一種酚傳感器的生物電極的制備方法與流程
本發明涉及電化學生物傳感器制備技術領域。
背景技術：
電化學生物傳感器由于體積小、分析速度快、選擇性高等優點在發酵工藝、食品工程、環境監測、臨床醫學、軍事及軍事醫學等方面已經得到高度重視和廣泛應用。它通常是基于由生物分子催化產生或消耗的電子的氧化還原反應，在發生氧化還原反應時在被檢測物、生物電催化活性分子和電極之間會發生電子的傳遞。由法拉第定律可知，氧化還原反應的摩爾數與轉移的電量是呈正比的，因此可以通過測定電子轉移時產生的電流大小來測定被檢測物質的濃度。由于酶的催化具有選擇性高，催化效率高等特性，可以采用適當的方法將所需要的生物活性分子加以修飾并固定到電極的表面，就可以用于分子識別，有選擇性的進行測定。其中分子識別部分是電化學生物傳感的核心。
蛋白質分子在生物體中大量存在，如大部分酶、部分激素、抗體、部分抗原、細胞色素C、血紅蛋白和肌紅蛋白、干擾素等。現有的常用于蛋白質分子的固定方法主要有吸附、交聯、共價鍵合、包埋等，固定材料有無機材料、高分子材料等，各種方法都有其適宜的使用范圍和優缺點，但有一個相同點，就是都會犧牲掉一部分蛋白質的活性。以生物電極為敏感元件的電化學生物傳感器是以電信號的傳導來實現傳感功能的，其中生物界面膜的構筑是制備電化學生物傳感器的關鍵步驟。因此創新生物界面膜的構筑方法以提高電化學生物傳感器測量的準確度、靈敏度、穩定性、選擇性等是科研工作者的主要目標之一。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種靈敏度高、檢測限低、穩定性和重現性好、選擇滲透性好的方法用以固定多酚氧化酶來制備酚傳感器的生物電極。
本發明的技術方案是：將兩親型嵌段共聚物溶于溶劑中配成兩親型嵌段共聚物溶液，再將兩親型嵌段共聚物溶液滴涂于載有半干蛋白質水溶液的電極表面，然后置于恒溫恒濕箱中，待溶劑和水揮發，得到酚傳感器的生物電極。
所述兩親型嵌段共聚物的分子量為5000～500000；所述兩親型嵌段共聚物中的親水段中含有可以在水溶液中電離或水解并帶有電荷的基團；所述兩親型嵌段共聚物中的疏水鏈段為在水溶液中不易降解的疏水性聚合物鏈段；所述溶劑為易揮發且與水不互溶的有機溶劑。
由于兩親型嵌段共聚物的分子量必須達到一定值，否則自組裝的驅動力不夠，因此本發明采用分子量為5000～500000。由于兩親型嵌段共聚物的親水段中含有可以在水溶液中電離或水解并帶有電荷的基團，而蛋白質為兩性物質，其所帶電荷可以通過水溶液的pH值來調節，這樣就可以使其與帶有電荷的兩親型嵌段共聚物發生靜電吸附以誘導生物分子的有序排列，因此其對蛋白質分子的吸附能力可以大大提升。并且在高濕度的環境下，隨著鑄膜液中的有機溶劑揮發，表面溫度急劇下降，高濕度氛圍中的水蒸氣大量冷凝在電極表面。聚合物在親水/疏水的平衡作用下凝結在水滴表面，隨著揮發完畢，溫度回升，電極表面就自組裝形成了六角形的花樣。而粗糙表面利于蛋白質分子的附著，而大小可控的孔徑也可使得電極的響應具有更短的時間和更高的選擇性。因此用該電荷-親疏水雙驅動自組裝法可構筑性能優良的生物活性膜和高穩定、高靈敏度、高選擇性的電化學生物傳感器。
采用本發明方法制備出傳感器檢測限低、靈敏度高、穩定性好、選擇滲透性好，適用性廣、制作簡單，蛋白質分子和載體材料用量少，適宜大規模批量生產。用同一固定材料可制備不同功能的生物傳感器，適合多種物質的檢測，在醫學、食品、環境等領域運用廣泛。
另外，本發明所述帶有電荷的基團為吡啶基。優選的兩親型嵌段共聚物為聚苯乙烯嵌段聚四乙烯基吡啶。聚苯乙烯嵌段聚四乙烯基吡啶是一種聚電解質型兩親性嵌段共聚物，其中聚苯乙烯鏈段為疏水鏈段，而聚4-乙烯基吡啶為親水鏈段且可以在一定條件下產生電離（pKa=9.2）；而多酚氧化酶的pI=4.7-5；因此在pH=6.0時PS-b-P4VP的親水鏈段帶正電，多酚氧化酶帶負電。在電荷親疏水雙驅動自組裝過程中，兩者相互產生靜電作用，從而得到生物分子有序排列的生物界面。
本發明優選的溶劑為氯仿。溶解度參數是衡量聚合物和溶劑是否能夠很好互溶的一個重要指標，氯仿的揮發速度較快，且與水不互溶，是在電極上構筑多孔膜的理想溶劑。水的溶解度參數（δH2O） = 47.3 J1/2·cm-3/2，δCHCl3 = 19.0 J1/2·cm-3/2。因而氯仿是PS-b-P4VP的良溶劑。
所述兩親型嵌段共聚物溶液中，兩親型嵌段共聚物占溶液質量的0.05%。否則無規線團易互相纏結，構象轉換勢壘過大，自組裝難以進行。
所述恒溫恒濕箱內的溫度為25℃，濕度為80%RH。實驗發現在 15～40℃的溫度范圍之間，酶電極的響應電流隨溫度升高而增大，在 40℃左右出現最大響應電流，隨著溫度的繼續升高，響應電流開始逐漸下降。但實驗也發現PPO 從 30～35℃開始就會很快變性。而且在實際應用中25℃是最方便和最常見的，因此選擇25℃。實驗對濕度的要求較高，濕度為80%RH時，在恒溫恒濕箱中干燥快，超過半小時即可。
所述蛋白質的分子為多酚氧化酶。多酚氧化酶是一個四聚體，包含四個銅離子，由兩個芳香族化合物及氧相連。多酚氧化酶是一種可以形成兩種或兩種以上不同形式的均聚物的蛋白，它通常以單體，三聚體，四聚體，八聚體形式存在。多酚在氧的存在下，氧氣會分兩步催化鄰苯二酚的，先是將苯酚鄰位氧化，然后將鄰位雙酚氧化為鄰醌，在反應過程中有電子轉移，固定化 PPO 所得到的生物傳感器在恒電位下可以將酚類物質的濃度與電流信號相關聯。
附圖說明
圖1為改變多酚氧化酶的用量得到的感應電流圖。
圖2為改變鑄膜液的用量得到的感應電流圖。
圖3為改變pH得到的感應電流圖。
圖4為改變掃描電壓得到的感應電流圖。
圖5為溫度對 PS-b-P4VP/PPO 響應電流的影響。
圖6為溫度的倒數與電流密度的對數的關系圖。
圖7為響應電流階梯曲線圖。
圖8為圖7的局部放大圖。
圖9為PS-b-P4VP/PPO 電極對兒茶酚的濃度校正曲線。
圖10為PS-b-P4VP/PPO 電極對兒茶酚的線性范圍圖。
圖11為PS-b-P4VP/PPO電極對不同酚類物質的濃度校正曲線。
圖12為 PS-b-P4VP/PPO 電極的長期穩定性圖。
具體實施方式
一、制備生物電極：
1、采用聚苯乙烯嵌段聚四乙烯基吡啶（PS-b-P4VP）兩親型聚合物與氯仿配制成濃度為0.05%的溶液。
2、將多酚氧化酶溶解在pH為6.0的1mM的磷酸緩沖溶液中。
3、將多酚氧化酶的溶液均勻的滴涂在鉑碳電極表面，待溶劑蒸發至快干后，再滴涂兩親型嵌段共聚物的氯仿溶液。
4、滴涂結束后，立即將電極置于溫度為25℃，濕度為80%RH的恒溫恒濕箱中。
5、待溶劑和水揮發，形成干燥表面，即制得生物電極，再將生物電極放在冰箱中冷藏，待用。
本例中，多酚氧化酶(1mg·mL-1)的用量為6μg、PS-b-P4VP的體積為7μL。
傳感器使用的最佳條件是：測量溫度25℃、工作電位是-200mV、溶液pH為6.0。
二、制備傳感器：
將以上制成的生物電極制成傳感器，該生物傳感器響應快、靈敏度高、線性范圍廣、檢測限低。其對兒茶酚的靈敏度314 mA·M-1·cm-2，線性檢測范圍為 0.12 ~ 30 μM，檢出限為 0.07 μM；固定化多酚氧化酶的酶催化反應的表觀活化能是18 kJ/mol。該傳感器可以用于多種酚類的檢測，對不同酚的檢測靈敏度順序為：苯酚>兒茶酚>對氯苯酚>對甲苯酚，具有良好的穩定性和重現性。
1、分別取質量為3、4、5、6、7、8、9 μg 的 PPO（1 mg·mL-1），滴于六支標記為一到六的玻碳電極上，20min 后滴加 PS-b-P4VP 溶液（0.05 wt%），體積固定為7 μL，然后置于恒溫恒濕箱（25 oC and 80 % R.H.）中干燥。用以上六支電極在 0.1 M（pH = 6.0）的 PB 溶液中（操作電位為–200 mV，溫度為 25 oC）測量對 10 μM 兒茶酚的響應電流。取得如圖1所示的多酚氧化酶的用量與感應電流的關系圖。
由圖1可見：當 PPO 的質量從 3 變化到 6 時，酶電極的響應電流明顯增大，而當PPO 質量從 6 變化到 9 時，酶電極的響應電流減小。因此，多酚氧化酶適宜的用量為6μg。
2、分別取體積為4、5、6、7、8、9、10 μL的PS-b-P4VP氯仿溶液（0.05 wt %），滴加于 6 μg 的 PPO 上，置于恒溫恒濕箱中干燥。在 0.1 M（pH = 6.0）的 PB 溶液中（操作電位為–200 mV，溫度為 25 oC）測量對 10 μM 兒茶酚的響應電流。取得如圖2為所示的鑄膜液的用量與感應電流的關系圖。
由圖2可見：當 PS-b-P4VP 的體積從 4 變化到 7 時，酶電極的響應電流增大，而當 PS-b-P4VP 體積從 7 變化到 10 時，酶電極的靈敏度和響應電流明顯減小。這可能是由于 PS-b-P4VP/PPO 復合膜的厚度較薄時，底物和產物之間可迅速進行跨膜傳輸，PS-b-P4VP增加時對 PPO 的作用增加，使得 PPO 排列更加規整。當形成的 PS-b-P4VP/PPO 復合膜過厚時，增加了分子的擴散阻礙，從而導致響應電流的下降。因此選擇滴加在電極上的 PS-b -P4VP（0.05 wt %）的量為 7 μL。
3、將工作電位控制在–200 mV，溫度控制在 25 oC，在含 10 μM兒茶酚的 0.1 M不同 pH 值的PB 溶液中，測試酶電極的響應電流與溶液 pH 值的關系。取得如圖3所示的pH與感應電流的關系圖。
由圖3可見：在 pH 為 5.0 至 6.0 范圍內，酶電極響應電流隨著溶液pH值的增加而增大，在 pH = 6.0 處左右響應電流出現最大值，隨著被測溶液 pH 值繼續增大，電極的響應電流開始下降。因此，適宜的pH為6.0。
4、將溫度控制在25 oC，pH 控制在 6.0，當電位從 -300 mV 至 -100 mV變化時，測試酶電極響應電流與掃描電壓的關系。取得圖4所示的掃描電壓與感應電流的關系圖。
由圖4可見：當電位從 -300 mV 至 -100 mV變化時，酶電極的響應電流緩慢上升，在–200 mV 時響應電流出現最大值，當工作電位進一步加大時，酶電極響應電流開始出現急速下降。因此適宜的工作電位為-200mV。
5、將電位控制在-200 mV，pH 控制在 6.0，改變溫度，測試酶電極響應電流與溫度的關系。取得圖5的溫度對 PS- b-P4VP/PPO 響應電流的關系圖。
由圖5可見：在 15 oC 至 40 oC 的溫度范圍之間，酶電極的響應電流隨溫度升高而增大，在 40 oC 左右出現最大響應電流，隨著溫度的繼續升高，響應電流開始逐漸下降。但是實驗發現 PPO 從 30?35 °C 開始就會很快變性。而且在實際應用中 25 °C 是最方便和最常見的，因此選用25 °C作為實驗溫度。
6、將圖5中的溫度轉化為開爾文溫度，并取倒數；將圖5得到的電流密度取對數，作圖。取得圖6的溫度的倒數與電流密度的對數的關系圖。
由圖6可見：根據阿倫尼烏斯方程lnk= -Ea/RT + lnA ，其中k 是反應速率常數，Ea是反應活化能，R 是氣體常數，T 是開爾文溫度，A 是阿倫尼烏斯常數。由于反應的量等效于電子轉移的數量，因此k 與響應電流成正比。可用 lnj 代替lnk ，這樣 lnj ~ T-1的斜率就是 -Ea/ R，截距就是 lnA 。可知斜率為 -Ea/R = -2.19×103 K 計算得出Ea = 18 kJ·mol-1。
7、在pH值為6.0的磷酸緩沖溶液中在一個恒定的電位（–200 mV vs. SCE）下測試了 PS-b -P4VP/PPO 電極對兒茶酚的催化能力。在快速攪拌下，每隔 100 s，往 10 mL的 PB 溶液中滴加一定量的兒茶酚，得到階梯曲線。取得圖7的響應電流階梯曲線圖。
由圖7可見：兒茶酚的濃度較低時酶電極的響應電流隨溶液濃度的增大而增加，并且兩者之間呈現較好的線性關系，這為用該電極來測量較低濃度的兒茶酚提供了可能性。
圖8為圖7的局部放大圖。
8、由圖7讀出每個濃度下兒茶酚對應的響應電流。見圖9的PS- b-P4VP/PPO 電極對兒茶酚的濃度校正曲線。
9、圖10為PS-b -P4VP/PPO 電極對兒茶酚的線性范圍圖。是圖 9的線性部分。
由圖10可見：斜率為 22，結合玻碳電極的面積，計算得出 PS-b -P4VP/PPO 電極對兒茶酚的靈敏度為 314 mA·M-1·cm-2。根據信噪比S /N = 3，階梯曲線的噪音為 1 × 10-9 A，信號達到 3 倍于噪音時，S 為 3 × 10-9 A，檢出限為 0.07 μM。同時可以看出 PS-b -P4VP/PPO 電極對兒茶酚的線性范圍為 0.12 ~ 30 μM（R = 0.995）。
10、圖11為PS-b -P4VP/PPO電極對不同酚類物質的濃度校正曲線，其中：a）兒茶酚、b）對甲苯酚、c）苯酚、d）對氯苯酚。是在多酚氧化酶(1mg·mL-1)的用量為6μg、PS-b-P4VP的體積為7μL、控制電位在-200mV、pH為6.0、溫度為25 °C時改變酚類物質得到的。
由圖11可見：
（1）該電極對其他三種酚類化合物均有響應，濃度電流曲線的趨勢與對兒茶酚的響應相類似，即當底物濃度在較小的范圍內變化時，響應電流值隨底物濃度的升高而呈線性增長的趨勢，而當底物濃度超過一定值逐步變大時，響應電流則漸漸呈現出平緩趨勢。
（2）由圖11也可得到不同酚類物質的線性范圍圖，從而得到各自酚類所對應的斜率，結合玻碳電極的面積，計算得出 PS-b -P4VP/PPO 電極對不同酚類物質的靈敏度。根據信噪比，階梯曲線的噪音，可以得到不同酚類物質的檢出限。讀出飽和電流，然后通過達到飽和電流一半時對應的兒茶酚濃度來計算米氏常數。匯總得到表1。
表1 PS-b -P4VP/PPO 電極對不同酚類的電催化性能
由上表可見：PS-b -P4VP/PPO生物電極對不同酚的檢測靈敏度順序為：苯酚>兒茶酚>對氯苯酚>對甲苯酚。
11、制備六根相同的多孔 PS-b -P4VP/PPO 電極，測定它們在–200 mV vs. SCE 下對 10 μM 兒茶酚的響應電流，六根電極的響應電流的相對標準偏差為 3.43%；將電極儲存在 4°C 的冰箱中，每隔幾天，在室溫下測量電極在–200 mV vs. SCE 下對 10 μM 兒茶酚的響應電流。取得圖12的 PS-b -P4VP/PPO 電極的長期穩定性圖。
由圖12可見：30天后電極的響應電流（i ）仍能保持初始電流（i0）（0.24 μA）的87.3%。這些結果表明，通過電荷-親疏水雙驅動自組裝法構筑的PS-b -P4VP/PPO 電極具有令人滿意的重復性和長期穩定性。
- 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊！