本發明涉及納米科學、生物傳感檢測技術、電化學發光等領域，具體涉及一種基于界面轉化電化學發光免疫傳感器的制備方法及應用。
背景技術：
近幾十年來，生物傳感器蓬勃發展，為早期臨床診斷帶來了關鍵性的突破，高靈敏度、高選擇性的生物傳感器，一直是國內外分析化學工作者的研究熱點，在環境監測、食品安全、臨床分析等領域具有廣闊的應用前景。電化學發光傳感器具有靈敏度高、易于小型化的特點在實際應用中具有巨大的優勢，而穩定響應性的電極傳感界面是構建這類電化學發光傳感器的關鍵。
納米材料具有優越的導電性、較大的比表面積和良好的生物兼容性，已經被廣泛應用于電化學發光傳感器的構建。在構建過程中，既可以作為基底物質，也可以作為生物標記物的放大信號。但納米材料在構建傳感器的過程中存在從傳感界面脫落，對底物選擇性差，低生物識別能力等問題。另外，早期的電化學免疫傳感器通常通過對抗原或抗體進行酶標記來檢測信號，但是酶對環境要求較高，特別是酶結合到固體載體表面后容易失活。基于具有酶催化活性的納米材料構建的無酶電化學免疫傳感器引起了人們極大的研究興趣。因此在構建傳感器時，采用界面轉化的技術實現發光信號的長期穩定保存，可以解決納米材料在傳感器應用中存在的諸多問題，為電化學發光傳感器的發展和創新提供了新的思路，具有十分重要的研究意義。
本發明利用聚苯胺金納米復合物為基底材料，以具有獨特結構的聚多巴胺微球為載體，實現了電化學發光半導體納米材料在電極界面的固定與高效發光。同時利用聚多巴胺微球和聚苯胺金納米復合物良好的生物相容性，固定生物標志物實現傳感器的構建。利用ito玻璃高溫煅燒構建電化學發光免疫傳感器，該方法不僅操作容易，具有較高的電化學發光性能，而且對不同生物標志物的檢測信號進行長久保存，解決了納米材料及生物分子缺乏簡單而有效的電極固定方法等問題。該方法可以適用于多種生物標志物免疫傳感器的制備，在科研和臨床中具有廣泛的應用前景。
技術實現要素：
本發明的目的之一是提供一種簡單易行的界面轉化電化學發光免疫傳感器的制備方法，既可以對生物標志物高效靈敏的檢測，還可以實現定量檢測。
本發明的目的之二是聚苯胺金納米復合物對二抗標記物具有很好的固定作用，通過高溫煅燒，解決了電極修飾材料脫落、重現性差等問題。
本發明的目的之三是提供長久保存、低成本、通用的生物標志物檢測方法，為電化學發光免疫傳感器在臨床中的應用提供技術基礎。
本發明的技術方案如下：
1.一種基于界面轉化電化學發光免疫傳感器制備方法及應用，其特征在于，包括以下步驟：
（1）將6μl聚苯胺金納米復合物滴在處理、活化好0.5cm×3.5cm的ito電極表面，于4°c冰箱中儲存備用；
（2）將6μl10μg?ml-1抗體溶液滴涂在步驟（1）制得的電極表面，4°c冰箱中孵化1h；
（3）滴加5μl、質量分數為1%的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，于4°c冰箱中孵化1h，超純水清洗晾干；滴加6μl濃度為0.001~20ng/ml的一系列不同濃度的生物標志物溶液，4°c下孵化1h，超純水洗凈，晾干；
（4）滴加6μl聚多巴胺納米微球負載氮化碳納米片標記的抗體溶液，4°c冰箱中孵化1h，超純水清洗晾干，之后在400°c條件下煅燒30min，作為工作電極，進行電化學發光測試。
2.聚苯胺金納米復合物溶液的制備，其特征在于，包括以下步驟：
將5ml0.8~2.0mm的haucl4溶液置于45°c水浴鍋中預熱10min，之后緩慢加入0.5ml20mm的苯胺-環己烷溶液，反應12h，將產品11000rpm離心10min，水洗三次，最后將得到的聚苯胺金納米復合物分散到3ml超純水中，4°c保存。
3.聚多巴胺納米微球負載氮化碳納米片溶液的制備，其特征在于，包括以下步驟：
（1）聚多巴胺納米微球溶液的制備
80~120mg鹽酸多巴胺加入到80~120mlph=8.8的tris緩沖溶液與30~70ml異丙醇的混合液中，在室溫下避光反應24h，將產品離心分離并用超純水洗滌三次，之后將產物分散到5ml超純水中；
（2）氮化碳納米片溶液的制備
5g雙氰胺置于馬弗爐中，550°c燒4h，升溫速率5°c/min，之后冷卻至室溫，稱取100mg氮化碳置于100ml超純水中，先用破壁機打磨10~20min，再超聲分散4~8h，將產品5000rpm離心10min，上層溶液備用；
（3）聚多巴胺納米微球負載氮化碳納米片溶液的制備
1ml聚多巴胺納米微球溶液加入2ml氮化碳納米片溶液，超聲15min，置于4°c下震蕩6h，離心分離，之后將產物分散到1ml超純水中。
4．一種基于界面轉化電化學發光免疫傳感器制備方法及應用，制備的傳感器用于生物標志物檢測，其特征在于，步驟如下：將煅燒后的ito電極作為工作電極，ag/agcl電極作為參比電極，pt電極作為對電極，用ph為7.4的pbs緩沖溶液配制的50mmol·l-1的k2s2o8溶液作為底液，在電化學發光工作站上以循環伏安模式測定-1.1~0v電勢下的發光信號，實現對生物標志物的檢測。
本發明的有益成果
1該傳感器的制備方法不僅操作容易，成本低廉，而且具有高效的電化學發光性能，解決了納米材料及生物分子缺乏簡單而有效的電極固定方法的問題。
2聚多巴胺微球表面含有豐富的官能團，便于固定生物標記物和抗體，在傳感界面轉化的過程中作為重要的載體，避免了復雜的抗體固定過程及由此引起的失活問題。
3聚苯胺金納米復合物對二抗標記物具有很好的固定作用，通過高溫煅燒使得傳感器發光性能穩定，解決電極修飾材料脫落、重現性差等問題。
4該方法可以適用于多種生物標志物免疫傳感器的制備，在科研和臨床中具有廣泛的應用前景。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
實施例1一種基于界面轉化電化學發光免疫傳感器的制備方法
（1）將6μl聚苯胺金納米復合物滴在處理、活化好0.5cm×3.5cm的ito電極表面，于4°c冰箱中儲存備用；
（2）將6μl10μg?ml-1胰島素抗體溶液滴涂在步驟（1）制得的電極表面，4°c冰箱中孵化1h；
（3）滴加5μl、質量分數為1%的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，于4°c冰箱中孵化1h，超純水清洗晾干；滴加6μl濃度為0.001~20ng/ml的一系列不同濃度的胰島素溶液，4°c下孵化1h，超純水洗凈，晾干；
（4）滴加6μl聚多巴胺納米微球負載氮化碳納米片標記的抗體溶液，4°c冰箱中孵化1h，超純水清洗晾干，之后在400°c條件下煅燒30min，將ito電極作為工作電極，ag/agcl電極作為參比電極，pt電極作為對電極，用ph為7.4的pbs緩沖溶液配制的50mmol·ml-1的k2s2o8溶液作為底液，在電化學發光工作站上以循環伏安模式測定-1.1~0v電勢下的發光信號，實現對胰島素的檢測。
實施例2一種基于界面轉化電化學發光免疫傳感器的制備方法
（1）將6μl聚苯胺金納米復合物滴在處理、活化好0.5cm×3.5cm的ito電極表面，于4°c冰箱中儲存備用；
（2）將6μl10μg?ml-1前列腺特異性抗原抗體溶液滴涂在步驟（1）制得的電極表面，4°c冰箱中孵化1h；
（3）滴加5μl、質量分數為1%的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，于4°c冰箱中孵化1h，超純水清洗晾干；滴加6μl濃度為0.001~20ng/ml的一系列不用濃度的前列腺特異性抗原溶液，4°c下孵化1h，超純水洗凈，晾干；
（4）滴加6μl聚多巴胺納米微球負載氮化碳納米片標記的抗體溶液，4°c冰箱中孵化1h，超純水清洗晾干，之后在400°c條件下煅燒30min，將ito電極作為工作電極，ag/agcl電極作為參比電極，pt電極作為對電極，用ph為7.4的pbs緩沖溶液配制的50mmol·ml-1的k2s2o8溶液作為底液，在電化學發光工作站上以循環伏安模式測定-1.1~0v電勢下的發光信號，實現對前列腺特異性抗原的檢測。
實施例3一種基于界面轉化電化學發光免疫傳感器的制備方法
（1）將6μl聚苯胺金納米復合物滴在處理、活化好0.5cm×3.5cm的ito電極表面，于4°c冰箱中儲存備用；
（2）將6μl10μg?ml-1癌胚抗原抗體溶液滴涂在步驟（1）制得的電極表面，4°c冰箱中孵化1h；
（3）滴加5μl、質量分數為1%的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，于4°c冰箱中孵化1h，超純水清洗晾干；滴加6μl濃度為0.001~20ng/ml的一系列不用濃度的癌胚抗原溶液，4°c下孵化1h，超純水洗凈，晾干；
（4）滴加6μl聚多巴胺納米微球負載氮化碳納米片標記的抗體溶液，4°c冰箱中孵化1h，超純水清洗晾干，之后在400°c條件下煅燒30min，將ito電極作為工作電極，ag/agcl電極作為參比電極，pt電極作為對電極，用ph為7.4的pbs緩沖溶液配制的50mmol·ml-1的k2s2o8溶液作為底液，在電化學發光工作站上以循環伏安模式測定-1.1~0v電勢下的發光信號，實現對癌胚抗原的檢測。
實施例4聚苯胺金納米復合物溶液的制備
將5ml0.8mm的haucl4溶液置于45°c水浴鍋中預熱10min，之后緩慢加入0.5ml20mm的苯胺-環己烷溶液，反應12h，將產品11000rpm離心10min，水洗三次，最后將得到的聚苯胺金納米復合物分散到3ml超純水中，4°c保存。
實施例5聚苯胺金納米復合物溶液的制備
將5ml1.0mm的haucl4溶液置于45°c水浴鍋中預熱10min，之后緩慢加入0.5ml20mm的苯胺-環己烷溶液，反應12h，將產品11000rpm離心10min，水洗三次，最后將得到的聚苯胺金納米復合物分散到3ml超純水中，4°c保存。
實施例6聚苯胺金納米復合物溶液的制備
將5ml2.0mm的haucl4溶液置于45°c水浴鍋中預熱10min，之后緩慢加入0.5ml20mm的苯胺-環己烷溶液，反應12h，將產品11000rpm離心10min，水洗三次，最后將得到的聚苯胺金納米復合物分散到3ml超純水中，4°c保存。
實施例7聚多巴胺納米微球負載氮化碳納米片溶液的制備
（1）聚多巴胺納米微球溶液的制備
80mg鹽酸多巴胺加入到80mlph=8.8的tris緩沖溶液與30ml異丙醇的混合液中，在室溫下避光反應24h，將產品離心分離并用超純水洗滌三次，之后將產物分散到5ml超純水中；
（2）氮化碳納米片溶液的制備
5g雙氰胺置于馬弗爐中，550°c燒4h，升溫速率5°c/min，之后冷卻至室溫，稱取100mg氮化碳置于100ml超純水中，先用破壁機打磨10min，再超聲分散4h，將產品5000rpm離心10min，上層溶液備用；
（3）聚多巴胺納米微球負載氮化碳納米片溶液的制備
1ml聚多巴胺納米微球溶液加入2ml氮化碳納米片溶液，超聲15min，置于4°c下震蕩6h，離心分離，之后將產物分散到1ml超純水中。
實施例8聚多巴胺納米微球負載氮化碳納米片溶液的制備
（1）聚多巴胺納米微球溶液的制備
100mg鹽酸多巴胺加入到100mlph=8.8的tris緩沖溶液與50ml異丙醇的混合液中，在室溫下避光反應24h，將產品離心分離并用超純水洗滌三次，之后將產物分散到5ml超純水中；
（2）氮化碳納米片溶液的制備
5g雙氰胺置于馬弗爐中，550°c燒4h，升溫速率5°c/min，之后冷卻至室溫，稱取100mg氮化碳置于100ml超純水中，先用破壁機打磨15min，再超聲分散6h，將產品3000rpm離心10min，上層溶液備用；
（3）聚多巴胺納米微球負載氮化碳納米片溶液的制備
1ml聚多巴胺納米微球溶液加入2ml氮化碳納米片溶液，超聲15min，置于4°c下震蕩6h，離心分離，之后將產物分散到1ml超純水中。
實施例9聚多巴胺納米微球負載氮化碳納米片溶液的制備
（1）聚多巴胺納米微球溶液的制備
120mg鹽酸多巴胺加入到120mlph=8.8的tris緩沖溶液與70ml異丙醇的混合液中，在室溫下避光反應24h，將產品離心分離并用超純水洗滌三次，之后將產物分散到5ml超純水中；
（2）氮化碳納米片溶液的制備
5g雙氰胺置于馬弗爐中，550°c燒4h，升溫速率5°c/min，之后冷卻至室溫，稱取100mg氮化碳置于100ml超純水中，先用破壁機打磨20min，再超聲分散8h，將產品3000rpm離心10min，上層溶液備用；
（3）聚多巴胺納米微球負載氮化碳納米片溶液的制備
1ml聚多巴胺納米微球溶液加入2ml氮化碳納米片溶液，超聲15min，置于4°c下震蕩6h，離心分離，之后將產物分散到1ml超純水中。