分的使用：(一).體外釋放酶聯免疫法使用前，請將試劑盒平衡至室溫(約30分鐘)。將液體試劑輕輕振蕩混合，使用后立即密封，放回2～8℃保存。復溶后的γ-干擾素校準品稀釋為各濃度后可于2～8℃保存不超過1個月。1、標準曲線的準備γ-干擾素校準品工作液的配制：根據標簽上標示的體積，向裝有γ-干擾素校準品(凍干粉)的西林瓶中加入對應的校準品稀釋液，混勻，配制成80iu/ml的γ-干擾素校準品工作液。應注意：溶解不同批次γ-干擾素校準品所需加入校準品稀釋液的體積可能不同。取6個1.5mlep管，分別標記為sd1、sd2、sd3、sd4、sd5和sd6，sd1管中加入900μl校準品稀釋液(酶聯)，sd2～sd6每管加入300μl校準品稀釋液(酶聯)。取100μl的80iu/ml的干擾素校準品工作液(西林瓶中)，加入到900μl的sd1中，震蕩混勻，得到8iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd1，加入到300μl的sd2中，震蕩混勻，得到4iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd2，加入到300μl的sd3中，震蕩混勻，得到2iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd3，加入到300μl的sd4中，震蕩混勻，得到1iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd4，加入到300μl的sd5中，震蕩混勻，得到0.5iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd5，加入到300μl的sd6中，震蕩混勻，得到0.25iu/ml工作液。2、1×洗滌液的制備：將20ml的濃縮洗滌液(20倍)加入裝有380ml的純水的燒杯中，混勻，備用。3、加樣(1)標準曲線：各取50μl的sd1、sd2、sd3、sd4、sd5和sd6，按順序加入板孔中，平行做兩孔。(2)樣品：每孔加入50μl待檢血漿樣品，輕微震蕩混勻。注意：血漿樣品在溫育前需要混合均勻，以保證γ-干擾素在包被板孔內均勻分布。(3)每孔加入酶標試劑50μl。4、溫育：輕輕混合均勻，于37℃的恒溫培養箱中溫育2小時。5、洗滌：甩掉孔內的液體，每孔加入300μl的1×洗滌液洗滌，拍干，重復5次。6、顯色：每孔加入顯色劑a、b液各50μl，輕輕振蕩混勻；或者每孔加入100μl顯色劑混合液(顯色劑混合液臨用前配制，取等體積的顯色劑a液與顯色劑b液混合均勻)。7、溫育：于37℃的恒溫培養箱中避光溫育15分鐘。8、終止：每孔加入50μl終止液。(二).體外釋放化學發光法使用前，將試劑盒平衡至室溫(約30分鐘)。將液體試劑輕輕振蕩混合，使用后立即密封，放回2～8℃保存。未用完的微孔板條須蓋上封板膜與干燥劑一起用自封袋密封，試劑盒開封后于2～8℃保存不超過1月。復溶后的γ-干擾素校準品稀釋為各濃度后可于2～8℃保存不超過1個月。1、標準曲線的準備γ-干擾素校準品工作液的配制：根據標簽上標示的體積，向裝有γ-干擾素校準品(凍干粉)的西林瓶中加入校準品稀釋液(發光)，混勻，配制成80iu/ml的γ-干擾素校準品工作液。取6個1.5mlep管，分別標記為sd1、sd2、sd3、sd4、sd5和sd6，sd1管中加入900μl校準品稀釋液(發光)，sd2～sd6每管加入300μl校準品稀釋液(發光)。取100μl的80iu/ml的干擾素校準品工作液(西林瓶中)，加入到900μl的sd1中，震蕩混勻，得到8iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd1，加入到300μl的sd2中，震蕩混勻，得到4iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd2，加入到300μl的sd3中，震蕩混勻，得到2iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd3，加入到300μl的sd4中，震蕩混勻，得到1iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd4，加入到300μl的sd5中，震蕩混勻，得到0.5iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd5，加入到300μl的sd6中，震蕩混勻，得到0.25iu/ml工作液。2、1×洗滌液的制備：將20ml的濃縮洗滌液(20倍)加入裝有380ml的純水的燒杯中，混勻，備用。3、加樣(1)樣品：每孔加入50μl待檢血漿樣品，輕微震蕩混勻。注意：血漿樣品在溫育前需要混合均勻，以保證γ-干擾素在發光板孔內均勻分布。(2)標準曲線：各取50μl的sd1、sd2、sd3、sd4、sd5和sd6，按順序加入板孔中，平行做兩孔。空白對照1孔(加校準品稀釋液(發光)50μl)。(3)每孔加入酶標試劑50μl。4、溫育：輕輕混合均勻，于37℃的恒溫培養箱中溫育1小時。5、洗滌：甩掉孔內的液體，每孔加入300μl的1×洗滌液洗滌，使用洗板機洗滌6次，最后一次拍干。6、發光：每孔加入100μl發光劑混合液。7、溫育：避光于室溫或37℃的恒溫培養箱中反應5分鐘。8、測定：在10分鐘內用化學發光免疫分析儀讀取發光值(rlu)。(三).體外釋放免疫熒光法1、取出所需測試卡和熒光免疫試劑，將熒光免疫試劑10μl/管分裝到ep管中，平衡至室溫(約30分鐘)。2、檢查/插入id芯片到儀器中，讀取數據，確保試劑盒與id芯片批號相匹配。3、分別取每例樣本“n”、“t”、“p”血漿100μl，加入到分裝好的熒光免疫試劑中，做好標記，混合均勻，為待測樣本。4、取100μl混合均勻的待檢樣本加入到測試卡的加樣孔中，每個樣本需點三張測試卡，分別是“n”、“t”、“p”刺激血漿。5、測試卡于室溫水平放置25～30分鐘，將測試卡插入到熒光免疫分析儀的樣本卡槽中，按鍵開始掃描。確保測試卡方向正確并使其完全插入。6、從熒光免疫分析儀的顯示屏幕上讀取數據或者直接打印結果。對由結核感染樣本50例，其中65歲年齡及以上樣本20例，健康樣本20例，采集的全血樣本。采用本發明的試劑盒與市售試劑盒進行檢測。市售試劑盒為武漢海吉力生物科技有限公司的結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒(酶聯免疫法)。其中結核刺激培養管中采用分別用刺激劑1(esat-6和cfp-10濃度各為10μg/ml，混合8條多肽(seqidno.13～seqidno.20，各100μg/ml)、刺激劑2(esat-6和cfp-10濃度各為3μg/ml，混合8條多肽(seqidno.13～seqidno.20，濃度各為100μg/ml)、市售試劑盒刺激劑分別與全血樣本混合均勻后于37℃烘箱20±4小時，6000rpm離心1min，取上清分別用上述檢測方法進行。根據統計學軟件選擇刺激劑1的陽性判斷值：當檢測結果t-n≥0.25iu/ml，可判斷感染結核分枝桿菌，檢測結果t-n＜0.25iu/ml，可判斷未感染結核分枝桿菌根據統計學軟件選擇刺激劑2的陽性判斷值：當檢測結果t-n≥0.5iu/ml，可判斷是感染結核分枝桿菌，檢測結果t-n＜0.5iu/ml，可判斷未感染結核分枝桿菌。對50例陽性樣本和20例健康的未感染的陰性樣本的檢測結果如表1、2、3所示。表1.體外釋放酶聯免疫法檢測結果統計刺激劑1刺激劑2市售試劑盒陽性樣本48/50(96％)48/50(96％)45/50(90％)陰性樣本20/20(100％)20/20(100％)20/20(100％)表2.體外釋放化學發光法檢測結果統計刺激劑1刺激劑2市售試劑盒陽性樣本48/50(96％)48/50(96％)45/50(90％)陰性樣本20/20(100％)20/20(100％)20/20(100％)表3.體外釋放免疫熒光法檢測結果統計刺激劑1刺激劑2市售試劑盒陽性樣本49/50(98％)49/50(98％)45/50(90％)陰性樣本20/20(100％)20/20(100％)20/20(100％)檢測結果說明本發明制備的試劑盒，隨esat-6和cfp-10刺激劑濃度的增加，其t刺激值會有所增加，因此結果判斷值有一定的變化，故參考值會存在一定范圍，所以，檢測結果t-n≥0.15～0.5iu/ml，判斷為感染結核分枝桿菌；檢測結果t-n＜0.15～0.5iu/ml，判斷為未感染結核分枝桿菌。本發明制備的試劑盒靈敏度比現有技術的檢測市售試劑盒的靈敏度高。實施例4特異性多肽合并esat-6和cfp-10刺激效果對實施例1中多肽的不同組合進行檢測，均獲得較好的檢測效果，下面例舉對實施例1中的多肽不同組合檢測的幾種情況，來說明檢測效果。配制結核刺激劑3～6(下面濃度均為終濃度):結核刺激劑3配方為esat-6和cfp-10各10μg/ml，多肽seqidno.1～8各100μg/ml；結核刺激劑4配方為esat-6和cfp-10各10μg/ml，多肽seqidno.8～15各100μg/ml；結核刺激劑5配方為esat-6和cfp-10各10μg/ml，多肽seqidno.13～20各100μg/ml；結核刺激劑6配方為esat-6和cfp-10各10μg/ml，多肽seqidno.21～28各100μg/ml。取20例樣本，結核感染樣本10例，健康樣本10例，其中年齡65歲以上15例，男14例，女6例，采用上配方配置的結核刺激劑1～4，進行實施例3中所述方法的檢測。同時對20例樣本，采用市售試劑盒進行檢測，檢測結果如表4、5、6所示。市售試劑盒為武漢海吉力生物科技有限公司的結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒(酶聯免疫法)。表4.特異性多肽合并esat-6和cfp-10酶聯免疫法檢測結果表5.特異性多肽合并esat-6和cfp-10化學發光法檢測結果表6.特異性多肽合并esat-6和cfp-10免疫熒光法檢測結果刺激劑3刺激劑4刺激劑5刺激劑6市售試劑盒10陽性樣本檢出例數991010810陰性樣本檢出例數1010101010檢測結果說明本發明的檢測方法及試劑盒，靈敏度比現有技術的檢測市售試劑盒的靈敏度高。實施例5特異性多肽合并esat-6-cfp-10刺激效果本實施例中采用的是esat-6-cfp-10和特異性多肽seqidno.1～28中任8條及以上的組合，來說明檢測效果。具體地:配制結核刺激劑7～10(下面的濃度為終濃度):結核刺激劑7配方為esat-6-cfp-10，10μg/ml，多肽seqidno.1～8各100μg/ml；結核刺激劑8配方為esat-6-cfp-10，10μg/ml，多肽seqidno.8～15各100μg/ml；結核刺激劑9配方為esat-6-cfp-10，10μg/ml，多肽seqidno.13～20各100μg/ml；結核刺激劑10配方為esat-6-cfp-10，10μg/ml，多肽seqidno.21～28各100μg/ml。取20例樣本，結核感染樣本10例，健康樣本10例，其中年齡65歲以上10例，男11例，女9例，采用上配方配置的結核刺激劑7-10，進行實施例3中所述方法的檢測。同時對上述20例樣本，采用市售試劑盒進行檢測，檢測結果如表7、8、9所示。用已上市的γ干擾素檢測試劑盒(酶聯免疫法)檢測做對照(市售試劑盒為武漢海吉力生物科技有限公司的結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒(酶聯免疫法)。表7.混合多肽合并esat-6-cfp-10酶聯免疫法檢測結果表8.混合多肽合并esat-6-cfp-10化學發光法檢測結果刺激劑7刺激劑8刺激劑9刺激劑10市售試劑盒10陽性樣本檢出例數10999810陰性樣本檢出例數1010101010表9.混合多肽合并esat-6-cfp-10免疫熒光法檢測結果檢測結果說明本發明的檢測方法及試劑盒，靈敏度比現有技術的檢測市售試劑盒的靈敏度高。實施例6合并混合多肽檢測靈敏度和特異性樣本：結核感染樣本20例，結核陰性樣本20例。采集全血樣本，分別用刺激劑11(esat-6(10μg/ml)和cfp-10(10μg/ml)+混合多肽(seqidno.13～seqidno.20，各5μg/ml))、刺激劑12(esat-6-cfp-10(10μg/ml)+混合多肽(seqidno.13～seqidno.20，各5μg/ml))、刺激劑13(esat-6(10μg/ml)和cfp-10(10μg/ml))、刺激劑14(esat-6-cfp-10(10μg/ml))和刺激劑15(市售試劑盒：武漢海吉力生物科技有限公司的結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒(酶聯免疫法))各20μl于無菌培養管中，每管加入1ml新鮮采集全血刺激，刺激，按實施例3中所述的方法進行檢測，市售試劑盒(酶聯免疫法)按其說明書進行操作。檢測結果見表10、11、12。表10.合并混合多肽靈敏度和特異性酶聯免疫法檢測結果表11.合并混合多肽靈敏度和特異性化學發光法檢測結果表12.合并混合多肽靈敏度和特異性免疫熒光法檢測結果檢測結果說明本發明制備的試劑盒用于檢測結核分枝桿菌感染的全血，其檢測靈敏度可達95％，靈敏度和特異性較強，有效避免現有技術檢測的假陰性和漏檢。實施例7試劑盒靈敏度和特異性檢測樣本：結核感染樣本100例，其中65歲年齡及以上樣本34例，6歲以下年齡樣本數18例，hiv樣本40例，男55例，女45例。結核陰性樣本50例，其中65歲年齡及以上樣本19例，6歲以下年齡樣本數9例，hiv樣本22例，男30例，女20例。采集全血樣本，分別用刺激劑(esat-6和cfp-10+混合多肽(seqidno.16～seqidno.23，各100μg/ml))、市售試劑盒刺激，混合均勻后于37℃烘箱20±4小時，混合血液后，6000rpm離心1min，取上清分別用實施例2制備的體外釋放酶聯免疫法的檢測試劑盒、體外釋放化學發光法的檢測試劑盒)和體外釋放免疫熒光法的檢測試劑盒按照實施例3中的方法進行檢測，市售試劑盒按其說明書進行操作。檢測結果見表13～18。表13.結核感染樣本酶聯免疫法檢測結果表14.健康樣本酶聯免疫法檢測結果統計表15.結核感染樣本化學發光法檢測結果統計表16健康樣本化學發光法檢測結果統計表17結核感染樣本免疫熒光法檢測結果統計表18健康樣本免疫熒光法檢測結果統計上述結果表明本發明的試劑盒對兒童、免疫低下及新近感染結核分枝桿菌樣本的檢出率較高，靈敏度和特異性較強，有效避免現有技術檢測的假陰性和漏檢。本發明對結核分枝桿菌新近感染或免疫低下者的早期檢測有重要意義，對結核病的控制和消滅具有積極的意義。sequencelisting<110>武漢海吉力生物科技有限公司<120>用于檢測結核感染t細胞的抗原、試劑盒及應用<130><160>31<170>patentinversion3.5<210>1<211>14<212>prt<213>人工合成<400>1alaleuglyserserleuhisthralaglyvalaspleuala1510<210>2<211>14<212>prt<213>人工合成<400>2argleuglyvalleualaserhishisaspasnalaalaval1510<210>3<211>14<212>prt<213>人工合成<400>3asnvaltyrleuthralahisasnalaleuglyserserleu1510<210>4<211>14<212>prt<213>人工合成<400>4ilethrhisglyprotyrcysserglnpheasnaspthrleu1510<210>5<211>14<212>prt<213>人工合成<400>5serhishisaspasnalaalavalaspalaserserglyval1510<210>6<211>15<212>prt<213>人工合成<400>6argilealaalalysiletyrserglualaaspglualatrparg151015<210>7<211>15<212>prt<213>人工合成<400>7asnalaleuglyserserleuhisthralaglyvalaspleuala151015<210>8<211>14<212>prt<213>人工合成<400>8alaleualaalavalvalgluleuglyserpheaspalaala1510<210>9<211>14<212>prt<213>人工合成<400>9leumetalaglyalaglyproalaprometleualaalaala1510<210>10<211>14<212>prt<213>人工合成<400>10alaalaleuaspalaglnalavalgluleuthralaargleu1510<210>11<211>14<212>prt<213>人工合成<400>11leumetserglnleuileglulysprovalalaproserval1510<210>12<211>14<212>prt<213>人工合成<400>12serleuprogluilealaalaasnhisilethrglnalaval1510<210>13<211>14<212>prt<213>人工合成<400>13metglnalathralaglnalaalaalatyrthrglnalamet1510<210>14<211>14<212>prt<213>人工合成<400>14lysleualaglyleuvalpheproglnproproalaproile1510<210>15<211>14<212>prt<213>人工合成<400>15glnglnalaalaglnseralaglnglyglyserglypromet1510<210>16<211>14<212>prt<213>人工合成<400>16valglnmetserglnasnalaserproilealaglnthrile1510<210>17<211>14<212>prt<213>人工合成<400>17serglnalathrglnleuleuserthrprovalserglnval1510<210>18<211>14<212>prt<213>人工合成<400>18gluthrmetproserilegluserleuvalseraspglyleu1510<210>19<211>14<212>prt<213>人工合成<400>19alagluleualaproargvalvalalathrvalproglnleu1510<210>20<211>14<212>prt<213>人工合成<400>20tyralapheglyserserglygluglyleualaglyvalala1510<210>21<211>14<212>prt<213>人工合成<400>21metserilethrargprothrglysertyralaargglnmet1510<210>22<211>14<212>prt<213>人工合成<400>22leualavalglnalatrpalaalaphehisaspmetthrleu1510<210>23<211>14<212>prt<213>人工合成<400>23serleuvalthralathrhisglyalaasnvalserleuval1510<210>24<211>14<212>prt<213>人工合成<400>24tyrleualaseralaasphisalaileprovalaspgluile1510<210>25<211>14<212>prt<213>人工合成<400>25metleutrpphegluleumetlysprometthrserthrala1510<210>26<211>14<212>prt<213>人工合成<400>26leuleualaalaalaaspgluleuvalglyglyproproval1510<210>27<211>14<212>prt<213>人工合成<400>27alaleualaalaargthrleuleualaalaalaaspgluleu1510<210>28<211>14<212>prt<213>人工合成<400>28argalavalalagluserhisglyvalalaalavalleuphe1510<210>29<211>95<212>prt<213>esat-6<400>29metthrgluglnglntrpasnphealaglyileglualaalaalaser151015alaileglnglyasnvalthrserilehisserleuleuaspglugly202530lysglnserleuthrlysleualaalaalatrpglyglyserglyser354045glualatyrglnglyvalglnglnlystrpaspalathralathrglu505560leuasnasnalaleuglnasnleualaargthrileserglualagly65707580glnalametalaserthrgluglyasnvalthrglymetpheala859095<210>30<211>100<212>prt<213>cfp-10<400>30metalaglumetlysthraspalaalathrleualaglnglualagly151015asnphegluargileserglyaspleulysthrglnileaspglnval202530gluserthralaglyserleuglnglyglntrpargglyalaalagly354045thralaalaglnalaalavalvalargpheglnglualaalaasnlys505560glnlysglngluleuaspgluileserthrasnileargglnalagly65707580valglntyrserargalaaspglugluglnglnglnalaleuserser859095glnmetglyphe100<210>31<211>198<212>prt<213>esat-6-cfp-10<400>31metthrgluglnglntrpasnphealaglyileglualaalaalaser151015alaileglnglyasnvalthrserilehisserleuleuaspglugly202530lysglnserleuthrlysleualaalaalatrpglyglyserglyser354045glualatyrglnglyvalglnglnlystrpaspalathralathrglu505560leuasnasnalaleuglnasnleualaargthrileserglualagly65707580glnalametalaserthrgluglyasnvalthrglymetphealaasn859095valalametalaglumetlysthraspalaalathrleualaglnglu100105110alaglyasnphegluargileserglyaspleulysthrglnileasp115120125glnvalgluserthralaglyserleuglnglyglntrpargglyala130135140alaglythralaalaglnalaalavalvalargpheglnglualaala145150155160asnlysglnlysglngluleuaspgluileserthrasnilearggln165170175alaglyvalglntyrserargalaaspglugluglnglnglnalaleu180185190serserglnmetglyphe195當前第1頁12