本發(fā)明涉及纖維素酶檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種飼料中總纖維素酶活力的方法。
背景技術(shù)：
隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展和生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，飼用復(fù)合酶已廣泛用于飼料工業(yè)中。由于酶制劑能夠消除飼料中的某些抗?fàn)I養(yǎng)因子的負(fù)面作用，提高飼料消化率，改善動物生產(chǎn)性能，降低生產(chǎn)成本，因此日益受到飼料界的重視。飼用復(fù)合酶種類繁多，大部分包含纖維素酶，目前飼料用纖維素酶檢測方法有《ny/t912-2004飼料添加劑纖維素酶活力測定》及《gb/t23881-2009飼用纖維素酶活性的測定濾紙法》，前者是測體系中內(nèi)切葡聚糖酶活性，后者是測總纖維素酶活性，但由于飼料成分較復(fù)雜，含有各種金屬離子對酶制劑有激活或抑制作用、糖類及其他成分造成纖維素酶活性檢測過程中背景值非常高，再加上纖維素酶本身添加量較少，導(dǎo)致飼料中纖維素酶活性檢測值不準(zhǔn)確。因此，需要一種提高靈敏度和準(zhǔn)確性高的檢測方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本發(fā)明提供了一種提高飼料中總纖維素酶活力檢測準(zhǔn)確性的方法。
研究發(fā)現(xiàn)，飼料中含有的一些金屬離子及糖類會對纖維素酶的檢測產(chǎn)生一定影響。農(nóng)業(yè)部1224號公告中可添加到飼料中的常量元素和微量元素，部分元素對纖維素酶有激活作用，部分有抑制作用，不管是激活還是抑制，都會造成飼料中纖維素酶檢測值與理論添加值間的差異，這種正向或反向的差異都會增加實測值與理論值的差異。飼料本身含有各種聚糖、寡糖及單糖，這些糖特別是具有還原性的單糖，比如葡萄糖在酶解過程中會與dns試劑發(fā)生反應(yīng)，造成檢測背景值偏高，大幅降低檢出限，使得飼料中纖維素酶較難檢出。
因此，本發(fā)明通過沉降飼料中的金屬元素，以及減少飼料原料中的糖類，主要是一些單糖，達(dá)到提高準(zhǔn)確性的目的。
本發(fā)明提供的提高飼料中纖維素酶活力檢測準(zhǔn)確性的方法，是在常規(guī)的纖維素酶檢測方法基礎(chǔ)上，對飼料進(jìn)行除金屬和除糖的預(yù)處理，并優(yōu)化酶解反應(yīng)過程，包括優(yōu)化底物形狀、優(yōu)化酶解反應(yīng)體系中各參數(shù)比例。
其中，常規(guī)的纖維素酶檢測方法是指在本發(fā)明申請日以前基于還原糖與dns試劑反應(yīng)顯色原理的檢測技術(shù)，例如可以參照ny/t912-2004及gb/t23881-2009等。
優(yōu)選地，飼料預(yù)處理步驟為：將粉碎的飼料與金屬沉降劑投入緩沖液中進(jìn)行提取，過濾后濾液中加入除糖劑反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后過濾，得酶液。
優(yōu)選地，所述金屬沉降劑為含二甲基二硫代氨基甲酸鈉的復(fù)合螯合劑，能夠沉降鉻、鎳、銅、鋅、錳、鎘、釩、鐵、錫等多種金屬離子，減少金屬離子對酶活的影響。
優(yōu)選地，所述除糖劑為一種畢赤酵母，能夠分解利用掉可與dns發(fā)生反應(yīng)的單糖，大大降低背景噪音，提高檢測準(zhǔn)確性。
本發(fā)明還提供了一種提高飼料中總纖維素酶活力檢測準(zhǔn)確性的方法，包括以下步驟：
(1)處理酶液：將粉碎的飼料與金屬沉降劑投入緩沖液中進(jìn)行提取，過濾后濾液中加入除糖劑反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后過濾，得酶液；
(2)酶活測定：濾紙粉碎，加入酶液37℃進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入dns試劑，煮沸滅活酶，過濾，取濾液在540nm測其吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照得單糖濃度，按照以下公式(1)計算得出酶活力：
x＝a×l/0.5×n÷m＝(ax+b)×0.5×l/0.5×n÷m....(1)
式中：
x—樣品中總纖維素酶活力，u/g(或u/ml)；
a—根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得或計算出的還原糖量，mg；
1/0.5—換算成酶液1ml；
n—酶樣的稀釋倍數(shù)；
m—稱樣量，g；
所述標(biāo)準(zhǔn)曲線由已知梯度濃度的葡萄糖與dns試劑反應(yīng)后在540nm測定吸光度值，每個葡萄糖濃度值對應(yīng)一個吸光度值，形成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
優(yōu)選地，所述濾紙粉碎后還包括對其烘干的步驟，烘干條件為105℃烘干至恒重，含水量低于5％。對濾紙進(jìn)行粉碎和烘干處理，大大提高了方法重現(xiàn)性。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明通過去除檢測樣品中的金屬離子和糖，大大提高了檢測準(zhǔn)確性，通過對濾紙進(jìn)行特殊的粉碎烘干處理，提高了重現(xiàn)性。使用本發(fā)明的檢測方法，可以準(zhǔn)確檢測出飼料中含有的真實纖維素酶含量，檢測誤差遠(yuǎn)低于常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)方法。
附圖說明
圖1為實施例1標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好地理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。
實施例1
1試劑
除特殊說明外，所有的試劑均為分析純，水均符合gb/t6682中規(guī)定的二級水。
1.1dns試劑
稱取3，5-二硝基水楊酸3.15g，加水500ml在磁力攪拌器上加熱攪拌，至45℃，然后逐步加入100ml氫氧化鈉溶液，同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明(注意：在氫氧化鈉加入的過程中，溶液溫度不得低于45℃，不得高于48℃)，再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0g，保持在46℃左右。直到全部溶解，加入苯酚2.5ml，再加入無水亞硫酸鈉2.5g，保溫45℃攪拌，直到加入物質(zhì)完全溶解，停止加熱，冷卻至室溫后，用水定容至1000ml。用濾紙過濾，取濾液儲存在棕色瓶中，避光保存，室溫下存放7d后可以使用，有效期為2個月。
1.2乙酸-乙酸鈉緩沖溶液0.1mol/l，ph值5.5，適用于飼用纖維素酶：
稱取無水乙酸鈉8.2g，用水溶解，再用冰乙酸調(diào)節(jié)ph至5.5，加水定容至1000ml，搖勻。
1.3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液(10mg/ml)
稱取于(103士2)℃下烘干至恒重的無水葡萄糖1g，精確至0.1mg，用水溶解并定容至100ml。
1.4葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液
分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液0、0.125、0.25、0.5、1.00、1.50、2.00ml于10ml容量瓶中，用水定容至10ml，蓋塞，搖勻備用。上述系列濃度應(yīng)根據(jù)需要自行調(diào)整。
1.5快速定性濾紙：杭州沃華濾紙有限公司，雙圈定性濾紙，帶whatmanr標(biāo)識，直徑15cm。
2儀器
2.1分光光度計：能檢測350～800nm的吸光度范圍；
2.2ph計：精確至0.01；
2.3恒溫水浴鍋：溫度控制范圍在30～60℃之間，精確度為0.1℃；
2.4分析天平：感量0.1mg；
2.5磁力攪拌器；
2.6秒表：每小時誤差不超過5s；
2.7電磁振蕩器；
2.8具塞刻度試管25ml；
2.9移液器：精度為1μl。
2.10粉碎機(jī)
3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
按表l規(guī)定的量，分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，緩沖溶液和dns試劑于各管中混勻。
將標(biāo)準(zhǔn)管同時置于沸水浴中加熱10min。取出，迅速冷卻至室溫，混勻。用10mm比色杯，在分光光度計波長540nm處測量吸光度。以葡萄糖量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程。
表1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線
4樣品的測定
4.1樣品前處理
將配合飼料樣品粉碎通過0.45mm標(biāo)準(zhǔn)篩，稱取5g于三角瓶中，稱取0.2g金屬沉降劑，用25ml緩沖液于20℃水浴搖床提取30min，靜止過濾，取濾液9.9ml，加入0.1ml除糖劑，于20℃處理4h，過濾取濾液備用。
4.2濾紙的制備
先將濾紙撕成小片，再用粉碎機(jī)粉碎成棉花狀，粉碎后105℃烘箱烘2h至恒重，置于(硅膠)干燥器中待用，水分控制在5％以內(nèi)。
4.3測定步驟
取四支25ml刻度具塞試管，稱取濾紙粉0.05g放入每支試管的底部，加入1.8ml緩沖液，使管內(nèi)溶液浸沒濾紙。于37℃水浴中預(yù)熱5min，加入0.20ml酶液于三支樣品管中，精確反應(yīng)60min，向四支試管中加入dns試劑2.5ml。再于空白管中補(bǔ)加酶液0.20ml。沸水煮沸10min，取出，冷卻至室溫，搖勻，四層紗布過濾，取濾液比色。
5試樣酶活力的計算
試樣酶活力按式(l)計算：
x＝a×l/0.5×n÷m＝(ax+b)×0.5×l/0.5×n÷m....................(1)
式中：
x—樣品的外切酶活力，u/g(或u/ml)；
a—根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得(或計算出)的還原糖量，mg；
1/0.5—換算成酶液1ml；
n—酶樣的稀釋倍數(shù)；
m—稱樣量，g。
6允許差
同一試樣兩次測試結(jié)果的絕對差值，不得超過算術(shù)平均值的10％。
7檢測結(jié)果
7.1標(biāo)準(zhǔn)曲線
標(biāo)準(zhǔn)曲線參見圖1。
7.2樣品中纖維素酶檢測結(jié)果
表2：不同方法檢測飼料中總纖維素酶活性
備注：復(fù)合酶中含有纖維素酶，理論值根據(jù)復(fù)合酶中纖維素酶活性為1000u/g,添加量為300g/t進(jìn)行計算所得。
以上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳實施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。