一種基于耦合光柵的熒光生物傳感器及檢測(cè)方法與流程

本發(fā)明涉及一種生化檢測(cè)、集成光子芯片，尤其涉及的是一種基于耦合光柵的熒光生物傳感器及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

生物傳感器已經(jīng)成為分析化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)非常重要的研究方向，人們對(duì)此做出了深入廣泛的研究。熒光生物傳感是依靠熒光信號(hào)為檢測(cè)手段，對(duì)熒光物質(zhì)的檢測(cè)通常借助于熒光的增強(qiáng)、淬滅或者發(fā)射波長(zhǎng)的移動(dòng)，從而能得出熒光信號(hào)的轉(zhuǎn)變，熒光傳感器是把和分析物質(zhì)濃度具有的信號(hào)轉(zhuǎn)換為熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的分析。由于熒光檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、方便、快捷、還能實(shí)現(xiàn)在線實(shí)時(shí)分析等特點(diǎn)，在日常的分析檢測(cè)中得到了普遍的應(yīng)用。同時(shí)由于它的高靈敏度以及許多重要的物質(zhì)的熒光性質(zhì)，使得該方法在藥物、臨床、環(huán)境、食品的微量、痕量分析以及生命科學(xué)研究領(lǐng)域具有重要意義。熒光物質(zhì)的熒光產(chǎn)生過(guò)程：當(dāng)物質(zhì)受到光照射時(shí)，基態(tài)分子吸收光能就會(huì)產(chǎn)生電子能級(jí)躍遷到激發(fā)態(tài)上，但是處于電子激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，很快它就會(huì)通過(guò)無(wú)輻射躍遷和輻射躍遷釋放能量而返回基態(tài)。輻射躍遷的過(guò)程會(huì)產(chǎn)生光子的發(fā)射，產(chǎn)生熒光。

但是目前商用的大多熒光生物傳感還無(wú)法實(shí)現(xiàn)多物質(zhì)、高通量的生物檢測(cè)，這對(duì)于低成本、低樣品量的旺盛需求不符。集成光學(xué)技術(shù)在過(guò)去十幾年中快速發(fā)展，基于成熟的cmos加工技術(shù)，可以完成各種微納光器件的制作，其中很多微納光器件可以作為生物檢測(cè)中的核心傳感器，如光子晶體、微環(huán)、馬赫曾德干涉儀等，由于器件尺寸很小，在同一芯片上可以實(shí)現(xiàn)很高的集成度，這就為傳感器陣列化提供了條件；另一方面，隨著微流控技術(shù)的快速發(fā)展，與集成光子芯片的鍵合技術(shù)也已成熟，這些為基于集成光子芯片的陣列化、高通量的傳感提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐。

目前集成光子學(xué)生物傳感方案，adaml.washburn.etc,“l(fā)abel-freequantitationofacancerbiomarkerincomplexmediausingsiliconphotonicmicroringresonators”，在復(fù)雜的媒介中使用硅光子微諧振器作為label-free定量的癌癥生物標(biāo)志物，anal.chem.2009,81,9499-9506、enriquevalera.etc,“developmentandvalidationofanimmunosensorformonocytechemotacticprotein1usingasiliconphotonicmicroringresonatorbiosensingplatform”一種使用硅光子微諧振器來(lái)開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證免疫傳感器的單核細(xì)胞趨化蛋白的平臺(tái)，clinicalbiochemistry,2015,49(1):121-126中，大多是基于倏逝波檢測(cè)原理，大致過(guò)程是首先在光器件傳感區(qū)波導(dǎo)表面運(yùn)用化學(xué)的方法修飾上一層受體物質(zhì)，當(dāng)該波導(dǎo)處在具有相應(yīng)配體的樣品中時(shí)，配體與受體將會(huì)發(fā)生特異性結(jié)合，影響波導(dǎo)中傳輸光的倏逝波，從而引起傳輸信號(hào)相位的變化，相位的變化通過(guò)干涉原理實(shí)現(xiàn)強(qiáng)度的變化，從而被探測(cè)，但是對(duì)于小分子、超低濃度的檢測(cè)，這種傳感方式并不很好的奏效，除此之外，由于光子器件的物質(zhì)大多為無(wú)機(jī)材料(硅、氮化硅)，生物修飾過(guò)程較為復(fù)雜，穩(wěn)定性和重復(fù)性較差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種基于耦合光柵的熒光生物傳感器及檢測(cè)方法，可以實(shí)現(xiàn)高通量、多物質(zhì)的檢測(cè)。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明的一種基于耦合光柵的熒光生物傳感器，包括硅基底、襯底、耦合光柵結(jié)構(gòu)、傳輸波導(dǎo)、上包層、微流通道和多模光纖；所述硅基底設(shè)置于襯底的底部，所述傳輸波導(dǎo)連接在耦合光柵結(jié)構(gòu)的一端，所述傳輸波導(dǎo)和耦合光柵結(jié)構(gòu)分別設(shè)置在襯底的頂部，所述上包層包覆在襯底的頂部，所述微流通道設(shè)置在上包層的頂部，所述微流通道和上包層之間具有用于檢測(cè)的傳感區(qū)域，所述傳感區(qū)域位于所述耦合光柵的發(fā)射部位置上，所述傳感區(qū)域內(nèi)設(shè)有修飾好的修飾配體層，所述多模光纖的端面傾斜設(shè)置在微流通道內(nèi)，所述多模光纖的端面位于耦合光柵結(jié)構(gòu)的正上方。

所述耦合光柵結(jié)構(gòu)的表面涂覆透明的聚合物薄膜層。便于傳感器件的表征修飾，提供表面物質(zhì)的生物相容性，從而可以提高生物修飾過(guò)程的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述耦合光柵結(jié)構(gòu)的高度與傳輸波導(dǎo)的高度一致。

所述微流通道為pdms通道，所述微流通道的正上方設(shè)有連接孔，所述多模光纖的端面傾斜探入在所述連接孔內(nèi)。使得多模光纖更接近于微流通道的傳感區(qū)域，最大化探測(cè)信號(hào)光，光纖探頭具有一定的傾斜角度，從而可以使得出射的平行激發(fā)光無(wú)法進(jìn)入到多模光纖探頭中。

所述耦合光柵結(jié)構(gòu)發(fā)射的光位于傾斜多模光纖的數(shù)值孔徑內(nèi)。能夠確保傾斜激發(fā)光可以進(jìn)入到多模光纖探頭內(nèi)。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述耦合光柵結(jié)構(gòu)和傳輸波導(dǎo)的材料相同，在可在光波段是透明的，同時(shí)折射率大于二氧化硅。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述耦合光柵結(jié)構(gòu)為氮化硅或五氧化二鉭制成，所述耦合光柵結(jié)構(gòu)的厚度小于或等于300nm。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述上包層為二氧化硅上包層。

所述傳感區(qū)域的制備過(guò)程為：先在傳感區(qū)域的表面進(jìn)行硅烷化處理，然后用偶聯(lián)劑將蛋白分子或核酸分子的氨基與表面進(jìn)行了硅烷化的氨基連接起來(lái)，制得用于捕獲生物分子的傳感區(qū)域。

一種使用所述的基于耦合光柵的熒光生物傳感器進(jìn)行快速檢測(cè)生物分子的方法，包括以下步驟：

(1)將激發(fā)光通過(guò)傳輸波導(dǎo)傳輸?shù)今詈瞎鈻沤Y(jié)構(gòu)上；

(2)將待測(cè)樣品流經(jīng)傳感區(qū)域，當(dāng)待測(cè)樣品中存在與修飾配體層可特異性結(jié)合的受體，受體會(huì)與修飾配體層結(jié)合，通入緩沖液沖洗；

(3)然后再通入帶有熒光標(biāo)記物配體，帶有熒光標(biāo)記物的配體與已經(jīng)結(jié)合的受體再次結(jié)合，再通入緩沖液沖洗；

(4)打開(kāi)光源，激發(fā)光通過(guò)傳輸波導(dǎo)傳入耦合光柵結(jié)構(gòu)，然后斜向上發(fā)出，激發(fā)微流通道內(nèi)的熒光標(biāo)記物，發(fā)出熒光，多模光纖接受熒光，根據(jù)熒光光強(qiáng)與受體濃度成正比的關(guān)系，得到待測(cè)樣品中的受體濃度。

本發(fā)明用于接收光的大數(shù)值孔徑的多模光纖，根據(jù)光柵方程，當(dāng)特定波長(zhǎng)的光經(jīng)過(guò)微納的耦合光柵結(jié)構(gòu)斜向上的發(fā)出，能夠得到發(fā)散很小的平行光，并且光斑可根據(jù)耦合光柵結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)整，可以達(dá)到顯微鏡聚焦的效果，通過(guò)調(diào)整接收光的多模光纖的角度以及耦合光柵結(jié)構(gòu)的周期可以有效減少激發(fā)光的接收，從而可以減少背景光干擾，除此之外，由于微納的耦合光柵結(jié)構(gòu)很小(20umx10um)，并且制作工藝與cmos工藝兼容，可以很容易的實(shí)現(xiàn)多物質(zhì)高通量的檢測(cè)，芯片也可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。

將待檢測(cè)液體通過(guò)微流通道流入修飾好特定配體分子的耦合光柵結(jié)構(gòu)中，如果該液體中存在與耦合光柵探針上捕獲生物分子同種的生物分子，由于生物分子的特異性結(jié)合而被捕獲形成復(fù)合分子。然后再將含有所述的生物識(shí)別分子液體通入耦合光柵結(jié)構(gòu)的探針上，該液體中的識(shí)別生物分子與耦合光柵結(jié)構(gòu)上的相應(yīng)的復(fù)合分子結(jié)合，則其標(biāo)記的熒光物質(zhì)就會(huì)固定在光纖生物探針上，通過(guò)耦合光柵結(jié)構(gòu)斜向上發(fā)出的激發(fā)光激發(fā)熒光物質(zhì)，發(fā)出的熒光被多模光纖接收，從而傳輸?shù)焦怆娞綔y(cè)器中，通過(guò)檢測(cè)的功率大小的即可得知熒光物質(zhì)的多少，從而可以判斷出待檢測(cè)液體中所述的生物分子含量。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明利用耦合光柵結(jié)構(gòu)，可以實(shí)現(xiàn)很小的光斑，無(wú)需顯微鏡等的聚焦，大大減少了激發(fā)光源及其光路設(shè)計(jì)的復(fù)雜性，從而降低成本；

在耦合光柵結(jié)構(gòu)表面均勻涂一層透明的聚合物薄膜，可以有效的提高生物相容性，與傳統(tǒng)的利用倏逝波的集成光學(xué)傳感或光纖傳感，大大增加修飾的穩(wěn)定性和可靠性；由于耦合光柵結(jié)構(gòu)很小(20umx10um)，結(jié)合微流通道，在同一芯片上可以實(shí)現(xiàn)多物質(zhì)和高通量檢測(cè)；

在制作過(guò)程中，可以調(diào)整光柵的周期，使得發(fā)出光在一定的傾角范圍內(nèi)，再通過(guò)調(diào)整接收光的多模光纖的角度，大大減少激發(fā)光進(jìn)入探測(cè)器，有效的減少背景光的干擾。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是耦合光柵結(jié)構(gòu)的俯視圖。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

如圖1和圖2所示，本實(shí)施例的一種基于耦合光柵的熒光生物傳感器，包括硅基底1、襯底2、耦合光柵結(jié)構(gòu)3、傳輸波導(dǎo)4、上包層5、微流通道6和多模光纖7；所述硅基底1設(shè)置于襯底2的底部，所述傳輸波導(dǎo)4連接在耦合光柵結(jié)構(gòu)3的一端，所述傳輸波導(dǎo)4和耦合光柵結(jié)構(gòu)3分別設(shè)置在襯底2的頂部，所述上包層5包覆在襯底2的頂部，所述微流通道6設(shè)置在上包層5的頂部，所述微流通道6和上包層5之間具有用于檢測(cè)的傳感區(qū)域10，所述傳感區(qū)域10位于所述耦合光柵的發(fā)射部位置上，所述傳感區(qū)域10內(nèi)設(shè)有修飾好的修飾配體層9，所述多模光纖7的端面傾斜設(shè)置在微流通道6內(nèi)，所述多模光纖7的端面位于耦合光柵結(jié)構(gòu)3的正上方。在上包層5的表面均勻抹上一層透明的聚合物薄膜，如聚苯乙烯，可有效的提高生物相容性，與傳統(tǒng)的利用倏逝波的集成光學(xué)傳感或光纖傳感，大大增加修飾的穩(wěn)定性和可靠性，便于傳感器件的表征修飾，從而可以提高生物修飾過(guò)程的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

本實(shí)施例的耦合光柵結(jié)構(gòu)3的高度與傳輸波導(dǎo)4的高度一致。

所述微流通道6為pdms通道，所述微流通道6的正上方設(shè)有連接孔，所述多模光纖7的端面傾斜探入在所述連接孔內(nèi)。使得多模光纖7更接近于微流通道6的傳感區(qū)域10，最大化探測(cè)信號(hào)光，光纖探頭具有一定的傾斜角度，從而可以使得出射的平行激發(fā)光無(wú)法進(jìn)入到多模光纖7探頭中。

所述耦合光柵結(jié)構(gòu)3發(fā)射的光位于傾斜多模光纖7的數(shù)值孔徑內(nèi)。能夠確保傾斜激發(fā)光可以進(jìn)入到多模光纖7探頭內(nèi)。

所述耦合光柵結(jié)構(gòu)3和傳輸波導(dǎo)4的材料相同，在可在光波段是透明的，同時(shí)折射率大于二氧化硅。

本實(shí)施例的耦合光柵結(jié)構(gòu)3的制作方法如下：

由于大多數(shù)熒光物質(zhì)都是可見(jiàn)光波段，本實(shí)施例選擇氮化硅作為耦合光柵結(jié)構(gòu)3的材料，其他實(shí)施例中也可以選擇折射率大于二氧化硅的材料，如ta2o5。由于需要制作耦合效率較高的垂直耦合光柵結(jié)構(gòu)3，氮化硅的厚度控制在300nm以下。根據(jù)激發(fā)光的波長(zhǎng)以及發(fā)出光的角度，設(shè)計(jì)選擇合適的光柵周期。制作完波導(dǎo)結(jié)構(gòu)然后在氮化硅表面上生長(zhǎng)一層二氧化硅上包層5。

本實(shí)施例的傳感區(qū)域10的制作方法如下：

采用的主流的生物修飾方式，首先對(duì)二氧化硅上包層5表面進(jìn)行硅烷化，然后用偶聯(lián)劑將蛋白分子或者核酸分子的氨基與表面進(jìn)行了硅烷化的氨基連接起來(lái)即可完成用于捕獲生物分子的傳感區(qū)域10制備。

本實(shí)施例的微流通道6的制作方法如下：

針對(duì)完成修飾的耦合光柵結(jié)構(gòu)3上方的上包層5的表面，采用pdms材料，使用標(biāo)準(zhǔn)的工藝，制作出一個(gè)微流通道6，便于進(jìn)行微量樣品測(cè)試。在制作pdms過(guò)程中，利用3d打印技術(shù)制作模具，在微流通道6正上方制作一個(gè)孔形結(jié)構(gòu)，便于將多模光纖7探頭深入進(jìn)孔中，從而使得探頭更接近于微流通道6的傳感區(qū)域10，最大化探測(cè)信號(hào)光，光纖探頭具有一定的傾斜角度，從而可以使得出射的平行激發(fā)光無(wú)法進(jìn)入到多模光纖7探頭中。

使用本實(shí)施例的生物傳感器進(jìn)行快速檢測(cè)生物分子的方法，包括以下步驟：

(1)調(diào)節(jié)光路，將激發(fā)光通過(guò)傳輸波導(dǎo)4傳輸?shù)今詈瞎鈻沤Y(jié)構(gòu)3上；

(2)使用微流泵將待測(cè)樣品流經(jīng)傳感區(qū)域10，當(dāng)待測(cè)樣品中存在與修飾配體層9可特異性結(jié)合的受體8，受體8會(huì)與修飾配體層9結(jié)合，通入緩沖液沖洗，將沉淀、物理吸附的物質(zhì)沖走，減少干擾；

(3)然后再通入帶有熒光標(biāo)記物配體，帶有熒光標(biāo)記物的配體與已經(jīng)結(jié)合的受體8再次結(jié)合，再通入緩沖液沖洗，將殘余的未結(jié)合的熒光標(biāo)記物的配體；

(4)打開(kāi)光源和探測(cè)器，激發(fā)光通過(guò)傳輸波導(dǎo)4傳入耦合光柵結(jié)構(gòu)3，然后斜向上發(fā)出，配體上標(biāo)記的熒光標(biāo)記分子在耦合光柵結(jié)構(gòu)3發(fā)出的光的激發(fā)下產(chǎn)生熒光，這些熒光部分正好處在多模光纖7的數(shù)值孔徑之內(nèi)，所以能夠被探頭收集，收集后的熒光信號(hào)經(jīng)過(guò)濾波片，濾除激發(fā)光，則光電探測(cè)器探測(cè)到的信號(hào)即為熒光強(qiáng)度，信號(hào)的強(qiáng)弱反應(yīng)出了配體分子的多少，從而可判斷出受體8分子的濃度。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。