一種用于檢測識別樣品中鼠傷寒沙門氏耐藥菌與非耐藥菌的表面增強拉曼光譜方法與流程

本發明涉及一種用于檢測識別樣品中鼠傷寒沙門氏耐藥菌與非耐藥菌的表面增強拉曼光譜方法，屬于衛生健康與食品安全檢測領域。

背景技術：

在細菌性食物中毒臨床病例中，沙門氏菌引起的食物中毒常居榜首，是引起急性胃腸炎的主要病原菌之一，其可導致人畜共患病，臨床上病發率正逐年上升。鼠傷寒沙門氏菌是一群非適應性或泛嗜性的沙門氏菌，具有廣泛的宿主，是目前世界各國分離率最高的菌型之一。鼠傷寒沙門氏菌是引起小兒腸道感染最常見的致病血清，而抗菌藥物是治療鼠傷寒沙門氏菌引起腸道感染必不可少的手段。但是不少沙門氏菌已對多種抗生素產生耐藥性，并出現多重耐藥性，尤其是鼠傷寒沙門氏菌。頭孢菌素類抗生素是臨床上應用廣泛的一類抗生物，第三代頭孢菌素有著獨特的藥效學和較低的耐藥率，因而是用于治療沙門氏菌侵襲性感染和嚴重腹瀉最常用的藥物。對鼠傷寒沙門氏菌的抑制作用原理是通過與細菌內膜上青霉素結合蛋白PBPs相結合，抑制轉肽酶在細胞壁合成的最后一步交叉連接中的轉肽作用，使交叉連接不能形成，影響細胞壁合成，導致細菌溶菌死亡。而耐頭孢菌素鼠傷寒沙門氏菌的出現及數量的增加已引起全世界的關注，因該菌極易產生耐藥性，使抗菌藥物療效較差，病程遷延不愈，成為臨床治療的難點。

近年來，由于各種抗菌藥物的廣泛應用，導致出現許多新型耐藥菌株。某些重癥感染者會因抗菌藥物劑量不足延誤治療時機，或盲目的大劑量治療造成藥物中毒。在致病菌檢驗方面，正確、快速的報告病原菌和耐藥菌成為治療環節中的重中之重。

技術實現要素：

鑒于背景技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種用于檢測識別樣品中鼠傷寒沙門氏耐藥菌與非耐藥菌的表面增強拉曼光譜方法，其能解決檢測過程繁瑣、耗時長等問題。

為了達到上述目的，本發明提供一種用于檢測識別樣品中鼠傷寒沙門氏耐藥菌與非耐藥菌的表面增強拉曼光譜方法，所述樣品為食品樣品或臨床樣品中，包括以下步驟：(Ⅰ)采用鼠傷寒沙門氏耐藥菌與非耐藥菌制作參考拉曼增強光譜，包括利用拉曼光譜儀掃上述致病菌，以得到拉曼增強光譜；(Ⅱ)利用拉曼光譜儀掃待檢測的樣品，以得到樣品的拉曼增強光譜；(III)將樣品的拉曼增強光譜與參考拉曼增強光譜進行比對，即根據拉曼光譜的特征峰峰位與強度進行定性識別，或者對樣品的拉曼增強光譜與參考拉曼增強光譜中的950～1300cm^-1波段進行主成分-線性判別分析(PCA-LDA)，實現對鼠傷寒沙門氏耐藥菌與非耐藥菌的鑒別；所述鼠傷寒沙門氏非耐藥菌的特征譜峰為663cm^-1、780cm^-1、875cm^-1、958cm^-1、990cm^-1、1062cm^-1、1164cm^-1和1252cm^-1；所述鼠傷寒沙門氏耐藥菌的特征譜峰為663cm^-1、825cm^-1、920cm^-1、958cm^-1、990cm^-1、1062cm^-1、1210cm^-1和1252cm^-1。

在根據本發明所述的一種用于檢測識別樣品中鼠傷寒沙門氏耐藥菌與非耐藥菌的表面增強拉曼光譜方法，在步驟(I)之前，還包括鼠傷寒沙門氏耐藥菌與非耐藥菌菌懸液的制備。

在根據本發明所述的一種用于檢測識別樣品中鼠傷寒沙門氏耐藥菌與非耐藥菌的表面增強拉曼光譜方法，所述制備包括合成拉曼增強試劑、制備細菌培養基以及配置所述菌懸液。

在根據本發明所述的一種用于檢測識別樣品中鼠傷寒沙門氏耐藥菌與非耐藥菌的表面增強拉曼光譜方法，主成分分析采用的軟件為SPSS。

在根據本發明所述的一種用于檢測識別樣品中鼠傷寒沙門氏耐藥菌與非耐藥菌的表面增強拉曼光譜方法，拉曼光譜儀的掃描參數：激光功率為200-250mw，激發光波長為785nm，掃描光譜范圍為400～1800cm^-1，積分時間為5-20s，分辨率為4cm^-1。

合成拉曼增強試劑的具體操作過程為：取10mL氯金酸溶液至圓底燒瓶中，加熱攪拌至溶液微沸，然后加入1mL濃度為2％的檸檬酸三鈉溶液，繼續保持微沸3min，最后將圓底燒瓶冷卻，得到檢測用納米金溶膠顆粒。

制備細菌培養基的具體步驟：稱取4.3mg的營養肉湯培養基于三角瓶中，加入100ml純凈水后加熱溶解至溶液澄清，降溫后調節pH值至7.0-7.4，在0.103Mpa，121℃中滅菌15-20min。

制備細菌待測液的過程：將甘油保藏的鼠傷寒沙門氏非耐藥菌與耐藥菌菌株融化并分別接種于培養基中，37℃，100rpm/min震蕩培養3-7hrs，取1ml菌液于離心管中，4℃7000rpm/min離心5min，去除上清液加入1ml無菌生理鹽水懸浮后再次離心洗滌；以上操作重復三次，得到細菌待測液。

制作拉曼光譜過程：取所述納米金溶膠與所述某一細菌待測液按照(1-5):1混勻后，取100μl置于樣品池中，用于拉曼光譜檢測。

本發明的有益效果：

與目前的各種致病菌的檢測技術相比，表面增強拉曼光譜技術具有樣本制備簡單、高靈敏度、檢測速度快的優點；拉曼圖譜直觀地顯示耐藥菌與非耐藥菌的特征差異，實現了耐藥菌與非耐藥菌的分類，對于臨床檢測細菌耐藥性具有實際應用價值。

附圖說明

圖1為鼠傷寒沙門氏耐藥菌與非耐藥菌的SERS譜圖；

圖2為兩種致病菌三個PC得分因子的三維散點圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案以及優點更清楚、明確，以下將結合具體實施例，對本發明進一步詳細說明。

制作鼠傷寒沙門氏耐藥菌與非耐藥菌的拉曼圖譜的過程：

拉曼增強試劑的合成：吸取10mL氯金酸溶液至圓底燒瓶中，利用恒溫加熱磁力攪拌器加熱攪拌至溶液微沸，然后加入1mL濃度為2％的檸檬酸三鈉溶液，繼續保持微沸3min，最后將圓底燒瓶置于冰水浴中攪拌冷卻，呈酒紅色，得到檢測用納米金溶膠顆粒。

培養基的配置：稱取4.3mg的營養肉湯培養基于三角瓶中，加入100ml純凈水后加熱溶解至溶液澄清，降溫后調節pH值至7.2±0.2，0.103Mpa，121℃滅菌15-20min，備用。

細菌樣品的制備：將甘油保藏的鼠傷寒沙門氏菌耐藥菌與非耐藥菌用接種環粘取接種于NB培養基中，37℃，100rpm/min震蕩培養2-8hrs，取1ml菌液于離心管中，4℃7000rpm/min離心5min，去除上清液加入1ml無菌生理鹽水懸浮后再次離心洗滌。以上操作重復三次，得到待測菌懸液。

采集拉曼光譜圖：采用便攜式表面增強拉曼光譜儀進行檢測，激光功率為200-250mw，激發光波長為785nm，掃描光譜范圍為400～1800cm^-1，積分時間為5-20s，分辨率為4cm^-1，每個樣品重復掃描3次后取平均圖譜。取納米金溶膠與樣品按照(1-5)：1混勻后，立即檢測，收集拉曼光譜圖。

數據處理方法：本發明可采用由SPSS公司開發的SPSS軟件對拉曼光譜圖數據通過主成分-判別分析，從而進行鼠傷寒沙門氏耐藥菌與非耐藥菌的鑒別。

在用統計分析方法研究多變量的課題時，變量個數太多就會增加課題的復雜性。人們自然希望變量個數較少而得到的信息較多。在很多情形，變量之間是有一定的相關關系的，當兩個變量之間有一定相關關系時，可以解釋為這兩個變量反映此課題的信息有一定的重疊。主成分分析是對于原先提出的所有變量，將重復的變量(關系緊密的變量)刪去多余，建立盡可能少的新變量，使得這些新變量是兩兩不相關的，而且這些新變量在反映課題的信息方面盡可能保持原有的信息；即設法將原來變量重新組合成一組新的互相無關的幾個綜合變量，同時根據實際需要從中可以取出幾個較少的綜合變量盡可能多地反映原來變量的信息的統計方法叫做主成分分析或稱主分量分析，也是數學上用來降維的一種方法，即將相關比較密切的幾個變量歸在同一類中，每一類變量就成為一個因子，以較少的幾個因子反映原資料的大部分信息。

取鼠傷寒沙門氏非耐藥菌和耐藥菌的凍存菌種接種至培養基TSB離心管中活化，在30-37℃活化至少24h，待TSB渾濁，LB固體培養基平板上劃線接種，37℃培養24h～48h形成分散的菌落，用無菌接種環挑取單一菌落至裝有0.1ml無菌生理鹽水懸浮后，得到待測菌懸液。取制備的金納米溶膠500μL與100μL菌懸液混合，采用便攜式表面增強拉曼光譜儀進行檢測，激光功率為200-250mw，激發光波長為785nm，掃描光譜范圍為400～1800cm^-1，積分時間為5-20s，分辨率為4cm^-1，收集拉曼光譜圖，見圖1，其中曲線1表示鼠傷寒沙門氏非耐藥菌；曲線2表示鼠傷寒沙門氏耐藥菌；二者的差譜圖(曲線3)用點狀線表示。

鼠傷寒沙門氏耐藥菌與非耐藥菌的判別：根據耐藥菌與非耐藥菌的指紋圖譜差異進行定性識別；鼠傷寒沙門氏菌耐藥菌與非耐藥菌的指紋圖譜在600-1600cm^-1波段存在差異；鼠傷寒沙門氏非耐藥菌的特征譜峰為663cm^-1、732cm^-1、780cm^-1、825cm^-1、875cm^-1、920cm^-1、958cm^-1、990cm^-1、1015cm^-1、1062cm^-1、1164cm^-1、1210cm^-1、1252cm^-1；鼠傷寒沙門氏耐藥菌的特征譜峰為663cm^-1、732cm^-1、780cm^-1、825cm^-1、875cm^-1、920cm^-1、958cm^-1、990cm^-1、1015cm^-1、1062cm^-1、1210cm^-1、1252cm^-1；二者在950-1300cm^-1波段存在顯著差異，根據特征峰663cm^-1、958cm^-1、990cm^-1、1062cm^-1、1164cm^-1和1252cm^-1的峰強度變化可以進行耐藥菌和非耐藥菌的檢測與識別。

二者在以下波數上存在差異，663cm^-1(歸屬于鳥嘌呤)、958cm^-1、990cm^-1(苯丙氨酸或葡萄糖的分子震動相關)、1062cm^-1(歸屬于DNA骨架振動)、1164cm^-1(歸屬于蛋白質、類胡蘿卜素的C-C或C-N鍵伸長)、1252cm^-1(歸屬于蛋白質或磷脂類)為主要變化峰位。其中與蛋白質結構振動相關的波段1150～1293cm^-1，非耐藥菌及耐藥菌的峰強差異顯著。從兩者平均譜圖的差譜來看，也更加清晰地指出在950～1300cm^-1波數范圍內的差異顯著，可以用于區分鼠傷寒沙門氏非耐藥菌及耐藥菌。

選取950-1300cm^-1波數范圍，對鼠傷寒沙門氏非耐藥菌及耐藥菌建立主成份回歸模型，在此基礎上進行線性判別分析。

選取主成份分析貢獻率大于85％的PC1、PC2和PC3，作散點圖和判別分析，繪制基于PCA降維拉曼數據后的三維圖像清晰顯示，鼠傷寒沙門氏非耐藥菌和耐藥菌分別集中在兩個區域(置信橢圓范圍為95％)，見圖2，其中1代表鼠傷寒沙門氏非耐藥菌，2代表鼠傷寒沙門氏耐藥菌。該方法的靈敏度、特異性均達到95％以上(見表1)。說明該方法具有較好的預測能力，可以用于區分鼠傷寒沙門氏非耐藥菌及耐藥菌。

表1鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028和耐藥菌的PCA-LDA結果

本發明建立了鼠傷寒沙門氏菌耐藥菌與非耐藥菌的SERS檢測技術及拉曼表型譜庫，通過比較二者的SERS圖譜的特征峰，并結合950～1300cm^-1波數范圍內的主成分判別分析(PCA-LDA)，可以簡單、快速的檢測與判別鼠傷寒沙門氏菌耐藥菌及非耐藥菌。