一種肺癌監測試劑盒及其使用方法與流程

本發明屬于生物醫藥
技術領域：
，具體涉及一種肺癌監測試劑盒及其使用方法。
背景技術：
：在世界范圍內，無論男性還是女性，肺癌均已成為癌癥死亡的主要原因。2005年估計中國肺癌的新發病例大約有500,000例（男性約330,000例，女性約170,000例），2007年美國肺癌的新發病例估計有213,380例，死亡160,390例在世界范圍內。肺癌高死亡率的主要原因有二個：一是肺癌缺乏有效的早期診斷手段，70%以上的病人在確診時已屬晚期；二是晚期肺癌（尤其是非小細胞肺癌，nsclc）對化療的敏感性差，現有的各種化療方案對nsclc的總體有效率僅為30%左右。肺癌按解剖學部分分類可分為2類：中央型肺癌和周圍型肺癌。中央型肺癌發生于肺段或肺段以上的支氣管,主要為磷狀上皮癌、小細胞癌、大細胞癌及類癌。周圍型肺癌發生于肺段以下的支氣管，見于各種組織學類型。其基本大體病理形態為肺內結節或腫塊。肺癌組織病理學分類為兩種基本類型，第一種是非小細胞型肺癌，另外一種是小細胞肺癌。肺癌的診斷目前主要通過以下幾種方法，胸部影像學檢查是診斷腫瘤最重要的方法之一，對早期診斷肺癌有重要意義。支氣管鏡除能直接觀察病變形態特征及支氣管狹窄情況外，還能通過經支氣管鏡肺活檢、經纖支鏡針吸細胞學檢查（tbna）等直接選取組織進行病理檢查，提高肺癌的診斷率，并對肺癌(尤其是nsclc)分期具有重要指導作用。支氣管內超聲檢查（ebus）是在支氣管鏡引導下，通過超聲探頭對支氣管腔內、氣管及周圍組織進行檢查與治療的方法。自動熒光支氣管鏡（afb）是利用細胞自發性熒光和電腦圖像分析技術開發的新型纖維支氣管鏡，可明顯提高氣管鏡對肺癌及癌前病變早期診斷的敏感性。電磁導航支氣管鏡（enb）結合傳統支氣管鏡與螺旋ct仿真支氣管鏡的優點，可提高常規支氣管鏡對周圍肺病灶的陽性檢出率。光干涉斷層掃描（oct）是將紅外線分為兩束光，一束直接照射，另一束經過反射再照射，兩束光重疊產生光干涉現象，檢測各層光反射的強弱和時間延遲，并經計算機處理，即得出與b型超聲、ct類似的二次斷層圖像,其獲得的反射圖像高于以往任何方法的分辨率和敏感性。痰脫落細胞檢查是診斷肺癌的重要手段，如痰標本收集方法得當，連續3次以上痰標本檢查可提高中央型肺癌診斷率達80%，周圍型肺癌診斷率達50%。腫瘤標志物檢測方法簡單、創傷小、可重復性好，是臨床篩選及早期診斷腫瘤的首選方法，其在機體特定部位的表達對腫瘤的診斷相對特異。診斷肺癌常用的腫瘤標志物有癌胚抗原(cea)、神經元特異烯醇化酶(nse)、細胞角蛋白19片段(cyfra21-1)、ca-125、肺癌相關抗原、血管內皮生長因子、增生細胞核抗原、表皮生長因子受體等。糖蛋白分子由多肽鏈和糖兩部分組成。血清糖蛋白中任何變化可以反映人體的生理改變。近年來的糖組學研究也顯示了寡糖鏈的改變與各種腫瘤的發生和發展有密切的相關性（參考文獻：liu，x-e，desmyter，l，gao，c-f，laroy，w，dewaele，s，vanhooren，v，wang，l，zhuang，h，callewaert，n，libert，c，contreras，r，chen，c.n-glycomicchangesinhepatocellμlarcarcinomapatientswithlivercirrhosisinducedbyhepatitisbvirus.hepatology，46，1426-1435，2007.）。鑒于肺癌監測的不確定性，目前迫切需要一種能有效監測肺癌的試劑盒和監測評估方法。技術實現要素：解決的技術問題：本發明的目的是解決現有檢測方法對肺癌監測的不確定，提供一種肺癌監測試劑盒及其使用方法，通過檢測血液糖蛋白的n-糖苷鍵連接的碳水化合物（n-寡糖）含量的改變來評估肺癌的進展以及愈后腫瘤的復發。技術方案：一種肺癌監測試劑盒，由以下試劑組成：試劑a：濃度為10mm的碳酸氫銨溶液中加入質量濃度5%的sds配制而成；試劑b：質量濃度濃度為不低于3.3%np40中加入不少于2.2單位/μl糖苷外切酶配制而成；試劑c：等體積20mmapts的1.2m檸檬酸和1m有機物還原劑的dmso的混合液；試劑d：不低于0.25μl濃度為100mm的nh4ac，不少于0.2μl的唾液酸酶，2.55μl雙氧水。其中，所述有機物還原劑為nacnbh3。其中，試劑a的體積可以為2μl，試劑b的體積可以為4μl，試劑c的體積可以為2μl，試劑d的體積可以為2μl。上述肺癌監測試劑盒的使用方法，包括以下步驟：步驟1，往稀釋一倍的4μl血清加入2μl的試劑a，進行變性反應，加入4μl試劑b，37℃反應3小時后干燥，得到樣品；步驟2，在所得樣品中加入2μl試劑c，進行熒光標記，然后加入200μl水終止標記反應，得到熒光標記后的樣品；步驟3，將2μl試劑d加至2μl熒光標記后的樣品，進行去末端唾液酸反應，加入200μl的水終止標記反應，得到去末端唾液酸反應的樣品；步驟4，取10μl去末端唾液酸反應的樣品，用abi測序儀進行寡糖鏈片分離，得到圖譜。進一步地，步驟1變性反應的條件為不低于95℃加熱。進一步地，步驟2中熒光標記的條件為60-70℃加熱。進一步地，步驟3中去末端唾液酸反應的條件為不高于45℃加熱。以上所述的肺癌監測試劑盒可以用于檢測包含有寡糖鏈成分的血液或所有人體體液。有益效果：本發明的肺癌監測試劑盒基于檢測血液糖蛋白中寡糖鏈的指紋圖譜作為診斷指標對肺癌患者進行了評估，以診斷肺癌的腫瘤分期。該檢測方法可以讓眾多肺癌患者接受常規、無創檢測，幫助醫生檢測肺癌，并能夠及時監測疾病進展。附圖說明圖1為實施例1中采用血清的n-寡糖鏈指紋技術分析的流程示意圖；圖2為實施例1中采用的人血清g-test圖譜；圖3為實施例1中健康對照組的血清g-test圖譜；圖4為實施例1中肺癌患者的血清g-test圖譜。具體實施方式下面將進一步的詳細說明本發明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發明要求保護的技術方案的舉例說明，并非對這些技術方案的任何限制。本發明的保護范圍以所附權利要求書記載的內容為準。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。研究發現，血液糖蛋白的糖苷鍵連接的碳水化合物含量的改變與肺癌患者的組織學之間存在顯著地相關性。進一步地，評估肺癌臨床監測方法可有效篩查、定期評估肺癌的進展以及治療后腫瘤的復發。在本發明中，采用血清的寡糖鏈指紋技術（簡稱g-test方法）作為診斷指標對肺癌患者進行了評估。該方法主要步驟是，釋放并熒光標記血清或血漿樣品中的糖蛋白的寡糖鏈；分離測量樣本中熒光標記的寡糖鏈的含量或指紋圖譜（簡稱g-test圖譜）；分析比較寡糖指紋圖譜，得到檢測指標參數，具體流程見圖1。該方法可以讓眾多肺癌患者接受常規、無創檢測，幫助醫生檢測肺癌，并能夠及時監測疾病的發生和發病的進展。具體地，用于監測患肺癌或肺癌風險的組合物選自下述的寡糖鏈：na3f、na2f、na2fb、nga2f、nga2fb以及na3。以下實施例中，利用(na3f+na2fb)/na3的比值來診斷肺癌檢測。如圖2所示，人血清的g-test圖譜大概顯示出近10個n-寡糖鏈峰，不同的寡糖鏈因分子大小的不同而表現出不同的遷移性，即表現在g-test圖譜上的不同的峰則代表了不同的寡糖鏈；寡糖鏈的相對濃度含量則表現在所測出的峰高。上述寡糖縮寫分別表示為：nga2f，半乳糖缺失含核心巖藻糖(α1，6fuc)的兩天線；nga2fb，半乳糖缺失帶有二等分乙酰葡糖胺(g1cnac)修飾的核心巖藻糖(α1，6fuc)兩天線；ng1a2f，半乳糖單一缺失的核心巖藻糖(α1，6fuc)兩天線(singleagalacto，core-α-1，6-fucosylatedbiantennary)；na2，兩天線(bigalacto，biantennary)；na2f，核心巖藻糖(α1，6fuc)兩天線；na2fb，帶有二等分乙酰葡糖胺(glcnac)修飾的核心巖藻糖(α1，6fuc)兩天線；na3，三天線；na3f，分支巖藻糖(α1，3/1，2fuc)修飾的三天線。本發明提供的一種肺癌監測試劑盒由以下試劑組成：試劑a（變性緩沖液）：10mm的碳酸氫銨5%sds；試劑b（糖苷外切酶反應緩沖液）：糖苷外切酶終濃度2.2單位/μl在3.33%np40；試劑c（apts標記緩沖液）：混和同等體積的20mmapts（溶于1.2m檸檬酸）和1m有機物還原劑（溶于dmso）；試劑d（唾液酸酶反應液）：0.25μl100mmnh4ac，ph5；0.2μl唾液酸酶，2.55μl雙氧水。在本發明中，有機物還原劑優選nacnbh3。實施例1一、測試樣本本實驗共收集了21例肺癌患者的血清，血清收集來自鎮江第一人民醫院。健康對照組57例的血清來自鎮江第一人民醫院。以上21例患者均接受臨床實驗室分析診斷和組織學檢查并符合以下選擇標準：(a)均為肺癌感染的患者；(b)排除人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)等其他病毒感染；(c)血清采集均在患者未接受任何治療之前，臨床血常規、生化、腫瘤標志物、dna載量等數據與血清同期收集。以上數據用于評估病人的肺功能損害的程度。二、設備和試劑設備主要是abi測序儀(appliedbiosystems美國生物應用公司)，以及與之作用原理相同的毛細管電泳儀試劑主要含有試劑a（變性緩沖液）：10mm的碳酸氫銨5%sds；試劑b（糖苷外切酶反應緩沖液）：糖苷外切酶終濃度2.2單位/μl在3.33%np40；試劑c（apts標記緩沖液）：混和同等體積的20mmapts（溶于1.2m檸檬酸）和1mnacnbh3（溶于dmso）；試劑d（唾液酸酶反應液）：0.25μl100mmnh4ac；0.2μl唾液酸酶，2.55μl雙氧水。三、檢測血清樣本中的g-test圖譜的操作步驟g-test圖譜分析的操作程序包括四個步驟：步驟1，用專一性的n-糖苷鍵水解酶制備自由寡糖鏈：往稀釋一倍的4μl血清加入2μl的試劑a，95℃加熱5分鐘變性，然后同等體積的（4μl）的試劑b，37℃反應3小時后干燥；步驟2，熒光標記自由寡糖鏈：在步驟1的液體中加入2μl的試劑c，65℃加熱3小時進行熒光標記，然后加入200μl的水終止標記反應；步驟3，去除末端唾液酸：取2μl熒光標記的步驟2的液體，然后加入2μl的試劑d，45℃加熱3小時進行去末端唾液酸反應，然后加入200μl的水終止標記反應；步驟4，分離分析熒光標記的n-寡糖鏈：取10μl步驟3所得去末端唾液酸反應的液體，用abi3500dx測序儀進行n-寡糖鏈片分離，得到g-test圖譜。檢測分析：對測量得到的g-test圖譜中的每個峰均進行量化計算，以每個峰的相對含量來表示(%)：即用每個峰的峰高值除以所有峰的高度的總和來定量計算，計算得到g-test值。用統計學比較肺癌患者與健康對照組的相對含量的差異，具體結果如下表所示：g-test值nga2fnga2fbng1a2fng1a2fna2na2fna2fbna3na3f(na2fb+na3f)/na3正常組57例6.750.955.495.4848.5215.924.489.922.490.75肺癌組21例7.981.124.775.3348.4913.287.276.365.401.99人血清的g-test圖譜代表不同的n-寡糖鏈峰，因分子大小的不同而表現出不同的遷移性，即表現在g-test圖譜上的不同的峰則代表了不同的寡糖鏈；寡糖鏈的相對濃度含量則表現在所測出的峰高。如圖3和圖4所示，肺癌組與正常對照組的na2fb，帶有二等分乙酰葡糖胺(glcnac)修飾的核心巖藻糖(α1，6fuc)兩天線；na3，三天線；na3f，分支巖藻糖(α1，3/1，2fuc)修飾的三天線有著明顯差距，血液糖蛋白的n-糖苷鍵連接的碳水化合物(n-寡糖)含量的改變與肺癌患者的組織學之間存在顯著地相關性。研究發現利用(na3f+na2fb)/na3的比值來診斷肺癌檢測效果顯著，設定(na3f+na2fb)/na3的閾值小于1時為正常組，正常組57例中有49例滿足要求，準確度為85.9%。判定(na3f+na2fb)/na3的閾值大于1.5時為肺癌組，肺癌組21例有19例滿足要求，準確度為90.5%。結果說明血液糖蛋白的n-糖苷鍵連接的碳水化合物(n-寡糖)含量的改變與肺癌患者的組織學之間存在顯著地相關性。當前第1頁12