一種比率型稀土熒光探針及檢測炭疽桿菌生物標志物的應用的制作方法

本發明涉及分析化學技術領域，尤其涉及一種雙稀土金屬離子摻雜的比率型熒光探針及該探針在檢測炭疽桿菌生物標志物濃度的用途。

背景技術：

炭疽芽孢桿菌是革蘭氏陽性形成芽孢的需氧菌，炭疽是食草動物的一種主要疾病，接觸土壤中、皮毛上的芽孢可以導致感染。芽孢可以通過呼吸道、消化道和皮膚接觸感染人類，以皮膚型炭疽最常見。由于炭疽芽孢在環境中的抵抗力極強，在軍事方面，一直被列為是頭號生物戰劑，作為一個炭疽芽孢桿菌殼層的主要組成成分，2,6吡啶二羧酸（dpa）占據了約5-15%的干炭疽桿菌芽孢質量，因此可以通過定量檢測dpa的含量來間接檢測炭疽芽孢桿菌。

過去幾十年間，國內外科學家已經采取各種各樣的方法實行對dpa的定量檢測，包括表面增強拉曼法，電化學檢測方法等。然而，這些方法大多要求較長的時間花費，操作復雜的儀器和昂貴的試劑。因此，開發一種簡單便宜，靈敏便攜的檢測方法對于阻止炭疽桿菌生物標志物的危害而言具有重大意義。

在儀器分析方法出現之前，就有利用比色分析原理進行待測物檢測的分析方法。化學比色法利用溶液的顏色差異來確定出不同濃度，具有簡便快速，大批量檢測的優點。但是，該方法存在背景光線影響較大，顏色判斷主觀性較強，不能實現定量分析自動化等缺點。而圖像處理和顏色識別技術的發展使得顏色色度量化成為可能。將圖像顏色識別技術和化學比色檢測結合將帶來一種新的定性定量分析方法。目前，圖像照片的色彩模式主要以紅綠藍（rgb）顏色標準模式為主，是通過對紅（r），綠（g），藍（b）3個顏色通道的變化及它們之間的相互疊加來得到各種顏色，這3個標準顏色幾乎包括了人類視力所能感知的所有顏色，是運用最廣的顏色系統之一，任何一個顏色都可以由一組rgb值來記錄和表達。

技術實現要素：

本發明的目的是針對現有技術的不足而提供的一種稀土金屬離子摻雜的比率型熒光探針及該探針用于檢測dpa的應用，以克服現有檢測dpa的方法中復雜的前期準備及昂貴的大型儀器使用，難以實現精確、簡易、便攜快速檢測的缺陷。

實現本發明目的具體技術方案是：

一種比率型稀土熒光探針，特點是：將稀土鋱離子溶液(tb³⁺)和吡啶二羧酸（dpa）通過反向微乳液法合成得到結構式為tb/dpa@sio2的前驅體；經離心洗滌配制濃度范圍為0.5~1mg/ml水溶液后加入等摩爾比的稀土銪離子溶液eu³⁺和鳥嘌呤核糖核苷酸溶液(gmp)，經震蕩反應后，離心洗滌得到結構式為tb/dpa@sio2-eu/gmp的熒光探針；利用tb³⁺的熒光強度值與eu³⁺的熒光強度值兩者的比值構成比率型稀土熒光探針tb/dpa@sio2-eu/gmp。

所述反向微乳液組成為體積比例為：正己醇︰曲拉通x-100︰環己烷︰正硅酸乙酯溶液(teos)=200︰200︰800︰17。

所述稀土銪離子溶液eu³⁺和鳥嘌呤核糖核苷酸溶液(gmp)的最終反應濃度為0.5~2mm。

一種基于比率型稀土熒光探針用于炭疽桿菌生物標志物dpa的檢測方法，特點是：在含tris-hcl緩沖液的溶液中加入tb/dpa@sio2-eu/gmp熒光探針，待溶液穩定后加入待測dpa溶液進行反應，發生熒光增強現象，通過時間分辨熒光分析方法來測定dpa的濃度；其中：所述熒光探針溶于水形成濃度為0.1~0.2mg/ml的tb/dpa@sio2-eu/gmp水溶液；所述緩沖液的溶液濃度為20~50mm，ph值為4～9；所述反應溫度為5～35℃，所述待測dpa溶液的濃度為0.025～2μm。

所述熒光探針最低檢測線為7.3nm的dpa溶液，可實現高靈敏度，高選擇性的dpa濃度檢測。

一種基于比率型稀土熒光探針的試紙，特點是，將普通濾紙剪成直徑為5~8mm的圓形紙片，浸泡在濃度為1~5mg/ml熒光探針溶液中10~30分鐘后，在自然狀態下晾干，制得附有熒光探針的試紙。

一種上述試紙在可視化檢測dpa濃度上的應用，特點是：所述試紙在加入不同濃度的dpa后具有不同的顏色響應，隨著dpa濃度逐漸增加，試紙顏色逐漸改變，根據顏色的強度值來量化dpa的濃度，能夠對dpa濃度實時在線、智能檢測。

所述試紙在紫外燈照射下呈綠色，加入低濃度dpa后試紙仍為綠色，而加入高濃度dpa后試紙變為紅色，通過顏色識別，掃描分析試紙顏色的紅色red，綠色green，藍色blue數值，加入低濃度dpa后試紙顏色的紅r：綠g強度比值(r/g)小，加入高濃度dpa后試紙顏色的紅r/g值大，根據r/g值大小確定dpa濃度。

與現有技術相比，本發明有益效果包括如下：

1.本發明改變了目前常用的檢測dpa的檢測模式，無需復雜的前期樣品準備，不需要使用昂貴的大型儀器，節約了成本；

2.本發明是目前第一次報道采用一種雙稀土金屬離子摻雜的比率型熒光探針及可視化試紙途徑，首次提出使用圖像顏色識別手機軟件來實現對dpa的定量分析檢測；

3.本發明檢測方法用量少，整個反應體系僅需微量級的即可，節約了探針的使用量，實現了微量低成本的檢測。該熒光探針中原材料獲取簡單價格低廉，應用到血液中dpa的檢測實用性強；

4.本發明檢測方法能夠有效減少環境因素的影響，使用稀土鋱離子的綠色熒光作為參比信號，稀土銪離子的紅色熒光作為響應信號，并且該熒光探針具有較長的熒光壽命（達到ms級），從而可以采用時間分辨熒光分析的方法，能夠有效消除檢測過程中的背景熒光和散射熒光的影響，從而可以顯著提高靈敏度和信噪比；

5.本發明檢測響應速度快，直接采用待測物質dpa敏化該熒光探針，整個檢測dpa過程不超過1分鐘。本發明方法測定dpa的濃度范圍0.025～2μm，最低檢測濃度為7.3nm，具有較高的靈敏度和選擇性。

附圖說明

圖1是本發明熒光探針制備及檢測原理圖；

圖2是本發明所制備熒光探針的表征圖；

圖3是本發明應用于檢測dpa的實驗結果圖；

圖4是本發明所制備的試紙用于可視化檢測dpa濃度的實驗結果圖。

具體實施方式

結合以下具體實施例和附圖，對本發明作進一步的詳細說明，本發明的保護內容不局限于以下實施例。在不背離發明構思的精神和范圍下，本領域技術人員能夠想到的變化和優點都被包括在本發明中，并且以所附的權利要求書為保護范圍。實施本發明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內容之外，均為本領域的普遍知識和公知常識，本發明沒有特別限制內容。

如圖1所示，本發明的比率型稀土熒光探針是一種雙稀土金屬離子摻雜的比率型熒光探針：將稀土鋱離子溶液(tb³⁺)和2,6吡啶二羧酸（dpa）通過反向微乳液法合成得到結構式為tb/dpa@sio2的前驅體；經離心洗滌配制為溶液后加入等摩爾比的稀土銪離子溶液eu³⁺和鳥嘌呤核糖核苷酸溶液(gmp)，經震蕩反應后，離心洗滌得到結構式為tb/dpa@sio2-eu/gmp的熒光探針，利用tb³⁺的熒光強度值與eu³⁺的熒光強度值兩者的比值構成比率型稀土熒光探針tb/dpa@sio2-eu/gmp，所述熒光探針可用于檢測dpa。該探針中，tb/dpa@sio2被包裹進入由eu/gmp聚合物形成的網狀結構中，形成雙稀土摻雜的聚合物tb/dpa@sio2-eu/gmp。該探針與dpa作用后，tb/dpa@sio2由于二氧化硅殼層的保護作用發射穩定的綠色熒光作為參比信號，而dpa作為天線配體敏化eu/gmp產生紅色熒光信號作為待測物的響應信號，從而實現對dpa的比率型熒光檢測。

本發明包括以下步驟：

(1)制備熒光探針的方法：通過反向微乳液法制備tb/dpa@sio2-eu/gmp比率型熒光探針，其中tb的綠色熒光作為參比熒光，eu的紅色熒光作響應熒光；

(2)通過時間分辨熒光檢測方法實現對dpa的檢測：取10μl所獲得的tb/dpa@sio2-eu/gmp比率型熒光探針并加入待測的dpa標準溶液或血清樣品進行反應。所述待測的dpa標準溶液的濃度為0.025～2μm。在具體實施方案中，血清樣品為大鼠血清樣品；

(3)制備可視化試紙：通過將濾紙浸泡在熒光探針溶液中，制附有熒光探針的試紙，進一步開發了一種便攜式的試紙用于可視化檢測dpa；

(4)可視化試紙檢測dpa：通過顏色識別的手機軟件，掃描出加入不同濃度dpa后試紙顏色的rgb值，實現dpa的定量檢測。

本發明的反應體積可控制在微升級別，體積為100μl。優化實驗方案可表述如下：

取10μl待測溶液加到90μl熒光探針溶液中，通過時間分辨熒光分析法進行檢測。

所述熒光探針中，所述熒光探針的濃度為0.01~1mg/ml,優選地，為0.1mg/ml。

所述待測dpa溶液的反應濃度為0.025～2μm。

所述緩沖液為tris-hcl，其濃度為40mm，ph值為7.0～9.0；優選地，ph=7.4。

所述反應溫度為4~40℃，優選地，為室溫條件下。

所述反應時間為0~2分鐘，優選地，反應時間為1分鐘。

本發明方法為微量檢測方法。在具體實施方案中，本發明的最低檢測濃度為7.3nmdpa溶液。

熒光光譜檢測：多功能酶標儀（infinitem200pro,tecan，switzerland）或同性能光譜儀，激發波長：272nm，延遲時間：50μs；積分時間：2000μs；掃描波長范圍：450～750nm，使用384微孔黑板，取100μl反應液進行測定。

實施例1

首先制備熒光探針；將500μl含9.0mgedc和2.8mgnhs的無水乙醇加入600μl的20mmdpa溶液，并攪拌40分鐘。接著，加入100μlaptes并反應100分鐘。然后，加入200μl20mmtb(no3)3溶液到混合溶液中。將所得到的混合物作為前體。然后，用反相微乳液法制備tb/dpa@sio2。使用1ml正己醇，1ml曲拉通x-100和4ml環己烷制成微乳液并加入到300μl之前所制備的tb/dpa溶液中，40分鐘持續攪拌后，在溶液中加入25μl氨水溶液(28%)和85μlteos的。攪拌反應持續24小時。等體積丙酮被用于從微乳液中分離納米顆粒，并使用乙醇和水沖洗離心3次。為了制備氨基改性的tb/dpa@sio2-nh2，將tb/dpa@sio2懸浮于上述的微乳液。然后加入20μlaptes溶液中并攪拌反應2小時。最后，使用與上述相同的方法收集納米顆粒。將所得到的tb/dpa@sio2-nh2在40°c干燥箱中干燥。

實施例2

將500μl2mmgmp溶液和1.0ml0.5mg/ml的tb/dpa@sio2-nh2溶液混合，然后震蕩30分鐘。接著，將500μl2mmeu(no3)3加入到混合溶液中并在室溫下搖動100分鐘。然后，在10000rpm下離心5分鐘來收集該產物，并用超純水洗滌3次，以除去未反應的試劑。最后，將tb/dpa@sio2-eu/gmp混合物保存在2mlh2o中以供進一步使用。(所制備的材料表征如圖2所示，圖2(a)是tb/dpa@sio2-nh2的透射掃描電鏡表征圖，圖2(b)是tb/dpa@sio2-nh2的透射掃描電鏡表征圖，圖2(c)是tb/dpa@sio2-nh2,tb/dpa@sio2-eu/gmp,tb/dpa@sio2-eu/gmp/dpa的紅外光譜表征圖，圖2(d)是tb/dpa@sio2-eu/gmp/dpa的熒光激發ex和發射光譜圖em)。

實施例3

以制備的熒光探針和前述檢測條件對dpa進行檢測。將80μltris-hcl緩沖液（ph7.4，50mm）加入到10μl所制備的tb/dpa@sio2-eu/gmp溶液中。之后，將10μl不同濃度的dpa（0.25-20μm）加入到上述溶液中。tris-hcl的最終濃度為40mm，而dpa的最終濃度是在0.025-2.0μm范圍。為了探究檢測dpa的比率型熒光探針的選擇性，選擇不同的材料進行干擾性實驗，包括苯氧基乙酸（poa），對苯二甲酸（p-pa），苯甲酸（ba），半胱氨酸（cys），谷氨基酸（glu），這些物質的最終濃度為50μm。最后，在272nm波長激發下記錄發射光譜。濃度0.025-2.0μm時，熒光強度與dpa濃度呈線性相關：y=1.225x+0.033，r²=0.9911，基于空白樣品三倍標準偏差，得到的dpa的最低檢測濃度為7.3nm（如圖3所示，圖3(a)為分別加入0.025~2μm濃度的dpa后的熒光譜圖，圖3(b)為加入0.025~2μm濃度的dpa后,在618nm波長處和548nm波長的熒光強度f618/f548比值隨著dpa濃度的變化而變化的線性圖，圖3(c)是熒光探針的選擇性實驗圖，圖3(d)是混樣競爭性實驗結果圖）。

實施例4

為了進一步探究該探針是否可用于生物實際樣本檢測，使用該探針來檢測血清樣品中的dpa含量。通過標準加入方法將含有不同濃度dpa的一系列血清樣品加入到檢測體系中。表1是本發明用于血液中檢測dpa的實驗結果，如表1所示，血清樣品的回收率在95.70%至104.65%之間，相對標準偏差（rsd，n=3）都低于5%，證明tb/dpa@sio2-eu/gmp時間分辨比率型熒光探針可適用于復雜實際樣品中dpa的分析檢測。

表1

實施例5

開發一種簡便的可視化試紙：通過將濾紙浸泡在熒光探針溶液中，制得附有熒光探針的試紙，用于快速檢測dpa含量。如圖4(a)所示，試紙在紫外燈照射下不加入dpa時試紙呈綠色，逐漸增加加入dpa的濃度，試紙由綠色變為紅色，且加入高濃度dpa試紙后呈紅色，如圖4(b)所示，通過顏色識別手機軟件，掃描分析顏色的紅色red，綠色green，藍色blue數值，加入低濃度dpa后試紙顏色的紅r：綠g強度比值(r/g)小，加入高濃度dpa后試紙顏色的紅r/g值大，根據r/g比值和dpa濃度的線性關系間接確定出dpa的濃度，試紙的最低可檢測濃度（ldc）約為1μm。因此，用于dpa測定的tb/dpa@sio2-eu/gmp試紙和手機軟件聯用的方法具有快速便攜，價格低廉的優點并且在實際應用中具有巨大的應用潛力。

綜上結果，基于tb/dpa@sio2-eu/gmp聚合物的雙稀土金屬離子摻雜的時間分辨比率型熒光探針首次合成，其中tb/dpa@sio2用作穩定的內參比，eu/gmpcp用作待測物的靈敏信號響應。時間分辨比率型熒光探針顯示出對dpa檢測較高的靈敏度和選擇性；檢出限為7.3nm，線性范圍為0.025～2μm，線性相關系數0.9911。用標準加入法檢測大鼠血清中的dpa，血液中的其他共存物并未對其檢測造成影響。本發明的實用性和生物相容性強，能夠有效避免實際樣品中共存物對檢測的干擾。此外，使用固定有tb/dpa@sio2-eu/gmp的濾紙成功地設計了用于dpa測定的簡易試紙，并且可以在uv燈下通過肉眼直接觀察從綠色到紅色的顏色轉換。該新型簡易試紙滿足了快速方便檢測dpa的需求，通過圖像顏色識別手機軟件可以根據r/g的數值間接確定dpa的濃度，避免了復雜的操作和昂貴儀器的使用，僅用手機軟件便可實現快速檢測。因此，該時間分辨比率熒光探針是可信，準確，靈敏的，并將在實際應用中提供更靈活簡便的傳感策略，促進了圖像識別技術在化學分析檢測方面的應用。

綜上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并非用來限定本發明范圍。凡依本發明內容所作的等效變化與修飾，都應為本發明保護范疇。