心肌肌鈣蛋白I和N?端腦利鈉肽前體二合一測定試劑盒及制法的制作方法

技術領域：

本發明涉及醫學免疫學中熒光免疫層析技術領域，具體地說是一種能夠快速準確的同時對血漿和全血樣品中心肌肌鈣蛋白i、n-端腦利鈉肽前體兩個心腦血管疾病相關指標進行定量分析的心肌肌鈣蛋白i和n-端腦利鈉肽前體二合一測定試劑盒及制法。

背景技術：
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心肌肌鈣蛋白i(cardiactroponini，ctni)可作為心肌損傷標志物。由于其高度的心肌特異性，對于心肌損傷的高度敏感性及較長的窗口期，不僅成為判定心肌損傷，特別是診斷急性心梗的“金標準”。而且已成為判定冠脈綜合征病人處于心肌損傷風險的最合適的標志物。肌鈣蛋白的升高還作為有力的證據可支持臨床醫生及早做出抗血栓、抗血小板凝集及參與性治療的決定。n端腦利鈉肽前體(nt-probnp)是由心、腦分泌的一種含32個氨基酸的多肽激素，心室張力增加時，心臟超負荷促進其分泌，在機體中起排鈉、利尿、擴張血管的生理作用。其升高濃度和心衰(急性心衰ahf慢性心衰chf)嚴重程度相一致。疑似心衰(hf)時，應首選n端腦利鈉肽前體(nt-probnp)的檢測。n端腦利鈉肽前體(nt-probnp)陰性有很高的預測價值，可排除心衰的存在。在呼吸困難患者，n端腦利鈉肽前體(nt-probnp)是一個將發生(hf)的較強預示因子，能有效地鑒別慢性阻塞性呼吸困難和心源性呼吸困難。尤其是在篩選左室功能不良(lvd)以及心肌梗死后危險度評價方面能顯示出明顯優越性。

免疫分析技術是利用微量抗原與相應的高特異性抗體之間的免疫反應，來檢測如激素、藥物、蛋白質、多肽、酶、腫瘤相關抗原、微生素、病毒、細菌及金屬元素等生物體內活性物質。免疫分析技術包括標記免疫分析、非標記免疫分析和儀器免疫分析。本試劑盒利用的含有稀土元素的羧基乳膠微球標記免疫分析技術是屬于標記免疫分析之一種。

熒光免疫分析(fia)和放射免疫分析(ria)自問世以來，經歷了幾十年的發展，但是人們越來越感覺到fia因自然本地太高，干擾檢測結果；ria采用同位素標記，對人體有極大危害并給實驗帶來不便。酶免疫分析(eia)也因酶本身不穩定，受其他影響因素較大，推廣應用受到限制。80年代初，人們開始研究用稀土元素代替熒光物質和同位素標記蛋白質或抗體，將時間分辨技術引入到生物檢測領域，建立了新型的超微量時間分辨熒光免疫分析技術(timeresolvedfluoroimmunoassay，簡稱trfia)。該技術采用多學科先進技術，集結了其他免疫分析的特點，在免疫學、分子生物學、細胞學和醫學等領域，取得長足的發展和廣泛應用。

trfia利用了具有獨特熒光特性的3價稀土離子及螯合物為示蹤物代替熒光物質、酶、同位素、化學發光物質，標記抗體、抗原、激素、多肽、蛋白質、核酸探針及生物細胞，待反應體系(如抗原抗體反應、核酸探針雜交、生物素親和素反應以及靶細胞對效應細胞的殺傷效應等)發生后，用trfia檢測儀測定反應產物中的熒光強度。根據產物熒光強度和相對熒光強度的比值，判斷反應體系中分析物的濃度，從而達到定量分析。在通常的熒光測定中，由于測試樣品中含有多種熒光成分，背景熒光(來自樣品中的膠體顆粒和溶劑分子引起的散射光以及血清中蛋白質和其他化合物發出的非特異性熒光)強度大、干擾強，成為熒光分析法大范圍推廣的瓶頸。trfia之所以能夠成為繼eia、ria之后一種新的靈敏的制法，主要取決于鑭系元素獨特的熒光特點、檢測中采用的波長分辨和時間延遲技術以及解離-增強技術。

鑭系元素(lanthanide,ln)屬于稀土元素，共有17中，常用于trfia主要有銪(eu)、釤(sm)、鋱(tb)、鏑(dy)。鑭系元素具有獨特的熒光發光特點，與普通熒光相比，鑭系離子螯合物熒光衰變時間長，為傳統熒光的10³-10⁶倍。如鑭系離子螯合物的熒光衰變時間在60-900μs，常用的eu³⁺熒光衰變時間為714μs，普通熒光免疫分析中熒光團的熒光衰變時間只有1-100μs，樣品中一些蛋白質的熒光衰變時間僅為1-10μs，因此利用時間分辨技術，延遲一定時間后測量，便可獲得eu³⁺特異性熒光信號。同時由于衰變時間長，eu³⁺標記物在測量時間里可以反復被激發，每次激發后由激發態很快躍遷到基態，就有熒光發出，然后又可被重新激發，如此每秒可有1000次激發，使得trfia熒光標記物的相對比活性很高。鑭系元素熒光光譜的最大特征是激發光與發射光之間的stokes位移較大，eu³⁺激發波長為337nm，發射波長為615nm，stokes位移可達278nm；同時eu³⁺被激發的熒光光帶極窄，熒光的發射峰非常尖銳，可使儀器調整在極窄的波長范圍內測定，這樣就幾乎完全消除了背景熒光的干擾，繼而通過時間延遲和波長分辨，將強特異性熒光和背景熒光辨開(故稱為時間分辨)，使干擾達到幾乎為零。

鑒于以上標記方法及檢測技術的應用，本試劑盒具有良好的檢測特異性、較高的靈敏度、操作的簡便性以及穩定的熒光標記物保證了檢測的準確性。

技術實現要素：
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本發明針對現有技術中存在的缺點和不足，提出了一種利用熒光免疫層析的靈敏性，結合熒光免疫層析分析儀實現的靈敏度高、快捷簡便，可以同時準確定量檢測心肌肌鈣蛋白i、n-端腦利鈉肽前體二合一測定劑盒及制法。

本發明可以通過以下措施達到：

一種心肌肌鈣蛋白i和n-端腦利鈉肽前體二合一測定試劑盒，其特征在于所述試紙卡由下至上依次設有：pvc板、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結合墊上吸附有稀土熒光微球分別標記的抗心肌肌鈣蛋白i、抗n-端腦利鈉肽前體兩種單克隆抗體-微球偶聯復合物，所述稀土熒光微球的直徑為100-250nm，稀土熒光微球含稀土鑭系元素中的一種或幾種，在基態下穩定，在300-400nm的激發光源作用下發射出波長范圍為550-650nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，分別均來源于針對2-6個不同的心肌肌鈣蛋白i、n-端腦利鈉肽前體抗原表位的單克隆抗體細胞株。

本發明所述結合墊的稀土熒光微球的直徑優選是120-200nm；所述稀土熒光微球優選含有一種或幾種稀土鑭系元素；結合墊上稀土熒光微球標記的抗體優選來源于針對2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株。

本發明所述結合墊采用如下步驟制得：將玻璃纖維膜浸泡于150mmtris-hcl處理液中(含1.0％tritonx-100，2.5％bsa，ph7.4)，4℃浸泡2小時，然后取出37℃烘箱烘干4小時，備用。將玻璃纖維膜放在bio-dotxyz3050三維噴點平臺上，用bio-jetquanti300非接觸式微定量噴頭將稀土熒光微球標記的抗心肌肌鈣蛋白i、抗n-端腦利鈉肽前體的兩種偶聯復合物混勻后噴到玻璃纖維膜上，37℃烘干1小時后制得。

本發明中結合墊上的所述稀土熒光微球標記的心肌肌鈣蛋白i和n-端腦利鈉肽前體二合一測定劑盒中兩種單克隆抗體采用如下步驟制得：

步驟1：單克隆抗體細胞株的獲得：分別用心肌肌鈣蛋白i、n-端腦利鈉肽前體分別免疫小鼠，采用標準的單克隆抗體制備方法制備特異性高親和力的單克隆抗體細胞株，對所獲得的單抗細胞株進行配對篩選，根據配對結果和親和力數據優選出用于試劑盒的單抗細胞株；

步驟2：單克隆抗體的制備：采用標準的腹水生產工藝制備并純化抗心肌肌鈣蛋白i抗體、抗n-端腦利鈉肽前體抗體兩種鼠源單克隆抗體，分裝后保存于-20℃備用；

步驟3：稀土熒光微球的醛基化：取5mg稀土熒光微球，用20mm，ph9.5的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗滌3遍，離心速度為12000rpm，時間為5分鐘，最后重懸于100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，加入500μl醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應4小時，采用同樣的離心法洗滌和重懸到100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，置于4℃備用；

步驟4：稀土熒光微球標記的抗心肌肌鈣蛋白i抗體、抗n-端腦利鈉肽前體抗體兩種偶聯復合物的制備：兩種抗體-微球偶聯復合物分別單獨偶聯，操作如下：選取來自2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株的抗心肌肌鈣蛋白i單克隆抗體，按照質量比1:1將2mg心肌肌鈣蛋白i單克隆抗體用上述碳酸鹽緩沖液于4℃透析過夜，然后與上述醛基化的稀土熒光微球混合，4℃反應過夜；然后，加入硼氫化鈉至終濃度5mm，4℃反應4小時；再加入等體積的封閉液(50mmtris-hcl，ph7.4，含2％bsa，5％蔗糖)，4℃封閉過夜；然后用50mmtris-hcl，ph7.4的緩沖液采用離心法洗滌3遍，重懸于100μl的50mmtris-hcl緩沖液中(含1.2％nacl，0.5％bsa，0.1％tween20)，4℃避光保存備用，同樣操作制備抗n-端腦利鈉肽前體抗體-微球偶聯復合物，4℃避光保存備用。

本發明所述包被有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜通過以下步驟制得：

步驟1：采用與結合墊上所用的抗心肌肌鈣蛋白i、抗n-端腦利鈉肽前體兩種單克隆抗體細胞株不同的細胞株，采用標準的腹水生產工藝制備并純化抗心肌肌鈣蛋白i抗體、抗n-端腦利鈉肽前體抗體兩種鼠源單克隆抗體，得到與標記抗體配對的單克隆抗體，分裝后保存于-20℃備用；

步驟2：分別用包被稀釋液將上述兩種鼠源單克隆抗體和羊抗小鼠igg抗體調整濃度到1-3mg/ml，膜液量為1-3μl/cm，將它們分別作為檢測線和質控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進行包被，檢測線和質控線間隔為3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時；

本發明所述樣品墊通過以下步驟制得：將玻璃纖維膜浸泡于含有1.0％tritonx-100，2.5％bsa，0.15mtris緩沖液，ph7.5的處理液中，于4℃浸泡4個小時，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時。

本發明還提供了一種如上所述試劑盒實現的心肌肌鈣蛋白i、n-端腦利鈉肽前體二合一制法，其特征在于包括以下步驟：

步驟1：將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；

步驟2：讀卡：將ic卡放置在干式熒光免疫分析儀標注位置，讀取相關信息，所述熒光免疫層析分析儀是一種光學檢測系統，檢測范圍分別為：ctni：0.20-40ng/ml、nt-probnp:100-20000pg/ml。

步驟3：加樣：取100μl血漿樣本或150μl全血樣本加到一管緩沖液中，充分混勻，垂直滴加100μl混合液至測試卡加樣處；取樣時注意不要吸入氣泡；

步驟4：檢測，可采用自動測試或即時測試兩種模式進行檢測，自動測試：將測試卡插入干式熒光免疫分析儀的承載器上，按測試鍵，儀器將自動對測試卡進行掃描分析檢測，即時測試：測試卡室溫放置10min后，插入干式熒光免疫分析儀的承載器上，點擊即時測試。

本發明提供一種利用稀土羧基乳膠微球標記的熒光免疫層析技術制備的心肌肌鈣蛋白i/n-端腦利鈉肽前體二合一測定試劑盒，同時適合血漿和全血樣本，并適合臨床上單人份檢測，相對于定性膠體金試劑，能定量檢測樣本中的心肌肌鈣蛋白i、n-端腦利鈉肽前體的含量，具有更明確的臨床指導意義，具有操作簡便、反應快速、靈敏度高、特異性強、適合現場檢測和經濟實用等優點。

附圖說明：

附圖1是本發明中試紙卡的結構示意圖。

附圖2是本發明中實施例2的準確度分析結果示意圖。

附圖3是本發明中實施例2的準確度分析結果示意圖。

附圖4是本發明中實施例2的準確度分析結果示意圖。

附圖5是本發明中實施例2的準確度分析結果示意圖。

附圖標記：pvc板1、樣品墊2、結合墊3、硝酸纖維素膜4、吸水墊5。

具體實施方式：

下面結合附圖和實施例對本發明作進一步的說明：

如附圖1所示，本發明首先提出了一種心肌肌鈣蛋白i和n-端腦利鈉肽前體二合一測定試劑盒，盒內設有試紙卡，所述試紙卡由下至上依次設有：pvc板1、樣品墊2、結合墊3、硝酸纖維素膜4和吸水墊5，其中結合墊3上吸附有稀土熒光微球標記的分別抗心肌肌鈣蛋白i、抗n-端腦利鈉肽前體兩種單克隆抗體，所述稀土熒光微球的直徑為150nm，稀土熒光微球包含稀土鑭系元素eu³⁺，在基態下穩定，在337nm的激發光源作用下發射出波長615nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，分別均來源于針對2-6個不同的心肌肌鈣蛋白i、n-端腦利鈉肽前體抗原表位的單克隆抗體細胞株。

所述結合墊3的稀土熒光微球的直徑優選是200nm；所述稀土熒光微球優選含有稀土鑭系元素銪(eu)；結合墊上稀土熒光微球標記的抗體優選來源于針對2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株。

實施例1：

心肌肌鈣蛋白i/n-端腦利鈉肽前體二合一測定劑盒中試紙卡的各組成部分可以通過以下措施制得：

1、樣品墊2的制備：

將玻璃纖維膜浸泡于含有1.0％tritonx-100，2.5％bsa，0.15mtris緩沖液，ph7.5的處理液中，于4℃浸泡4個小時，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時。

2、吸附熒光微球標記抗體的結合墊3的制備：

將玻璃纖維膜浸泡于150mmtris-hcl處理液中(含1.0％tritonx-100，2.5％bsa，ph7.4)，4℃浸泡2小時，然后取出37℃烘箱烘干4小時，備用。將玻璃纖維膜放在bio-dotxyz3050三維噴點平臺上，用bio-jetquanti300非接觸式微定量噴頭將稀土熒光微球標記的心肌肌鈣蛋白i、n-端腦利鈉肽前體兩種偶聯復合物混勻后噴到玻璃纖維膜上，37℃烘干1小時后制得。；

稀土熒光納米微球的醛基化：取5mg稀土熒光納米微球，用20mm，ph9.5的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗滌3遍，離心速度為12000rpm，時間為5分鐘，最后重懸于100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，加入500μl醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應4小時，采用同樣的離心法洗滌和重懸到100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，置于4℃備用；

稀土eu³⁺熒光微球標記的抗心肌肌鈣蛋白i抗體、抗n-端腦利鈉肽前體抗體兩種偶聯復合物的制備：兩種抗體-微球偶聯復合物分別單獨偶聯，操作如下：選取來自2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株的抗心肌肌鈣蛋白i單克隆抗體，按照質量比1:1將2mg心肌肌鈣蛋白i單克隆抗體用上述碳酸鹽緩沖液于4℃透析過夜，然后與上述醛基化的稀土熒光微球混合，4℃反應過夜；然后，加入硼氫化鈉至終濃度5mm，4℃反應4小時；再加入等體積的封閉液(50mmtris-hcl，ph7.4，含2％bsa，5％蔗糖)，4℃封閉過夜；然后用50mmtris-hcl，ph7.4的緩沖液采用離心法洗滌3遍，重懸于100μl的50mmtris-hcl緩沖液中(含1.2％nacl，0.5％bsa，0.1％tween20)，4℃避光保存備用，同樣操作制備抗n-端腦利鈉肽前體抗體-微球偶聯復合物，4℃避光保存備用。

3、包被有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜4的制備：

采用與結合墊上所用的心肌肌鈣蛋白i、n-端腦利鈉肽前體兩種單克隆抗體細胞株不同的細胞株，采用標準的腹水生產工藝制備并純化抗心肌肌鈣蛋白i抗體、抗n-端腦利鈉肽前體抗體兩種鼠源單克隆抗體，得到與標記抗體配對的單克隆抗體，分裝后保存于-20℃備用；

分別用包被稀釋液將上述兩種鼠源單克隆抗體和羊抗小鼠igg抗體調整濃度到1.5mg/ml，膜液量為1.5μl/cm，將它們分別作為檢測線和質控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進行包被，兩條檢測線之間以及與質控線間隔為3mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時。

試紙卡的組裝：在pvc板1上依次粘貼經過處理的樣品墊2、吸附有稀土熒光標記的抗體的結合墊3、包被有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜4和吸水墊5，組裝后得到試紙大板，按照要求切割成4mm寬，將試紙裝入塑料卡內形成試紙卡。

上述各步驟中選用的設備及原料優選以下原料：

心肌肌鈣蛋白i、n-端腦利鈉肽前體兩種特異性配對抗體；心肌肌鈣蛋白i、n-端腦利鈉肽前體兩種質控品：英國朗道實驗診斷有限公司；稀土熒光微球：上海甄準生物科技有限公司；硝酸纖維素(nc)膜：millipore公司產品；牛血清白蛋白(bsa)，聚乙二醇peg20000，水解酪蛋白：sigma產品，其它常用試劑均為分析純試劑。

實施例2：準確度試驗

選用上述試紙卡以及熒光免疫層析分析儀(型號：neo-007)，

熒光免疫分析儀參數的設定：在熒光免疫分析儀上設定好試紙卡工藝參數后，取上述組裝好的試紙卡，分別用0.2、1、5、10、20、30、40ng/ml的ctni，100、1000、2000、5000、10000、15000、20000pg/ml的nt-probnp校準品，用試紙卡進行測定，得到各校準品的熒光強度值，將結果輸入到分析儀的參數中，完成分析儀的參數的設定。

主要檢測材料：臨床樣本由相關醫院獲得，共200份膠乳增強免疫比濁法定值樣本，其中血漿樣本100份，全血樣本100份，心肌肌鈣蛋白i/n-端腦利鈉肽前體含量分布區間分別為：ctni：0.20-40ng/ml、nt-probnp:100-20000pg/ml、。

制法：

步驟1：將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；

步驟2：讀卡：將ic卡放置在干式熒光免疫分析儀標注位置，讀取相關信息；

步驟3：加樣：取100μl血漿樣本或150μl全血樣本加到一管緩沖液中，充分混勻，垂直滴加100μl混合液至測試卡加樣處，取樣時注意不要吸入氣泡；步驟4：檢測，可采用自動測試或即時測試兩種模式進行檢測，自動測試：將測試卡插入干式熒光免疫分析儀的承載器上，按測試鍵，儀器將自動對測試卡進行掃描分析檢測，即時測試：測試卡室溫放置10min后，插入干式熒光免疫分析儀的承載器上，點擊即時測試。

試驗結果分析：臨床樣本檢測試劑制備完成后，按制法對所有臨床樣本進行檢測，并分析檢測結果。

試驗結果：

如附圖2-5所示，以實驗系統的檢測值為y軸，以對照系統的測驗值為x軸，繪制散點圖，并進行相關性分析。臨床樣本檢測對200份臨床定值樣本檢測，樣本平均偏差值小于10％，最大偏差小于20％，r2>0.98，一致性系數>0.90。檢測結果表明制備的檢測試劑盒性能良好，適合用于臨床檢測，滿足不同客戶不同檢測場合的差異化需要。

本發明提供一種利用稀土元素作為標記物質的熒光免疫層析技術制備的心肌肌鈣蛋白i/n-端腦利鈉肽前體二合一測定劑盒，適合血漿和全血樣本，并適合臨床上單人份檢測，相對于定性膠體金試劑，能同時定量檢測樣本中的心肌肌鈣蛋白i、n-端腦利鈉肽前體兩種物質的含量，具有更明確的臨床指導意義，具有操作簡便、反應快速、靈敏度高、特異性強、適合現場檢測和經濟實用等優點。