用于檢測血清中血管內皮生長因子的抗體及試劑盒的制作方法

本發明涉及血清抗原檢測技術，具體涉及一種用于檢測血清中血管內皮生長因子的抗體及試劑盒。

背景技術：

癌癥在全球的發病率呈上升趨勢。2014年2月3日，世界衛生組織發表的《全球癌癥報告2014》顯示，中國新增癌癥病例高居世界第一位，其中肝癌的新增病例和死亡人數均居世界首位。肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是全球最常見的惡性腫瘤之一，我國是乙肝大國，肝癌發病率占全球總數的55％。臨床上肝癌的診斷主要是通過血清檢測甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,afp)，b超發現肝臟結節，然后ct和mri檢查。然而afp陽性率約60～70％，并非所有肝細胞癌都分泌大量的afp，約40％早期原發性肝癌及15％～20％晚期原發性肝癌患者的血清afp水平是正常的，故僅靠afp診斷肝癌尚有漏診的可能，導致臨床80％患者確診時已屬中晚期。中晚期肝癌基本無有效治療方法，對乙肝、肝硬化等高危人群進行肝癌腫瘤標志物的篩查和早期診斷是解決肝癌高死亡率的最有效措施。

血管內皮生長因子(vegf)，也稱血管通透性因子或促血管素，最初是由多種培養的腫瘤細胞系中發現的一種新型的生長因子，該因子特異性地作用于血管內皮細胞并促進血管內皮細胞的增殖。大量研究結果表明，許多腫瘤組織都有vegf的較高表達，在腫瘤病人血清中也可檢測到vegf。肝癌患者血清中vegf的表達水平顯著高于良性肝病患者和健康人，且vegf含量與tnm分期呈正相關，術前檢測vegf水平對預測肝癌的侵襲、轉移有重要意義。鑒于vegf可在肝癌出現前顯著升高，且其分布狀態隨肝癌發展而顯著改變，因此vegf也是早期預測肝癌的一項重要指標，但需要與其他標志物共同使用。

luminex懸浮芯片技術是美國luminex公司在20世紀90年代中期開發的一種多功能的液相芯片分析平臺，也稱為液體芯片。它有機地整合了有色微球、激光技術、最新的高速數字信號處理和計算機技術，應用的熒光編碼微球帶有針對不同目標分子的特異性抗體，不同的微球可以自由組合，可以在一個25-50微升的樣品內同時檢測最多達100種不同的檢測項目，具有重復性與穩定性好、高通量、檢測指標可靈活選擇，以及高靈敏度和高信噪比等諸多優點，適用于血漿中抗原類蛋白的分析以及重大疾病抗原標志物的定量分析，是一項具有重大意義的醫學輔助檢測手段。與傳統的固相芯片相比，克服了固相芯片在大分子檢測時受表面張力、空間效應等對反應動力學的干擾，使檢測結果的穩定性和重復性得到很大的提高。

因此，獲得vegf特異性抗體，利用luminex懸浮芯片技術對血清中vegf含量進行檢測，將有助于提高早期肝癌的檢出率。

技術實現要素：

為了提高早期肝癌的檢出率，本發明提供用于檢測血清中血管內皮生長因子的抗體及試劑盒，其特異性強、靈敏度高，能夠準確檢測出血清中血管內皮生長因子的含量。

請求保護的技術方案如下：

用于制備抗血管內皮生長因子的抗體的抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seqidno.5所示。

編碼權利要求所述抗原蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如seqidno.6所示。

用于檢測待測血清中肝癌標志物血管內皮生長因子的單克隆抗體，其特征在于，由保藏編號為cgmccno：13586的雜交瘤細胞分泌。

分泌所述單克隆抗體的雜交瘤細胞，其特征在于，其保藏編號為cgmccno：13586。

用于檢測待測血清中肝癌標志物血管內皮生長因子的抗體對，其特征在于，由第一抗體和第二抗體組成；所述第一抗體作為包被抗體，由保藏編號為cgmccno：13585的雜交瘤細胞分泌；所述第二抗體作為檢測抗體，由保藏編號為cgmccno：13586的雜交瘤細胞分泌。

用于肝癌早期診斷的試劑盒，其特征在于，包括所述單克隆抗體或所述抗體對，以及用于免疫檢測的通用試劑。

所述試劑盒，其特征在于，包括所述抗體對，所述第一抗體與磁珠偶聯，所述第二抗體用生物素標記，所述用于免疫檢測的通用試劑為鏈霉親和素-藻紅蛋白。

所述試劑盒，其特征在于，還包括血管內皮生長因子的標準品和/或以所述血管內皮生長因子的標準品制作的標準曲線或直線回歸方程說明書。

任一所述的試劑盒，其特征在于，還包括抗甲胎蛋白的抗體、抗高爾基糖蛋白73的抗體、抗α-l-巖藻糖苷酶的抗體和/或抗細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子cd147的抗體，及其相應的免疫檢測試劑。

所述試劑盒，其特征在于，還包括甲胎蛋白、高爾基糖蛋白73、α-l-巖藻糖苷酶和/或細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子cd147的標準品，和/或以甲胎蛋白、高爾基糖蛋白73、α-l-巖藻糖苷酶和/或細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子cd147的標準品制作的標準曲線或直線回歸方程說明書。

本發明使用dnastar序列分析軟件對肝癌血清標志物血管內皮生長因子(vegf)的氨基酸序列(ncbi序列號：np_001020539.2)進行分析，根據商業化的抗體所選擇表達的部位，及各變體的不同作用，選擇第207-371aa的165個氨基酸的肽段作為抗原，其氨基酸序列如seqidno.5所示，基因編碼序列如seqidno.6所示。

通過蛋白原核表達的方法獲得抗原蛋白并免疫小鼠，篩選出能夠特異結合vegf的單克隆抗體，并通過elisa雙抗夾心實驗對獲得的單克隆抗體進行配對，篩選到了能夠用于血清vegf定量檢測的抗體對，由第一抗體(包被抗體)和第二抗體(檢測抗體)組成，其雜交瘤細胞保藏號分別是cgmccno：13585和cgmccno：13586。所述抗體對特異性強(可以同時與其他標志物抗體聯合使用，不受干擾地檢測出血清中vegf，見實施例4記載)、靈敏度高(可檢測到濃度低至250pg/ml的vegf，見實施例4所記載)，能夠準確定量血清中的vegf蛋白。

本發明的試劑盒，還可以包括除甲胎蛋白、高爾基糖蛋白73、α-l-巖藻糖苷酶、血管內皮生長因子和細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子cd147之外的其它腫瘤標志物的特異性抗體，及其相應的免疫檢測試劑。

采用本發明的抗體對或試劑盒，結合luminex技術、雙抗夾心的免疫學技術以及標準曲線來實現血清中vegf的定量檢測。該方法的檢測原理是：將偶聯了第一抗體的磁珠與稀釋后的待測血清樣品4℃孵育過夜，形成抗原-特異性抗體復合物，用洗滌緩沖液洗去未結合的抗原；加入生物素標記的第二抗體，室溫孵育，形成特異性抗體-抗原-抗體復合物，用洗滌緩沖液洗去未結合的抗體；加入鏈霉親和素-藻紅蛋白(sape)，室溫孵育，形成抗體-抗原-抗體-生物素-sape復合物，用洗滌緩沖液洗去未結合的sape；加入測定緩沖液后置于液相懸浮芯片系統中讀取mfi值；最后將mfi值代入標準曲線的方程式中計算出樣品中vegf的濃度，乘以血清樣品的稀釋倍數得出vegf的實際濃度。

與常規檢測方法elisa相比，本發明的方法具有快速、靈敏的優點，并且可以在一個反應體系中同時檢測其它肝癌相關腫瘤標志物，如afp，afp-l3，gp73，afu，cd147等。利用luminex液態芯片技術，根據診斷的實際需要，對偶聯有不同腫瘤標志物特異性抗體的熒光編碼微球進行自由組合，一次實驗可以同時完成多種肝癌相關腫瘤標志物的定量分析，具有以下優勢：(1)一次檢測血漿用量最低10ul，可以同時檢測6種血漿蛋白，大大減少了血漿用量，省時省力，檢測成本低；(2)液相芯片技術反應體系在液相環境下，有利于保持生物大分子的活性，使得反應體系更加穩定，檢測結果更加可靠準確；(3)血漿樣品中的肝癌相關腫瘤標志物afp，afp-l3，gp73，afu，vegf，cd147蛋白聯合檢測使多種腫瘤標志物之間相關性的分析更加準確，可以提高肝癌早期的診斷率，以便及時制定治療方案，延長患者生命。

生物保藏信息

保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心

地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所

附圖說明

圖1.luminex液相芯片檢測原理示意圖；

圖2.gp73單因子標準品檢測結果；

圖3.afu單因子標準品檢測結果；

圖4.vegf單因子標準品檢測結果；

圖5.cd147單因子標準品檢測結果；

圖6.afp單因子標準品檢測結果；

圖7.cd147，vegf雙因子標準品檢測結果；

cd147和vegf雙因子在同一個體系中反應，抗體之間沒有發生交叉反應，各因子的反應性能沒有明顯變化。

圖8.cd147，vegf，afp三因子標準品檢測結果；

cd147，vegf和afp三因子在同一個體系中反應，抗體之間沒有發生交叉反應，各因子的反應性能沒有明顯變化。

圖9.cd147，vegf，afp，afu四因子標準品檢測結果；

cd147，vegf，afp和afu四因子在同一個體系中反應，抗體之間沒有發生交叉反應，各因子的反應性能沒有明顯變化。

圖10.cd147，vegf，afp，afu，gp73五因子標準品檢測結果；

cd147，vegf，afp，afu和gp73五因子在同一個體系中反應，抗體之間沒有發生交叉反應，各因子的反應性能沒有明顯變化。

其中，橫坐標為標準品的濃度，縱坐標為熒光強度。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發明進行詳細說明，需要理解的是，下述實施例作為解釋和說明，不以任何形式限制本發明的范圍。

生物材料

balb/c小鼠，購自杰思捷實驗動物有限公司；

hela細胞，購自廣州賽庫生物技術有限公司；

骨髓瘤細胞，北京青元盛康生物醫藥科技有限公司培養和保存；

e.colidh5α感受態細胞，e.colibl21感受態細胞，為本實驗室保存，可通過商購獲得。

實驗試劑

限制性內切酶ecori和xhoi，購買自takara公司，貨號d1040a，d1094a；

載體pet32a，購買自novagen公司，貨號vyn0176；

t4dna連接酶，購買自takara公司，貨號d2011a；

質粒提取試劑盒，購買自takara公司，貨號9760；

hyclone改良型rpmi-1640培養基，購自hyclone公司，貨號ab10113944；

無支原體新生牛血清(超級)，購自浙江天杭生物科技有限公司，貨號22012-8612；

雙抗(100x)，購自北京雷根生物技術有限公司，貨號ca0075；

l-谷氨酰胺(100x)，購自amresco公司，貨號amresco0374；

peg(50％w/v聚乙二醇1,500)，購自hampton公司，貨號hr2-525；

hat培養基添加劑(50x)，購自gibco公司，貨號21060-017；

羊抗鼠igg，購自碧云天生物，貨號a0286；

醋酸鈉，購自北京化學試劑公司，貨號10018892；

辛酸，購自北京金龍化學試劑有限公司；

streptavin-hrp(鏈霉親和素-辣根過氧化物酶)，購自碧云天，貨號a0303；

sulfo-nhs(n-羥基硫代琥珀酰亞胺)，購自sigma公司，貨號56485；

edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)，購自sigma公司，貨號22980；

mes(2-(n-嗎啡啉)乙磺酸)，購自sigma公司，貨號m2933；

pbs-tbn(封閉/儲存緩沖液)，pbs，含0.1％bsa(bsa購自康源生物)，0.02％tween20(tween20購自amresco0777)，0.05％azide(azide購自sigmas8032)；

assaybuffer(測定緩沖液)，pbs，含1％bsa(bsa購自康源生物)ph7.4；

washbuffer(洗滌緩沖液)，pbs，含0.02％tween20(tween20購自amresco0777)，ph7.4；

sape(鏈霉親和素-藻紅蛋白)，購自ebioscience公司，貨號12-4317；

生物素，購自sigma公司，貨號h1759；

甲胎蛋白標準品，購自中國藥品生物制品檢定所，產品編號150542-1。

儀器與耗材

磁珠，購自luminex公司，貨號mc10030-01，mc10034-01，mc10036-01，mc10038-01，mc10044-01；

磁性分離器，購自biorad公司；

luminex200，購自biorad公司，型號luminex-200。

下述實施例中，未特別說明的生物化學試劑均為本領域常規試劑，可按照常規方法配制而得或商購獲得，規格為實驗室純級即可；未特別說明的實驗器材均為本領域常規實驗器材，可商購獲得。

實施例1.肝癌相關腫瘤標志物的單克隆抗體制備

(一)抗原制備

1.高爾基糖蛋白73(gp73)的抗原制備

重組抗原設計及制備方法記載在：龐麗君，高爾基體蛋白的基因克隆及原核表達，醫藥論壇雜志，2015(9):1-2。按照文章中記載的方法制備得到高純度的抗原gp73-f3r3，其表達菌種保藏于北京青元盛康生物醫藥科技有限公司。

2.α-l-巖藻糖苷酶(afu)的抗原制備

2.1抗原設計

α-l-巖藻糖苷酶全長466個氨基酸，使用dnastar序列分析軟件分析α-l-巖藻糖苷酶的氨基酸序列(ncbi序列號：np_000138.2)，獲得蛋白的二級結構、親疏水性、抗原性等信息。綜合考慮蛋白序列的抗原性、特異性、蛋白表達和純化的難易性，選取第252-441aa的肽段作為抗原afu-f2r2，其氨基酸序列如seqidno.1所示，基因編碼序列如seqidno.2所示。

2.2抗原表達

2.2.1目的片段的獲得

(1)引物設計：在正向引物的5’端引入ecori酶切位點，反向引物的5’端引入xhoi酶切位點，得到的引物序列如下：

afu-f2：5’-cggaattcgacagccctgtcaaggatgag-3’；

afu-r2：5’-ccgctcgaggaagagacctttatctggatc-3’。

(2)模板dna的獲得

從hela細胞中提取基因組dna：方法和步驟參見《分子克隆實驗指南》。

反轉錄獲得cdna：方法和步驟參見《分子克隆實驗指南》。

(3)按照下列pcr體系和程序擴增目的片段：

pcr體系：20ul

pcr程序：

2.2.2載體構建

(1)酶切反應：使用限制性內切酶ecori和xhoi，分別對目的片段和表達載體pet32a進行雙酶切。

酶切體系(100ul)：

ecori：5ul

xhoi：5ul

10×緩沖液：10ul

質粒(8ng/ul)：55ul

h2o：25ul

酶切條件：37攝氏度過夜，獲得線性化pet-32a載體和pcr酶切產物。

(2)連接反應：

連接體系(12ul)：

線性化pet-32a載體(ecori/xhoi，8ng/ul)：0.5ul

t4dna連接酶：1ul

10×緩沖液：1.2ul

pcr酶切產物(1ng/ul)：9.3ul

連接條件：室溫連接10h，得到連接產物。

2.2.3蛋白表達與純化

(1)轉化e.colidh5α感受態細胞

e.colidh5α感受態細胞放置冰上融化后，加入連接產物，冰上靜置30min。42℃熱處理90s，冰上靜置2min。加入lb培養基600μl，37℃，150rpm搖床培養45min。取200μl菌液涂布于氨芐青霉素抗性(amp⁺)lb平板上，37℃過夜培養。

(2)陽性克隆鑒定

挑取單菌落，接種于lb/amp⁺的液體培養基中，200rpm、37℃培養8小時，8000rpm離心5min收集菌體。使用質粒提取試劑盒，按照說明書中的操作步驟提取質粒。按照步驟2.2.1中的pcr體系和程序進行pcr驗證。將pcr鑒定正確的重組質粒送生工生物工程有限公司測序，比對結果正確的重組質粒作為表達載體。

(3)轉化e.colibl21細胞

e.colibl21感受態細胞放置冰上融化后，加入表達載體，冰上靜置30min。42℃熱處理90s，冰上靜置2min。加入lb培養基600μl，37℃，150rpm搖床培養45min。取200μl菌液涂布于amp⁺抗性lb平板上，37℃過夜培養。

(4)蛋白表達

挑取單菌落，接種于5ml的amp⁺抗性lb液體培養基中，37℃培養過夜，取過夜培養物140ul加入3ml新鮮的amp⁺抗性lb液體培養基中，37℃培養，達到od600為0.5左右，加入1/1000iptg(0.8m)，37℃，180rmp培養4h。跑10％的sds-page判斷誘導情況。

(5)蛋白純化

采用硫酸銨沉淀法純化蛋白：將樣品離心，去除沉淀，保留上清液并測量體積；一邊攪拌一邊慢慢的加入硫酸銨。接著，將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6h，或者4℃攪拌過夜，使蛋白質充分沉淀。將蛋白質溶液離心沉淀，棄上清保留沉淀。加入10-20ml的pbs-疊氮化鈉溶液溶解蛋白質。蛋白沉淀溶解之后，放入透析袋中透析24-48h，每隔5h更換透析液除去硫酸銨。收集透析液，離心，測定上清中蛋白質的含量。

3.血管內皮生長因子(vegf)的抗原制備

3.1抗原設計

使用dnastar序列分析軟件分析人血管內皮生長因子的氨基酸序列(ncbi序列號：np_001020539.2)，根據蛋白的二級結構、親疏水性、抗原性等信息，以及各變體的不同作用，選擇第207-371aa的165個氨基酸的肽段作為抗原vegf-fr，其氨基酸序列如seqidno.5所示，基因編碼序列如seqidno.6所示。

3.2抗原表達

3.2.1目的片段的獲得

(1)引物設計：在正向引物的5’端引入ecori酶切位點，反向引物的5’端引入xhoi酶切位點，得到的引物序列如下：

vegf-f：5’-cggaattcgcacccatggcagaaggaggag-3’；

vegf-r：5’-ccgctcgagccgcctcggcttgtcacatctg-3’。

(2)以2.2.1獲得的cdna為模板，按照下列pcr體系和程序擴增目的片段：

pcr體系：20ul

pcr程序：

3.2.2載體構建

構建方法同2.2.2。

3.2.3蛋白表達與純化

宿主菌和表達純化方法同2.2.3。

4.細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子(cd147)的抗原制備

4.1抗原設計

使用dnastar序列分析軟件分析人cd147的氨基酸序列(proteinid：bac76828.1)，綜合考慮蛋白序列的抗原性、特異性、蛋白表達和純化的難易性，選取第25-177aa的肽段作為抗原cd147-f3r3，其氨基酸序列如seqidno.9所示，基因編碼序列如seqidno.10所示。

4.2抗原表達

4.2.1目的片段的獲得

(1)引物設計：在正向引物的5’端引入ecori酶切位點，反向引物的5’端引入xhoi酶切位點，得到的引物序列如下：

cd147-f3:5’-cggaattcacagtcttcactaccgtagaag-3’；

cd147-r3:5’-cgctcgagctccatgttcaggttctcaatg-3’。

(2)以2.2.1獲得的cdna為模板，按照下列pcr體系和程序擴增目的片段：

pcr體系：20ul

pcr程序：

4.2.2載體構建

構建方法同2.2.2。

4.2.3蛋白表達與純化

宿主菌和表達純化方法同2.2.3。

(二)抗體制備

1.免疫小鼠

準備出生后8-12周balb/c小鼠兩只(每種抗原免疫兩只小鼠)，用高純度的抗原按照下列方法對兩只小鼠進行免疫：

首次免疫，取100ug抗原+100ul完全佐劑乳化混勻注入小鼠足掌，約80ul/只；第二次免疫，取100ul抗原+100ul不完全佐劑乳化混勻注入小鼠足掌，約80ul/只；第三、四、五次免疫，均同第二次免疫。

2.細胞融合

以下所有的操作均在超凈臺中完成。

(1)從培養箱中取出骨髓瘤細胞，吹開貼壁細胞后倒入離心管中，離心5min，2000轉，離心后棄上清，加入40ml冰水浴的rpmi-1640培養基(含2/1雙抗)混勻待用。

(2)準備三個培養皿，分別倒入冰水浴的rpmi-1640培養基(含2/1雙抗)，取小鼠大腿內側淋巴細胞，兩顆，放入第一個培養皿中，開始剪去撕掉淋巴細胞上的脂肪組織和結締組織，移入第二個培養皿中，清洗淋巴結細胞，再移入第三個培養皿中，開始撕碎淋巴結讓細胞釋放出來，并用滴管來回吹打幾下，更有力的釋放出細胞，接著開始過濾細胞(用帶有棉花的吸管過濾到離心管中)至40ml，并標記為淋巴結細胞，和骨髓瘤細胞一起離心，10min，2000轉/min，離心后各棄上清30ml，開始計數，將淋巴結細胞和骨髓瘤細胞按比例(gp73為1:3，afu為2:3，vegf為2:3，cd147為1:1)混勻，加入冰水浴的rpmi-1640培養基至50ml，離心5min，2000轉/min，棄上清再加入冰水浴的rpmi-1640培養基至50ml，離心5min，2000轉/min，棄上清，加入熱的rpmi-1640培養基至50ml，離心5min，2000轉/min。

(3)開始加入peg：取出混勻且離心后的淋巴結細胞和骨髓瘤細胞，棄上清，吸干凈離心管中剩余的rpmi-1640培養基，取出約0.8mlpeg一滴一滴加入離心管中，并伴隨著輕微的摩擦，搖晃，加入完畢后，放入37度水浴箱中孵育一分鐘，使peg更容易粘合。

(4)取出水浴后的細胞，開始緩慢的加入熱的rpmi-1640培養基，一滴滴加入并伴隨著搖晃，直至35ml，再加至50ml，離心10min，1000轉/min。

(5)配制200ml培養液(含hat培養基添加劑(50x)，雙抗(100x)，l-谷氨酰胺(100x)及20％無支原體新生牛血清)，含10ml飼養層細胞。

(6)細胞離心后去上清，加入200ml培養液，混勻，鋪板185ul/孔，10塊板，標記1到10號，放入培養箱中。融合后第六天觀看融合板，并標記細胞孔和單克隆孔，以便檢測后查找。

3.雜交瘤細胞的篩選與檢測

(1)包被快速檢測板：用抗原包被，2ug/ml，50ul/孔，共二十塊板。用1xpbs稀釋液混勻抗原后加至檢測板中，37度孵育2小時，洗五次，拍干后加入封閉液，180ul/孔，37度孵育1小時，拍干，放入4度待用。

(2)取出十塊快速檢測板并取出1到10號融合板，一塊檢測板對應一塊融合板進行elisa檢測，從融合板中取細胞培養上清加入檢測板中，50ul/孔，留取最后四孔分別作為兩陰性孔和陽性孔，37度孵育1小時，取出檢測板，棄上清，洗板五次，拍干，加入1:10000倍稀釋的羊抗鼠二抗(稀釋液pbst-bsa)，50ul/孔，37度1小時，洗板5次，拍干，加入tmb顯色十分鐘，加入終止液，讀數，標記陽性的細胞孔。

(2)第二天取出十塊新的快速檢測板，對1到10號融合板再次進行elisa檢測，讀數，標記陽性的細胞孔。選出兩次檢測都是陽性的細胞孔且讀值在1以上的細胞孔，gp73為17株，afu為12株，vegf為10株，cd147為10株，準備克隆。

(3)單克隆抗體的檢測：配400ml培養液(含hat培養基添加劑(50x)、雙抗(100x)、l-谷氨酰胺(100x)、20％無支原體新生牛血清)，含20ml飼養層細胞。顯微鏡下觀察每孔細胞數量，取出約80的細胞數量，平均鋪板，190ul/孔，放入培養箱中，培養七天，觀看克隆板，記錄下單克隆孔，并進行elisa檢測，根據od450>0.8的篩選標準，選出單克隆抗體株。

(4)選定單克隆抗體株后，加入新的培養液(含飼養層細胞)，放入培養箱中培養。經過四天后，打開克隆板觀看細胞數量和培養液顏色，細胞量長滿約占孔2/3，觀看細胞孔中的細胞狀態。

gp73定株的是：2f10a4，4d3d5，7b7b3，1c10b5，1g9c8，3d10b5，4g8d7，8f10d1，10b9f11，10c11b1，4g8e12和7e11d11。

afu定株的是：1e1d1，3b6c3，3f12d8，1a4h4，3f12e4，10e11g10，10f10g10，5f2c3，7b9h5，4g1h4，5e5a5，5e5g5，5f2d7。

vegf定株的是：1d2e5，3b1d8，4c3d12，4d3e5，5c7f10，5e1c3，7a11d4，7a11e10，8e10d8。

cd147定株的是：1a2d8，3d6c6，4a4c3，5a4e9，5c9g1，6a1d4，6b7f12。

(5)包被一塊快速檢測板，檢測24孔中的細胞。

4.制備腹水

(1)準備二十只已生育過的小鼠，注入石蠟油，約1ml/只。

(2)將24孔中長滿的細胞傳入六孔，在六孔中長滿后再傳入小瓶中，在小瓶中長滿后，將細胞注入小鼠腹中。

(3)經過十五天后觀看小鼠腹部，出現大肚情況即可抽取腹水，處理腹水，離心10min，2000轉/min，留取上清，保存于零下20度備用。

5.腹水純化抗體

以sorvall50ml離心管作為反應容器，利用辛酸法從小鼠腹水中純化單克隆抗體，實驗步驟如下：

(1)將10ml腹水在室溫20000rpm離心30min；

(2)取10ml上清液加入20ml0.06mph4.0醋酸鈉緩沖液，然后用1mnaoh調節ph至ph4.8；

(3)逐滴加入750ul辛酸，室溫快速攪拌30min；然后室溫離心混合物20000rpm，30min；小心傾出上清液，并用槍頭吸走沉淀物上面附著的上清液；

(4)用1l0.1mph6.5napo4，4mmedta透析兩次，3小時換一次液，得到抗體溶液，測定蛋白濃度。

實施例2.用于雙抗夾心法檢測的抗體對配對

(一)elisa雙抗夾心配對實驗

按照如下步驟，分別對實施例1純化得到的每一種蛋白的單克隆抗體進行配對實驗：

1、包被：包被抗體(實施例1純化得到的單抗之一)用pbs(ph＝7.4)稀釋至5ug/ml。每孔100ul，37℃包被1h。

2、洗板：pbst洗5次，拍干。

3、封閉：封閉液(含3％bsa和4％蔗糖pbs)，每孔200ul，37℃封閉1h。

4、干燥：不洗板，拍干殘液，風干30min。

5、加入抗原：抗原(實施例1中純化得到的抗原)用含1％bsa的pbs(ph＝7.4)稀釋至2ug/ml，加入酶標板，從第1孔(2ug/ml)倍比稀釋至第11孔(0.2ng/ml)，每孔100ul，第12孔加含1％bsa的pbs(ph＝7.4)作為陰性對照，37℃孵育40min。

6、洗板：pbst洗5次，拍干。

7、加入檢測抗體：用含1％bsa的pbs(ph＝7.4)稀釋生物素標記的單抗(實施例1純化得到的單抗之一)，然后加入酶標板，每孔100ul，37℃孵育40min。

8、洗板：pbst洗5次，拍干。

9、加入streptavin-hrp：用含1％bsa的pbs(ph＝7.4)稀釋streptavin-hrp，每孔100ul，37℃作用30min。

10、洗板：pbst洗5次，拍干。

11、顯色：每孔加入四甲基聯苯胺(tmb)100ul顯色。

12、終止反應：每孔加入1mh2so4100ul，酶標儀讀值。

結果如下表所示：

表1.gp73雙抗夾心配對實驗結果

表2.afu雙抗夾心配對實驗結果

表3.vegf雙抗夾心配對實驗結果

表4.cd147雙抗夾心配對實驗結果

以甲胎蛋白標準品為抗原，按照上述elisa雙抗夾心實驗步驟檢測本實驗室已有的抗afp的抗體對(包被抗體3b11h5和檢測抗體2g5e8)，結果表明，抗afp抗體對的抗原檢測極限為1.6ng/ml。

(二)配對抗體對血清的檢測效果驗證

按照上述elisa雙抗夾心配對實驗步驟，以人血清為抗原，驗證配對較好的抗體對的檢測效果，篩選出檢測效果最好的抗體并送中國普通微生物菌種保藏管理中心進行保藏，結果如下：

gp73：包被抗體8f10d1，檢測抗體10b9f11；

afu：包被抗體3f12d8(cgmccno：13583)，檢測抗體10f10g10(cgmccno：13584)；

vegf：包被抗體7a11d4(cgmccno：13585)，檢測抗體8e10d8(cgmccno：13586)；

cd147：包被抗體4a4c3(cgmccno：13587)，檢測抗體6b7f12(cgmccno：13588)；

afp：包被抗體3b11h5(cgmccno：13581)，檢測抗體2g5e8(cgmccno：13582)。

實施例3.抗體的偶聯和標記

1、磁珠與包被抗體的偶聯

(1)清洗磁珠：懸浮未偶聯的磁珠(mc10030-01，mc10034-01，mc10036-01，mc10038-01，mc10044-01)，轉移5.0×10⁶個磁珠到離心管中，將離心管放到磁性分離器上分離30-60s，吸出上清，加入100uldh2o渦旋重新懸浮磁珠，磁性分離器上分離30-60s，吸出上清。

(2)活化磁珠：加入80ul0.1mnah2po4(ph6.2)，渦旋懸浮磁珠；再加入10ul50mg/mlsulfo-nhs(n-羥基硫代琥珀酰亞胺)和10ul50mg/mledc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)，渦旋混勻，室溫孵育20分鐘以活化微球。然后用250ul50mmph5.0mes(2-(n-嗎啡啉)乙磺酸)溶液洗兩次，以除去未接合的sulfo-nhs和edc。

(3)抗體偶聯磁珠：取100ul50mmmes(ph5.0)加入活化后的磁珠中重懸磁珠，取10-20ug實施例2篩選得到的最佳包被抗體加入對應的磁珠中(一種蛋白對應一種磁珠)，用mes定容至500ul，室溫下避光反應2小時。將離心管放到磁性分離器上分離30-60s，吸出上清。

(4)保存偶聯抗體的磁珠：加入500ulpbs-tbn作為封閉緩沖液，室溫下旋轉振動孵育30分鐘。將離心管放到磁性分離器上分離30-60s，除去上清，用1mlpbs-tbn作為清洗緩沖液洗兩次，吸出上清，加入250-1000ulpbs-tbn4℃保存。

(5)抗體偶聯效率的確認：用assaybuffer稀釋抗體偶聯后的磁珠(微球組)，使其終濃度為50磁珠/ul,加入96孔板，50ul/孔。將生物素標記的羊抗鼠igg稀釋成4ug/ml，2ug/ml，1ug/ml，0.5ug/ml，0.25ug/ml，0.125ug/ml，0.0625ug/ml，每孔加入50ul，空白對照加入50ulassaybuffer，室溫震蕩孵育30min，washbuffer洗3次，加入sape50ul/孔，室溫振蕩孵育30分鐘，washbuffer洗2次，最后加入80ulassaybuffer上機(luminex200)檢測，結果如下表所示。

表6腫瘤標志物抗體偶聯確認結果

2、檢測抗體的生物素標記

將2mg生物素(sigma)溶解于200ul溶劑dmso中，將實施例2中篩選得到的最佳檢測抗體用ph＝9.6的碳酸緩沖液溶解至1mg/ml450ul。向檢測抗體溶液中加入溶解好的生物素50ul(有機溶劑占體系10％，生物素過量)，室溫反應4h后加500ul純甘油，保存于-20℃冰箱中備用。

實施例4.標準曲線制作

將實施例1制備得到的抗原用assaybuffer進行4倍梯度稀釋，得到濃度分別為1000ng/ml，250ng/ml，64ng/ml，16ng/ml，4ng/ml，1ng/ml，0.25ng/ml抗原溶液，同時以assaybuffer作為空白對照。

將實施例3中偶聯好的磁珠用assaybuffer稀釋好后，避光96孔板中每孔加入50ul，96孔板放入磁板上，每孔加入120ulwashbuffer，靜置2分鐘，倒掉washbuffer，加入不同濃度梯度的抗原，4℃過夜反應(15-18h)，washbuffer洗三次；加入稀釋好的生物素標記的檢測抗體，50ul/孔，室溫800轉/分孵育30分鐘；washbuffer洗三次；加入sape，50ul/孔，室溫800轉/分孵育30分鐘，washbuffer洗兩次，加入80ulassaybuffer上機檢測，結果如圖2-6所示，afp，gp73，afu，vegf敏感度均可達到250pg/ml，cd147敏感度可達到64pg/ml。

此外還進行了cd147/vegf雙因子，cd147/vegf/afp三因子，cd147/vegf/afp/afu四因子，以及cd147/vegf/afp/afu/gp73五因子標準品檢測。具體檢測方法同上，不同之處在于：(1)將偶聯了不同腫瘤標志物包被抗體的磁珠混合成一個體系；(2)抗原為不同腫瘤標志物抗原的混合液；(3)檢測抗體為稀釋好的生物素標記的不同腫瘤標志物檢測抗體的混合液。

結果如表7-10所示：

表7.cd147，vegf雙因子標準品檢測結果

表8.cd147，vegf，afp三因子標準品檢測結果

表9.cd147，vegf，afp，afu四因子標準品檢測結果

表10.cd147，vegf，afp，afu，gp73五因子標準品檢測結果

多因子檢測結果表明，本發明所提供的包被抗體和檢測抗體具有以下優點：

(1)特異性強：多對抗體在同一反應體系中同時檢測多種蛋白時的反應性能與單獨檢測每種蛋白時的反應性能無明顯變化，各因子抗體與其它因子之間未發生交叉反應。

(2)準確性好：在同一反應體系中，各因子抗體之間不發生交叉反應。

(3)靈敏度高：在同一反應體系中，檢測afp，gp73，afu，vegf的靈敏度均可達到250pg/ml，檢測cd147的靈敏度可達到64pg/ml。

sequencelisting

<110>馬,杰

<120>用于檢測血清中血管內皮生長因子的抗體及試劑盒

<130>p160546／yay

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>190

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>α-l-巖藻糖苷酶抗原的氨基酸序列

<400>1

aspserprovallysaspgluvalvalvalasnaspargtrpglygln

151015

asncyssercyshishisglyglytyrtyrasncysgluasplysphe

202530

lysproglnserleuproasphislystrpglumetcysthrserile

354045

asplysphesertrpglytyrargargaspmetalaleuseraspval

505560

thrgluglusergluileilesergluleuvalglnthrvalserleu

65707580

glyglyasntyrleuleuasnileglyprothrlysaspglyleuile

859095

valproilepheglngluargleuleualavalglylystrpleuser

100105110

ileasnglyglualailetyralaserlysprotrpargvalglntrp

115120125

glulysasnthrthrservaltrptyrthrserlysglyseralaval

130135140

tyralailepheleuhistrpprogluasnglyvalleuasnleuglu

145150155160

serproilethrthrserthrthrlysilethrmetleuglyilegln

165170175

glyaspleulystrpserthraspproasplysglyleuphe

180185190

<210>2

<211>570

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>α-l-巖藻糖苷酶抗原的基因編碼序列

<400>2

gacagccctgtcaaggatgaggtggtagtaaatgaccgatggggtcagaactgttcctgt60

caccatggaggatactataactgtgaagataaattcaagccacagagcttgccagatcac120

aagtgggagatgtgcaccagcattgacaagttttcctggggctatcgtcgtgacatggca180

ttgtctgatgttacagaagaatctgaaatcatttcggaactggttcagacagtaagtttg240

ggaggcaactatcttctgaacattggaccaactaaagatggactgattgttcccatcttc300

caagaaaggcttcttgctgttgggaaatggctgagcatcaatggggaggctatctatgcc360

tccaaaccatggcgggtgcaatgggaaaagaacacaacatctgtatggtatacctcaaag420

ggatcggctgtttatgccatttttctgcactggccagaaaatggagtcttaaaccttgaa480

tcccccataactacctcaactacaaagataacaatgctgggaattcaaggagatctgaag540

tggtccacagatccagataaaggtctcttc570

<210>3

<211>29

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>α-l-巖藻糖苷酶抗原編碼序列的pcr正向引物afu-f2

<400>3

cggaattcgacagccctgtcaaggatgag29

<210>4

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>α-l-巖藻糖苷酶抗原編碼序列的pcr反向引物afu-r2

<400>4

ccgctcgaggaagagacctttatctggatc30

<210>5

<211>165

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>血管內皮生長因子抗原的氨基酸序列

<400>5

alaprometalagluglyglyglyglnasnhishisgluvalvallys

151015

phemetaspvaltyrglnargsertyrcyshisproilegluthrleu

202530

valaspilepheglnglutyrproaspgluileglutyrilephelys

354045

prosercysvalproleumetargcysglyglycyscysasnaspglu

505560

glyleuglucysvalprothrglugluserasnilethrmetglnile

65707580

metargilelysprohisglnglyglnhisileglyglumetserphe

859095

leuglnhisasnlyscysglucysargprolyslysaspargalaarg

100105110

glngluasnprocysglyprocyssergluargarglyshisleuphe

115120125

valglnaspproglnthrcyslyscyssercyslysasnthraspser

130135140

argcyslysalaargglnleugluleuasngluargthrcysargcys

145150155160

asplysproargarg

165

<210>6

<211>495

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>血管內皮生長因子抗原的基因編碼序列

<400>6

gcacccatggcagaaggaggagggcagaatcatcacgaagtggtgaagttcatggatgtc60

tatcagcgcagctactgccatccaatcgagaccctggtggacatcttccaggagtaccct120

gatgagatcgagtacatcttcaagccatcctgtgtgcccctgatgcgatgcgggggctgc180

tgcaatgacgagggcctggagtgtgtgcccactgaggagtccaacatcaccatgcagatt240

atgcggatcaaacctcaccaaggccagcacataggagagatgagcttcctacagcacaac300

aaatgtgaatgcagaccaaagaaagatagagcaagacaagaaaatccctgtgggccttgc360

tcagagcggagaaagcatttgtttgtacaagatccgcagacgtgtaaatgttcctgcaaa420

aacacagactcgcgttgcaaggcgaggcagcttgagttaaacgaacgtacttgcagatgt480

gacaagccgaggcgg495

<210>7

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>血管內皮生長因子抗原編碼序列的pcr正向引物vegf-f

<400>7

cggaattcgcacccatggcagaaggaggag30

<210>8

<211>31

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>血管內皮生長因子抗原編碼序列的pcr反向引物vegf-r

<400>8

ccgctcgagccgcctcggcttgtcacatctg31

<210>9

<211>153

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>cd147抗原的氨基酸序列

<400>9

thrvalphethrthrvalgluaspleuglyserlysileleuleuthr

151015

cysserleuasnaspseralathrgluvalthrglyhisargtrpleu

202530

lysglyglyvalvalleulysgluaspalaleuproglyglnlysthr

354045

gluphelysvalaspseraspaspglntrpglyglutyrsercysval

505560

pheleuprogluprometglythralaasnileglnleuhisglypro

65707580

proargvallysalavallyssersergluhisileasngluglyglu

859095

thralametleuvalcyslyssergluservalproprovalthrasp

100105110

trpalatrptyrlysilethraspsergluasplysalaleumetasn

115120125

glysergluserargphephevalserserserglnglyargserglu

130135140

leuhisilegluasnleuasnmetglu

145150

<210>10

<211>459

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>抗原的基因編碼序列

<400>10

acagtcttcactaccgtagaagaccttggctccaagatactcctcacctgctccttgaat60

gacagcgccacagaggtcacagggcaccgctggctgaaggggggcgtggtgctgaaggag120

gacgcgctgcccggccagaaaacggagttcaaggtggactccgacgaccagtggggagag180

tactcctgcgtcttcctccccgagcccatgggcacggccaacatccagctccacgggcct240

cccagagtgaaggctgtgaagtcgtcagaacacatcaacgagggggagacggccatgctg300

gtctgcaagtcagagtccgtgccacctgtcactgactgggcctggtacaagatcactgac360

tctgaggacaaggccctcatgaacggctccgagagcaggttcttcgtgagttcctcgcag420

ggccggtcagagctacacattgagaacctgaacatggag459

<210>11

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>cd147抗原編碼序列的pcr正向引物cd147-f3

<400>11

cggaattcacagtcttcactaccgtagaag30

<210>12

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>cd147抗原編碼序列的pcr反向引物cd147-r3

<400>12

cgctcgagctccatgttcaggttctcaatg30