一種病原性副溶血弧菌快速檢測試紙的制作方法

本發明屬于病原微生物檢測制品技術領域，具體涉及一種水產動物病原性副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的快速檢測試紙。

背景技術：

副溶血弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛分布于鹽湖以及魚、蝦蟹和貝類等海產品中，食用被副溶血弧菌污染的食物可引起腸胃功能紊亂、急性腸胃炎、敗血病等疾病，是常見的引起食物中毒或食源性疾病的病原菌。副溶血弧菌屬于弧菌屬，已報道的海水養殖動物病原弧菌有20多種，由于近年來養殖水域生態變化，弧菌已成為海水養殖動物的主要病原菌之一，且常發生多種(血清型或亞種)弧菌的混合感染，其中副溶血弧菌與哈維氏菌弧菌、溶藻弧菌是海洋生物尤其是海水魚類弧菌病的主要致病菌，給水產養殖業造成巨大經濟損失。有效快速的檢測診斷是及早預防和控制該病原菌傳播以及食源性中毒與疾病發生的關鍵。

目前常用的副溶血弧菌的檢測方法有免疫酶聯反應、環介導等溫擴增技術(LAMP)、聚合酶鏈式反應(PCR)、實時定量PCR等，但這些技術在實用性上皆有一定的局限，耗時長，操作復雜，需要專業設備和技術人員，不適用于普通養殖人員在現場對副溶血弧菌的實時檢測。膠體金免疫層析試紙具有易于攜帶、操作簡便快捷、結果肉眼可見、不需要專業人員和設備、經濟實用等優點，是一種十分有發展前景的現場快速檢測技術，近年來在生物醫學領域特別是醫學檢驗中得到廣泛應用。水產動物中雖已制備多種養殖動物病原的單(多)克隆抗體，但現場快速檢測試紙技術未能得到很好地開發，目前僅有幾種病毒性和細菌性病原的快速檢測試紙，尚無副溶血弧菌膠體金快速檢測試紙。

細菌是多種抗原成分組成的復合體，其抗原包括菌體抗原、鞭毛抗原、莢膜抗原和菌毛抗原等，可誘導機體產生抗體，因此，可利用抗原-抗體特異性反應原理以達到確診病原的目的。但是，因分類地位相近，弧菌間甚至弧菌與其他屬病原菌之間常具有共同的抗原性蛋白，導致不同菌之間存在交叉免疫反應性，從而對檢測結果的準確判定造成干擾，因此，排除其他菌的交叉反應的干擾而準確判定某種病原菌感染是免疫學技術檢測病原時需要解決的關鍵問題。通常的解決方案是通過篩選病原菌獨有的抗原成分或特異性抗體，但是共同抗原的存在增加了篩選難度，工作量較大。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種簡便、快速、特異性強的水產動物病原性副溶血弧菌快速檢測試紙，其檢測結果肉眼可見，不需要專業儀器設備，適用于養殖現場的蝦類、蟹類、魚類等病原性副溶血弧菌的快速檢測。

本發明提供的病原性副溶血弧菌快速檢測試紙，包括載體板、樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，樣品墊和吸水墊位于載體板的兩端，硝酸纖維素膜位于載體板的中部；樣品墊與硝酸纖維素膜交界處設有載有金標兔抗副溶血弧菌抗體的金標墊，金標墊一端邊緣重疊在樣品墊之下，另一端邊緣重疊在硝酸纖維素膜之上；硝酸纖維素膜上從靠近金標墊一側開始設有依次排列的四條檢測線T1、T2、T3、T4和一條質控線C，其中四條檢測線T1、T2、T3、T4分別是副溶血弧菌的外膜蛋白(T1)、鞭毛蛋白(T2)、胞外產物(T3)和全菌破碎蛋白(T4)；靠近吸水墊的質控線C為羊抗兔IgG。

所述的兔抗副溶血弧菌抗體，制備方法如下：

將副溶血弧菌擴大培養，并將病原菌濃度調至1×10⁸CFU/mL，福爾馬林滅活后，分4次免疫純種新西蘭大白兔；第一次混入弗氏完全佐劑，背部皮下注射免疫，間隔一周后加強免疫，將副溶血弧菌與弗氏不完全佐劑混勻，背部皮下注射免疫，間隔兩周后重復一次；最后一次于耳緣靜脈免疫，一周后取血，分離得到血清，辛酸-硫酸銨法純化得到兔抗副溶血弧菌抗體。

所述副溶血弧菌外膜蛋白，制備方法如下：

副溶血弧菌擴大培養，離心后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌、重懸至原體積1/25，加入少量10％蔗糖，混勻后-20℃下作用15min；室溫下加入等體積0.4％Triton-X100，作用一段時間后離心取上清，加入2.5倍體積冰乙醇-20℃過夜；離心取沉淀，洗滌重懸后，加入等體積KI溶液，37℃作用1h；離心取上清，加入2.5倍體積冰乙醇-20℃過夜；離心取沉淀，重懸后透析、凍干得到副溶血弧菌外膜蛋白。

所述的副溶血弧菌鞭毛蛋白，制備方法如下：

副溶血弧菌擴大培養，離心后PBS洗滌、重懸至原體積1/20，用1mol/L HCl調整pH＝2.0，攪拌30min；低溫離心取上清，然后低溫超高速離心再取上清；用1mol/L NaOH調整pH中性，加入(NH₃)₂SO₄，4℃放置過夜；低溫超高速離心，取沉淀，重懸后透析、凍干得到副溶血弧菌鞭毛蛋白。

所述的副溶血弧菌胞外產物，制備方法如下：

將副溶血弧菌接種于液體培養基中培養24h，取液體培養物涂布于預先放置了一層玻璃紙的固體瓊脂平板上，37℃培養36h；每平板用少量PBS洗下菌體，收集后4℃下高速離心；上清液經微孔濾膜過濾，加入(NH₄)₂SO₄，4℃放置過夜；低溫離心取沉淀，重懸后透析、凍干得到副溶血弧菌胞外產物。

所述的副溶血弧菌全菌破碎液，制備方法如下：

副溶血弧菌擴大培養，將菌液置于超聲波破碎儀中低溫破碎10min，所得即為全菌破碎液，凍干得到副溶血弧菌全菌破碎蛋白。

本發明提取病原菌多種抗原蛋白特異地排列組合起來，在試紙上與待檢測樣品同時進行反應，并在檢測線T4上特別設置了全菌破碎蛋白，解決了其他菌的共同抗原導致的免疫交叉反應干擾結果判定的問題，可以準確地區分陽性結果和交叉反應。

附圖說明

圖1：本發明副溶血弧菌快速檢測試紙條的結構示意圖。

1.樣品墊；2.金標墊；3.硝酸纖維素膜；4.吸水墊；5.載體底板；6.檢測線T1；7.檢測線T2；8.檢測線T3；9.檢測線T4；10.質控線C。T1、T2、T3、T4線分別為外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌蛋白。C線為羊抗兔IgG。

圖2：本發明副溶血弧菌快速檢測試紙條的檢測結果示意圖。

Ⅰ：副溶血弧菌陽性結果；Ⅱ：副溶血弧菌陰性結果；Ⅲ：副溶血弧菌陰性結果，但有其他菌的免疫交叉反應；Ⅳ：試紙失效或本次操作出現問題。

圖3：本發明副溶血弧菌快速檢測試紙檢測5種弧菌的結果圖。

Ⅰ：鰻弧菌檢測結果；Ⅱ：魚腸弧菌檢測結果；Ⅲ：溶藻弧菌檢測結果；Ⅳ：哈維氏弧菌檢測結果；Ⅴ：PBS檢測結果；Ⅵ：副溶血弧菌檢測結果。

圖4：本發明副溶血弧菌快速檢測試紙最低檢測限圖。

圖5：本發明的實施例5中試紙條實際應用的檢測結果圖。

具體實施方式

申請人在研究中發現，副溶血弧菌的魚抗血清與其外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌蛋白皆發生特異性反應，說明這些蛋白具有較好的抗原性；另外，其魚抗血清與副溶血弧菌反應最強烈，但與鰻弧菌、溶藻弧菌、魚腸道弧菌、河流弧菌和哈維氏弧菌等其他弧菌存在程度不等的交叉反應，這是因為其他弧菌與副溶血弧菌具有某些共同抗原，共同抗原在免疫檢測過程中會導致交叉反應，從而對陽性結果的判定造成干擾。

副溶血弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌蛋白全部能夠同時與副溶血弧菌的抗血清發生陽性反應，但其他菌的抗血清只能與共同抗原發生陽性反應，因此，所有抗原全部發生反應即為陽性，部分抗原發生反應則為交叉反應，依此可以準確排除交叉反應對陽性結果的干擾，保證檢測結果的準確性。

在上述分析的結果上，申請人將副溶血弧菌四種特異性抗原組分作為試紙條的四條檢測線，其中，T4檢測線特別設計為全菌蛋白，如果待測樣品中含有副溶血弧菌，則與檢測線上的四種抗原競爭結合金標墊上的金標兔抗副溶血弧菌抗體，待測樣品液擴散到金標墊時，金標兔抗副溶血弧菌抗體與待檢樣品中副溶血弧菌結合，形成金標抗體-菌復合物，并封閉金標抗體中副溶血弧菌特異性抗原的結合位點，阻止金標抗體與硝酸纖維素膜上檢測線T1、T2、T3和T4上的抗原蛋白結合，則T1-T4線皆無紅色條帶出現，結果為陽性；當復合物擴散至質控線(C線)處，被該處的羊抗兔IgG所俘獲，聚集而形成肉眼可見的條帶。相反，若待測樣品中不含有副溶血弧菌，待測樣品液擴散至金標墊時未形成金標抗體-菌復合物，金標抗體與T1、T2、T3和T4線上的四種抗原反應而形成肉眼可見的條帶，4條檢測線全部顯色，結果為陰性。如果待測樣品中含有其他具有共同抗原的病原菌，金標副溶血弧菌抗體與其共同抗原結合形成金標抗體-菌復合物，則T1-T3線中1-3條線因含有的共同抗原不與金標副溶血弧菌抗體反應而顏色變淺或者不顯色，由于T4線上特別設置了副溶血弧菌全菌蛋白，其中含有的共同抗原不與金標副溶血弧菌抗體反應，從而T4線顏色變淺，但是T4線上還含有除共同抗原以外的副溶血弧菌其他抗原蛋白，其與金標抗體反應從而使T4線一定顯現紅色，因此，只要出現C線及T4線顯色、T1-T3線中1條或幾條線不顯色，則檢測結果為其他菌的交叉反應。本發明通過在檢測層上設置副溶血弧菌的多種抗原組分作為多條檢測線，其中T4檢測線上特別設置全菌蛋白，實現在無需篩選副溶血弧菌特有抗原/抗體、不排除掉其他病原菌可能含有的共同抗原的情況下，準確鑒別副溶血弧菌陽性結果與交叉反應；尤其在其他病原菌與副溶血弧菌含有多種共同抗原情況下，因在T4線上設置全菌蛋白而確保將交叉反應與副溶血弧菌陽性進行準確鑒別。

一、本發明的試紙的制備方法如下：

(1)金標墊的制備

①膠體金及金標兔抗的制備

采用微波爐-檸檬酸三鈉還原法制得顆粒大小為20nm的膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀溶液調節膠體金pH值為8.4；將兔抗副溶血弧菌按合適的比例加入膠體金中，再加入BSA，離心純化后用金標保存液懸起，即為金標兔抗液體。

②金標墊的制備

將制成的金標兔抗液體噴涂在玻璃纖維上，并冷凍干燥。

(2)硝酸纖維素膜的檢測層設計與制備

檢測層是根據抗原芯片原理設計。利用抗原芯片法原理，將病原菌的多種抗原組分排列在一起與病原菌抗體同時進行反應，則該菌的所有抗原成分皆與該菌的抗體發生陽性反應，而其他菌只有共同抗原與該菌抗體發生交叉反應，可以依此區分病原菌感染與交叉反應，所以檢測層設計為病原菌多種抗原組分同時使用。另外，考慮到所檢測病原菌與其他菌含有多種共同抗原的情況，特別設置一條檢測線使其一定含有除共同抗原以外的抗原組分，以便能夠準確區別交叉反應與陽性結果。由此，分別將不同濃度的副溶血弧菌四種抗原組分，按照一定間距和一定順序噴涂于硝酸纖維膜上作為檢測線T1、T2、T3和T4，且T4線特別設置為全菌破碎蛋白；將羊抗兔IgG噴涂于硝酸纖維膜上作為質控線；晾干，于封閉液中浸泡后洗滌并干燥。

(3)副溶血弧菌快速檢測試紙的制作

在載體板上依次貼上硝酸纖維素膜、吸水墊、金標墊和樣品墊，再用切條機切成3.75mm寬的試紙條，裝入塑料卡盒后，密封于鋁箔袋中保藏。

二、在本發明中，副溶血弧菌快速檢測試紙的最低檢測限的研究方法如下：

將純化好的病原菌用PBS調至四個濃度梯度，用副溶血弧菌快速檢測試紙檢測菌液。當某個濃度時，檢測線T1-T4出現全部或部分顯色，則這個濃度的高一級濃度為檢測試紙的最低檢測限。

三、在本發明中，副溶血弧菌快速檢測試紙的檢測副溶血弧菌四種抗原蛋白的特異性并確定抗原劃線濃度的操作如下：

將制備好的四種副溶血弧菌抗原蛋白包被96孔酶標板中，每個蛋白設三個平行，并以無菌PBS作為陰性對照，4℃過夜。吸出包被液，用含0.05％Tween-20的PBS洗滌，每次5min，洗3次。每孔加入3％牛血清白蛋白(BSA)，37℃封閉1h，洗滌3次。每孔加入兔抗溶藻弧菌抗體(1:2000稀釋)，37℃孵育1h，洗滌3次。每孔加入堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG(1:8000稀釋)，37℃孵育1h，洗滌3次。每孔加入底物顯色液于暗處反應10-20min，加入NaOH溶液終止顯色反應，檢測405nm處的OD值。

以包被PBS為陰性對照，測定波長為405nm時各孔的光吸收值，計算各實驗孔與陰性對照的光吸收值之比(P/N)，當P/N≥2.1時為陽性，計算四種抗原蛋白間的P/N比值，并根據結果確定副溶血弧菌快速檢測試紙檢測層四條檢測線的劃線濃度比例。

四、利用副溶血弧菌快速檢測試紙對待測樣品進行檢測，步驟如下：平放本發明試紙檢測卡，向樣品孔中滴加檢測樣品液100μl，等待10～15min，肉眼觀察檢測結果，根據檢測線T1、T2、T3和T4顯色情況來判斷是否感染副溶血弧菌。

檢測結果判定：

Ⅰ：C線呈現紅色條帶，T1、T2、T3、T4線皆不顯色，結果為副溶血弧菌陽性；

Ⅱ：C線呈現紅色條帶，T1、T2、T3、T4線皆出現紅色條帶，結果為副溶血弧菌陰性，或者該菌濃度低于試紙檢測限；

Ⅲ：C線呈現紅色條帶，T4檢測線顯紅色，T1、T2、T3線中1-3條線不顯色，結果為副溶血弧菌陰性，但感染了與副溶血弧菌抗原存在交叉反應的其他病原菌，結果判定為其他菌的交叉反應。

Ⅳ：C線不顯色，試紙失效或本次操作出現問題，檢測結果無效。

下面通過具體實施例來進一步說明本發明。

實施例中所需儀器以及試劑：

冷凍離心機(Sigma公司)；高速冷凍離心機(美國Beckman公司)；超高速離心機(日本Hitachi公司)；噴膜儀XYZ3060(Biodot公司)；半自動貼膜儀LM5000(Biodot公司)；切條儀(Biodot公司)；檸檬酸三鈉(購自中國上海試劑一廠，分析純)；氯金酸(購自Sigma公司，分析純)，羊抗兔IgG(購自索萊寶公司)；牛血清白蛋白(購自Sigma公司)；Tween-20(購自索萊寶公司)；硝酸纖維素膜(購自Whatman公司)。

實施例1：副溶血弧菌快速檢測試紙金標墊的制備

1.兔抗副溶血弧菌抗體的制備、純化及效價測定

(1)兔抗副溶血弧菌抗體的制備

①37℃下將副溶血弧菌擴大培養24h，0.01mol/L無菌PBS洗滌3次，重懸菌液，調整至1×10⁸CFU/mL。向菌液中加入一定量的福爾馬林，滅活24h。次日取菌液平板劃線檢查滅活程度。

②分四次免疫新西蘭大白兔，每次間隔一周。第一次免疫，取菌液按照1:2(v:v)混合弗氏完全佐劑，背部6點注射，每點0.2mL。第二次免疫，取菌液按照1:2(v:v)混合弗氏不完全佐劑，背部6點注射，每點0.2mL。后兩次免疫不加佐劑，每次注射0.6mL菌液。

③第四次免疫一周后，心臟穿刺取全血。取血后，室溫下傾斜放置1h，4℃靜置過夜。次日，4℃下10,000×g離心15min，棄沉淀，獲得血清。

(2)兔抗副溶血弧菌抗體的純化

①向血清加入4倍體積0.06mol/L pH＝4.0醋酸緩沖液，用0.01mol/L NaOH調整血清稀釋液至pH＝4.5。

②室溫下邊攪拌邊緩慢滴加正辛酸，加入量為每1mL血清稀釋液加25μL正辛酸，滴加后繼續攪拌30min。

③4℃下10,000×g離心30min，棄沉淀，收集上清液。上清液用0.45pm微孔濾膜除去懸浮物后，量體積。

④按照10％體積加入0.1mol/L無菌PBS，并用5mol/L NaOH調整pH＝7.4。

⑤上清液4℃遇冷后測量液體總體積，保持4℃下按照277g/L緩慢加入(NH₄)₂SO₄粉末(終濃度達45％飽和度)邊加便攪拌，加完后繼續攪拌30min，4℃靜置過夜。

⑥次日4℃下10,000×g離心15min，棄上清，收集沉淀。沉淀用少量0.01mol/L PBS溶解(為原血清體積的1/10)，透析24h，中途需更換兩次透析液。凍干，稱重，并調至合適濃度，保存于-80℃。

(3)抗體效價測定

酶標板每孔加入100μL 5×10⁷CFU/mL副溶血弧菌菌液包被過夜。次日棄去板內液體，用含0.05％Tween-20的0.01mol/L磷酸緩沖液(PBST，pH＝7.4)洗滌酶標板，每孔加入200μL 3％牛血清白蛋白(BSA)，37℃封閉1h；洗滌酶標板，依次加入100μL梯度稀釋的兔抗副溶血弧菌抗體(表1)，設置3個平行，陰性對照加100μL 0.01mol/L PBS，37℃孵育1h；用PBST洗滌酶標板，每孔加入100μL AP標記羊抗兔IgG抗體37℃孵育1h；洗滌酶標板，每孔加入200μL底物顯色液(含1mg/mL pNPP，0.5mol/L氯化鎂以及體積比為10％的二乙醇胺)避光發色5min，用酶標儀測定OD₄₀₅值。結果顯示，兔抗副溶血弧菌抗體的效價為1×10⁵(表1)。

表1兔抗副溶血弧菌抗體的效價測定

2.膠體金標記兔抗副溶血弧菌抗體的制備

(1)膠體金的制備

取0.01％氯金酸溶液100mL，高檔火沸騰2min，迅速一次性加入少量1％檸檬酸三鈉溶液，放入微波爐中用中檔火繼續加熱3min后，取出冷卻至室溫并補充損失水分，制得顆粒大小20nm的膠體金。用0.1mol/L碳酸鉀溶液和0.1mol/L鹽酸調節pH值至8.4后，室溫中進行抗體標記步驟或保存于4℃。

(2)膠體金標記兔抗副溶血弧菌抗體的制備

取膠體金按照適當比例加入兔抗副溶血弧菌抗體，連續攪拌20min，室溫靜置10min。加入終濃度為1％BSA，連續攪拌15min，室溫靜置10min。將上述溶液經4℃下1,200×g離心15min，棄沉淀取上清液。上清經4℃13,500×g離心30min，棄上清取沉淀，沉淀用金標抗體洗滌液(含1％BSA，0.01mol/L PBS，pH＝8.4)洗滌，再離心，仔細吸去上清液，將沉淀用金標抗體保存液(含3％蔗糖，1％BSA，0.2％Tween-20和0.02％NaN₃的0.01mol/L PBS，pH＝8.4)重懸至原體積1/10，即為金標兔抗副溶血弧菌抗體，避光保存于4℃或立即進行下一步驟。

3.金標墊的制備

將金標兔抗副溶血弧菌抗體液體均勻噴涂于玻璃纖維上，冷凍干燥，避光密封保存于4℃。

實施例2：副溶血弧菌快速檢測試紙檢測層的制備及試紙組裝

1.副溶血弧菌外膜蛋白的制備

①37℃下擴大培養副溶血弧菌，4℃下8,000×g離心15min，洗去培養基，并用0.01mol/L PBS重懸洗滌3次，最后加入PBS濃縮至原體積1/25。

②向收集的菌液中加入少量10％蔗糖溶液，混勻后，在-20℃中處理15min。加入等體積0.4％Triton X-100(PBS)，在室溫下混勻，作用10min。4℃下12,000×g離心15min，取上清。加入2.5倍體積冰乙醇，混勻后，在-20℃下放置過夜。次日，4℃12,000×g離心15min，高速離心取沉淀。

③沉淀經Tris-NaCl(pH＝7.4)洗滌后，加入等體積0.6mol/L KI溶液，混勻后，37℃水浴1h。4℃下12,000×g離心15min，取上清。加入2.5倍體積冰乙醇，混勻后，在-20℃下放置過夜。次日，4℃下12,000×g離心15min，取沉淀。用10mL 0.01mol/L PBS重懸后，于超純水中透析24h，每6h換一次超純水。凍干后，溶于PBS調至合適濃度，并凍存于-80℃。

2.副溶血弧菌鞭毛蛋白的制備

①37℃下擴大培養副溶血弧菌，4℃下1,500×g離心30min，洗去培養基，0.01mol/L PBS重懸洗滌3次，最后加入無菌生理鹽水濃縮至原體積1/25。

②用1mol/L HCl將收集的菌液pH調整至2.0，室溫下不斷攪拌30min，并且保持pH＝2.0。4℃下1,500×g離心30min，取上清。4℃下533,000×g離心上清液1h，棄沉淀，取上清。上清液用1mol/L NaOH調整pH至7.2，并緩慢地加入(NH₄)₂SO₄至終濃度為2.67mol/L，冰浴攪拌30min。將混合液4℃放置過夜。次日，4℃下533,000×g離心15min，棄上清，取沉淀，并溶于一定量0.01mol/L PBS中，透析24h，每6h換一次透析液。凍干后，溶于PBS中調制合適濃度，并保存于-80℃。

3.副溶血弧菌胞外產物的制備

①將副溶血弧菌接種于營養瓊脂液體培養基，37℃搖床培養24h。取1mL液體培養物涂布在預先放置了一層玻璃紙的營養瓊脂平板上，37℃培養24-48h。

②每平板用6mL 0.01mol/L PBS洗下菌體，收集菌懸液在4℃下7,000×g離心30min，上清經0.22pm微孔濾膜過濾取出剩余菌體后，加入終濃度為2.0mol/L的(NH₄)₂SO₄，室溫下攪拌1h，4℃沉降過夜。次日，4℃下10,000×g離心1h取沉淀，溶于一定量0.01mol/L PBS中，于超純水中透析24h，每6h換一次超純水凍干后后，溶于PBS中調制合適濃度，并凍存于-80℃。

4.副溶血弧菌全菌破碎蛋白的制備

將副溶血弧菌接種于營養瓊脂液體培養基，37℃擴大培養24h。4℃下5,000×g，離心15min，0.01mol/L PBS洗滌重懸3次。將菌液調整至1×10⁸CFU/mL，超聲波破碎機破碎(Sonics&Materials；振幅39％；pulse on，3sec；pulse off，3sec)至液體澄清，即為副溶血弧菌破碎菌樣品，用PBS調整至適合濃度，凍存于-80℃。

5.雙抗夾心ELISA檢測副溶血弧菌四種抗原蛋白的特異性并確定抗原劃線濃度

①將制備好的四種副溶血弧菌抗原蛋白包被96孔酶標板中(100μL/孔)，每個蛋白設三個平行，并以無菌PBS作為陰性對照，4℃過夜。

②吸出包被液，用含0.05％Tween-20的PBS(PBST：含0.05％Tween-20的0.01mol/L PBS，pH＝7.4)洗滌，每次5min，洗3次。

③每孔加入200μL 3％的牛血清白蛋白(PBS配制)，37℃封閉1h，同②法洗滌3次。

④每孔加入100μL兔抗副溶血弧菌抗體(1:2,000稀釋)，37℃孵育1h，同②法洗滌3次。

⑤每孔加入100μL堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG(1:8,000稀釋)，37℃孵育1h，同②法洗滌3次。

⑥每孔加入200μL底物顯色液，暗處反應10-20min，每孔加入50μL 2mol/L NaOH溶液終止顯色反應，檢測405nm處的OD值。

以包被PBS為陰性對照，測波長為405nm時各孔光吸收值，計算各實驗孔與陰性對照光吸收值之比(P/N)，當P/N≥2.1時為陽性，計算四種抗原蛋白間的P/N值的比值，根據結果確定副溶血弧菌快速檢測試紙檢測層四條檢測線的劃線濃度比例。所得的T1、T2、T3、T4線上四種抗原蛋白的劃線濃度分別為外膜蛋白0.8mg/mL、鞭毛蛋白0.3mg/mL、胞外產物1.0mg/mL、全菌破碎蛋白0.4mg/mL。

6.副溶血弧菌快速檢測試紙檢測層的制備

用0.01mol/L PBS將副溶血弧菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌破碎蛋白的濃度分別調整至0.8mg/mL、0.3mg/mL、1.0mg/mL和0.4mg/mL，用噴膜儀分別將外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌破碎蛋白噴涂于硝酸纖維素膜上作為檢測線T1、T2、T3和T4，四條檢測線之間相距1.5mm。用0.01mol/L PBS調整羊抗兔IgG的濃度為0.5mg/mL，將其噴涂于硝酸纖維膜上作為質控線(C線)，質控線與檢測線T4相距5mm，質控線靠近吸水墊(圖1：4)，檢測線T1靠近樣品墊(圖1：1)。將包被好的硝酸纖維素膜室溫干燥后，在37℃下封閉液(含3％BSA，0.01mol/L PBS，pH＝7.4)浸泡1h，PBST漂洗3次，每次5min，干燥。

7.副溶血弧菌快速檢測試紙的制作

在載體底板(圖1：5)的一面一次粘貼上硝酸纖維素膜(圖1：3)、金標墊(圖1：2)、樣品墊(圖1：1)和吸水墊(圖1：4)，組裝成試紙條整板。其中硝酸纖維膜上端邊緣重疊于吸水墊邊緣之下，而硝酸纖維素膜下端邊緣則在金標墊上端邊緣之下，樣品墊的上端邊緣重疊在金標墊的下端邊緣之上(圖1)。

將組裝好的試紙條整版用切條機裁成3.75mm寬的試紙條，裝入包裝卡殼中，并密封保存于有干燥劑的鋁箔袋中。

實施例3：副溶血弧菌快速檢測試紙的檢測方法

(1)檢測樣品的制備

取疑似患副溶血弧菌對蝦鰓、附肢以及血淋巴，或取疑似患副溶血弧菌病魚炎癥組織、腎或血液，每1g組織樣品用5mL 0.01mol/L無菌PBS或0.9％無菌生理鹽水，冰浴條件下充分研磨3～5min，用篩絹過濾得到的研磨液作為檢測樣品液。

(2)副溶血弧菌快速檢測試紙的應用

平放本發明試紙卡，向樣品孔中滴加檢測樣品液100μL，等待10～15min，肉眼觀察檢測結果，根據檢測線T1、T2、T3和T4顯色情況來判斷對蝦或魚是否感染副溶血弧菌。

(3)檢測結果的判斷

Ⅰ：C線呈現紅色條帶，T1、T2、T3、T4線皆不顯色，結果為副溶血弧菌陽性；

Ⅱ：C線及T1、T2、T3、T4線皆出現紅色條帶，結果為副溶血弧菌陰性，或者該菌濃度低于檢測限；

Ⅲ：C線及T4檢測線顯色，T1、T2、T3線出現1條或多條線不顯色，結果為副溶血弧菌陰性，但感染了與副溶血弧菌抗原存在交叉反應的其他病原菌，結果判定為其他菌的交叉反應。

Ⅳ：C線不顯色，試紙失效或本次操作出現問題，檢測結果無效。

同時使用試紙檢測PBS作為陰性對照，C線及T1-T4檢測線皆顯色，各條帶顯色的深淺作為試紙條檢測待檢樣品的參考標準。(圖2)

實施例4：副溶血弧菌快速檢測試紙的特異性、重復性和穩定性測試

(1)特異性

使用本發明試紙檢測純化的鰻弧菌、魚腸道弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌，以PBS為陰性對照。結果顯示，檢測結果為鰻弧菌、魚腸道弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌和PBS使檢測線T1、T2、T3、T4和質控線均顯色(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)，表明副溶血弧菌檢測結果為陰性；副溶血弧菌使檢測線T1、T2、T3和T4均不顯色，質控線顯色(Ⅵ)，表明有副溶血弧菌(圖3)。這些結果表明本發明的快速檢測試紙可以準確區分副溶血弧菌感染與其他菌的交叉反應，具有良好的特異性。

(2)重復性

使用不同批次試紙檢測副溶血弧菌和PBS，每組重復5次，結果無明顯差別。

(3)穩定性

本發明試紙分別以4℃和室溫下避光密封儲存，每隔1個月使用試紙檢測副溶血弧菌和PBS。結果為4℃下儲存有效期為12個月，室溫下有效期為6個月。

(4)試紙條最低檢測限

將純化的副溶血弧菌用PBS調至5×10⁷、5×10⁶、5×10⁵、5×10⁴CFU/mL。用副溶血弧菌快速檢測試紙檢測這4種濃度的菌液(圖4)。結果當5×10⁴CFU/mL時檢測試紙的檢測線T1-T4出現較淺的顯色，則本發明試紙檢測樣品中副溶血弧菌的最低濃度下限為5×10⁵CFU/mL。

實施例5：患病大菱鲆中副溶血弧菌的檢測

患病大菱鲆體表有不同程度的潰瘍，各鰭、肛門紅腫，腹部膨大解剖后發現有大量積血性腹水，肝、脾腫大，并且腸道嚴重出血。無菌操作取病魚肝、脾、腎等組織，每1g組織樣品用5mL 0.01mol/L無菌PBS，冰浴條件下充分研磨3～5min，用篩絹過濾得到的研磨液作為檢測樣品液。健康大菱鲆組織和PBS同時檢測作為陰性對照。

平放本發明試紙檢測卡，向樣品孔中滴加檢測樣品液100μl，等待10～15min，肉眼觀察檢測結果，發現患病大菱鲆樣品液使C線顯紅色，T1-T4檢測線皆不顯色，表明樣品液中具有副溶血弧菌(圖5：ⅲ)。健康大菱鲆組織樣品液和PBS皆使C線及4條檢測線顯紅色(圖5：ⅰ、ⅱ)。

將上述患病大菱鲆的肝、脾、腎等組織研磨液，劃線接種于2216E平板，25℃培養24h，挑取形態一致的優勢菌落進行純化培養，直至獲得純培養菌株，利用生理生化及分子生物學方法進行鑒定，采用16S rRNA和hsp60基因序列的擴增，擴增產物送某基因科技有限公司進行測序，分析結果顯示為副溶血弧菌感染，表明本發明的副溶血弧菌快速檢測試紙具有很好的檢測特異性。