一種基于手機USB?OTG接口的電化學發光生化檢測系統及方法與流程

本發明涉及一種基于手機usb-otg接口的電化學發光生化檢測系統及方法，尤其實現了手機平臺上電壓激勵與圖像分析一體化的電化學發光分析。

背景技術：

usb具有熱插拔的性質，并且方便攜帶和使用，同時usb標準也是一個開放標準，它支持不同廠商的不同設備可以在同一設備上使用，具有更加廣泛的應用場景，支持不同設備。基于以上特點，usb接口得到了迅速的普及。但是標準的usb采用的是主從結構，即一個主設備連接一個或多個從設備，在一個傳輸體系中，數據傳輸只能發生在主設備和從設備之間，不能發生在從設備和從設備之間。otg協議作為usb的補充協議后可以實現從設備與從設備之間的聯接。通過利用otg協議，給手機連上otg外設，可以實現外設與手機間的雙向通訊。傳統的手機平臺上的電化學發光分析，主要利用手機的圖像分析功能，電壓激勵還需外接電化學工作站提供，不能完全意義上稱為基于手機的電化學發光，因此手機平臺上電壓激勵與圖像分析一體化的電化學發光分析的研究具有深遠的意義。本發明提出一種基于手機usb-otg接口的電化學發光生化檢測系統及方法，并將該技術應用于bsa以及凝血酶的電化學發光檢測過程中，具有裝置便攜通用，穩定性好，操作便捷等優點，能夠適應即時生化檢測的要求。

技術實現要素：

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種基于手機usb-otg接口的電化學發光生化檢測系統及方法，尤其實現了手機平臺上電壓激勵與圖像分析一體化的電化學發光分析。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種基于手機usb-otg接口的電化學發光生化檢測系統，該系統包括電化學發光捕獲分析系統、電化學發光可調激勵源系統和電化學發光反應裝置。

所述電化學發光捕獲分析系統包括：帶有攝像頭的手機和電化學發光分析單元；攝像頭捕獲電化學發光圖像，電化學發光分析單元對電化學發光圖像進行提取、切割、灰度處理以及定量分析，最終獲得電化學發光分析結果。

所述電化學發光可調激勵源系統包括：usb-otg手機端接口、usb-otg外接電路接口、工作電極接口和對電極接口；在利用手機提供電壓激勵時，usb-otg手機端接口連接在手機的usb端口，經過連接線連接usb-otg外接電路接口；將usb-otg外接電路接口的電源線和地線分別作為正極和負極，順序接入過流保護電路、阻抗式分壓電路和穩壓電路，通過穩壓電路后的正極連接工作電極接口，負極連接對電極接口。工作電極接口連接ito導電玻璃，對電極接口連接鉑絲環對電極。此時工作電極接口和對電極接口處可以穩定的輸出1～4v電壓用于激發電化學發光。

所述電化學發光反應裝置包括電化學發光反應槽和電化學發光反應支撐密封底座，所述電化學發光反應槽具有中通的圓臺形反應腔體；電化學發光反應支撐密封底座的橫截面為凹形結構，凹槽內放置ito導電玻璃，ito導電玻璃的上部放置密封圈，實現與電化學發光反應槽的密封連接；反應腔體內放置鉑絲環對電極，并加入電化學發光的共反應劑體系以及對應的檢測物質，實現穩定的電化學發光檢測。

一種利用上述系統進行電化學發光生化檢測方法，該方法包括以下步驟：

(1)電化學發光共反應劑體系選擇及優化：選擇發光物質、共反應劑；確定共反應劑濃度、發光物質與共反應劑用量配比；制備標準濃度的發光物質，在反應腔體內加入電化學發光的共反應劑體系，確定最優發光物質濃度。

(2)電極預處理：裁剪ito導電玻璃，分別使用丙酮、乙醇與水超聲清洗三次，最后用大量超純水沖洗，氦氣吹干，用作工作電極；鉑絲環使用超純水沖洗三次，用作對電極。

(3)電壓選擇：利用電化學工作站，實現電化學發光激勵電壓的選擇，將步驟(2)處理好的ito導電玻璃與電化學工作站的工作電極端口相連，鉑絲環與電化學工作站的對電極端口相連，電化學工作站選擇循環伏安法模式，施加1.5v～3.3v電壓，記錄電流信號，電流信號從無到有證明電化學發光反應的產生。

(4)ito電極的生物特異性修飾：根據檢測目標物質的特性，在ito表面修飾一層特異性敏感膜。

(5)將usb-otg手機端接口連接在手機的usb端口，將手機的5v電壓在工作電極接口和對電極接口處穩定的輸出1～4v電壓，從而激發電化學發光。

(6)手機攝像頭捕獲電化學發光圖像。

(7)電化學發光分析單元對電化學發光圖像進行提取、切割、灰度處理等預處理以及電化學發光定量分析，最終獲得電化學發光分析結果；所述電化學發光定量分析具體為：將灰度處理后的圖像進行灰度分析，計算圖像中像素點的灰度平均值，利用最小二乘法計算灰度標定曲線；將灰度處理后的圖像進行rgb分析，計算圖像中像素點的r平均值，利用最小二乘法計算r標定曲線；將灰度處理后的圖像進行rgb分析，計算圖像中像素點的g平均值，利用最小二乘法計算g標定曲線；將灰度處理后的圖像進行rgb分析，計算圖像中像素點的b平均值，利用最小二乘法計算b標定曲線。

(8)將待測物質置于反應腔體內，重復步驟(5)和(6)得到電化學發光圖像，經與步驟(7)相同的預處理后，根據四個標定曲線，得到待測物質濃度。

進一步地，該方法可用于基于bsa電化學發光檢測；所述共反應劑體系具體為：三聯吡啶釕為發光物質，三丙胺為共反應劑，其濃度為1m；三聯吡啶釕與三丙胺的體積比為1：9；最優的三聯吡啶釕濃度為10mm；最優激勵電壓為2.5v。該方法包括以下步驟：

(a)ito電極的anti-bsa修飾：剪取面積為1cm²的硝酸纖維素薄膜，溶于1ml的甲醇中，攪拌，待硝酸纖維素薄膜完全溶解后；取10ul的溶解硝酸纖維素薄膜滴于ito導電玻璃的導電面，并在中間均勻鋪成面積為3cm×3cm的正方形修飾區域，靜置1分鐘待甲醇揮發后，在ito中間區域形成硝酸纖維素薄膜修飾的敏感區域；在該區域滴加200ul的1mm的anti-bsa，并均勻鋪成面積為3cm×3cm的正方形修飾區域，靜置30分鐘，利用硝酸纖維素薄膜的吸附作用，在ito電極表面修飾上anti-bsa，在后續的電化學發光反應進行中可以特異性的與bsa反應，引起發光強度的變化。

(b)標準溶液制配：配制濃度分別為10um，20um，50um，100um，200um，500um和1000um的bsa標準溶液，溶劑為去離子水。

(c)基于手機的bsa電化學發光檢測：在反應腔體內加入200ul的10um的bsa標準溶液，反應10分鐘，再加入200ul的最優濃度的10mm三聯吡啶釕與1800ul的1m的三丙胺作為電化學發光的共反應劑體系，然后利用電化學發光可調激勵源系統提供最優2.5v的激勵電壓，最后按照步驟(7)對電化學發光結果進行處理和分析；使用相同的方法，在手機上對20um，50um，100um，200um，500um和1000um的bsa標準溶液進行電化學發光結果處理和分析；最后建立bsa濃度與灰度，以及bsa濃度與rgb之間的對應關系曲線。

(d)將待測濃度的bsa溶液根據步驟(c)建立的標準曲線中，得到待測bsa溶液的濃度。

進一步地，該方法可用于凝血酶電化學發光檢測，所述共反應劑體系具體為：三聯吡啶釕為發光物質，三丙胺為共反應劑，其濃度為1m；三聯吡啶釕與三丙胺的體積比為1：9；最優的三聯吡啶釕濃度為10mm；最優激勵電壓為2.5v。該方法包括以下步驟：

(a)ito電極的凝血酶特異性響應多肽修飾：首先在ito中間區域形成硝酸纖維素薄膜修飾的敏感區域；然后在該區域滴加200ul的10^-5m的凝血酶特異性響應多肽(cys-leu-val-pro-arg-gly-ser-cys)，并均勻鋪成面積為3cm×3cm的正方形修飾區域，靜置30分鐘，在ito電極表面修飾上凝血酶特異性響應多肽，在后續的電化學發光反應進行中可以特異性的與凝血酶反應，引起發光強度的變化。

(b)標準溶液制配：配制濃度分別為10^-9m，10^-8m，10^-7m，10^-6m，和10^-5m的凝血酶標準溶液，溶劑為去離子水。

(c)基于手機的凝血酶電化學發光檢測：在手機上對10^-9m，10^-8m，10^-7m，10^-6m，和10^-5m的凝血酶標準溶液進行電化學發光結果處理和分析；最后建立凝血酶濃度與灰度，以及凝血酶濃度與rgb之間的對應關系曲線。

(d)將待測濃度的凝血酶溶液根據步驟(c)建立的標準曲線中，得到待測凝血酶溶液的濃度。

本發明的有益效果是：

1、實現了激勵與分析一體化的手機電化學發光分析，并將該技術應用于bsa以及凝血酶的電化學發光檢測過程中，具有裝置便攜通用，穩定性好，操作便捷等優點，能夠適應即時生化檢測的要求。

2、本發明首次利用手機usb-otg接口實現了電化學發光激勵源的設計，該設計利用手機usb-otg接口輸出的5v電壓經過過流保護電路、阻抗式分壓電路和穩壓電路后，可以穩定的輸出1～4v電壓，用于激發電化學發光，同時該電化學發光強度可以被手機攝像頭捕獲。

3、開發了電化學發光分析單元，用于電化學發光的定量分析；在實際bsa的電化學發光分析過程中，建立了發光強度與灰度值的高匹配度；在實際凝血酶的電化學發光分析過程中，建立了發光強度與灰度值以及r參數的高匹配度；證明了三聯吡啶釕、三丙胺電化學發光共反應劑體系中，發光圖像的灰度值和rgb參量中的r參數具有更好的濃度依賴性，g、b參數的與電化學發光強度對應關系較弱。

4、構建了基于ito導電玻璃的電化學發光分析，由于其良好的透光性，減少了發光信號在傳遞過程中的損耗；同時其良好的導電性為電化學發光的產生提供了必要條件；此外其光潔平滑的表面更有利于表面的修飾，減少測試過程中的環境誤差；最后ito導電玻璃，可一次性使用，環境污染小，更利于便攜式電化學發光生物傳感器的開發。

5、通過硝酸纖維薄膜，在電極表面形成穩定性好的功能膜，具有重復性高、魯棒性好等優點，簡化修飾過程，實現了無毒、綠色、以及高效的修飾過程。

6、該方法對使用條件的要求小，操作簡便、檢測穩定性好、通用性強、易于推廣使用。

附圖說明

圖1是基于手機usb-otg接口的電化學發光檢測系統框架圖；

圖2是usb-otg接口內部線路圖；

圖3(a)是電化學發光反應裝置一個角度結構圖；

圖3(b)是電化學發光反應裝置另一個角度結構圖；

圖4是基于手機電化學發光分析軟件設計流程圖；

圖5是電化學發光在施加不同電壓下對應電流結果；

圖6是手機捕獲并處理所得的不同濃度下三聯吡啶釕發光結果圖；

圖7是手機軟件分析的不同濃度下三聯吡啶釕發光灰度結果圖；

圖8是手機軟件分析的不同濃度下三聯吡啶釕發光r結果圖；

圖9是手機軟件分析的不同濃度下三聯吡啶釕發光g結果圖；

圖10是手機軟件分析的不同濃度下三聯吡啶釕發光b結果圖；

圖11是手機捕獲并處理所得的不同濃度下bsa發光結果圖；

圖12是手機軟件分析的不同濃度下bsa發光灰度結果圖；

圖13是手機軟件分析的不同濃度下bsa發光r結果圖；

圖14是手機軟件分析的不同濃度下bsa發光g結果圖；

圖15是手機軟件分析的不同濃度下bsa發光b結果圖；

圖16是手機捕獲并處理所得的不同濃度下凝血酶發光結果圖；

圖17是手機軟件分析的不同濃度下凝血酶發光灰度結果圖；

圖18是手機軟件分析的不同濃度下凝血酶發光r結果圖；

圖19是手機軟件分析的不同濃度下凝血酶發光g結果圖；

圖20是手機軟件分析的不同濃度下凝血酶發光b結果圖。

圖中，電化學發光可調激勵源系統1、電化學發光可調激勵源系統2、攝像頭3、電化學發光分析單元4、usb-otg手機端接口5、連接線6、usb-otg外接電路接口7、過流保護電路8、阻抗式分壓電路9、穩壓電路10、工作電極接口11、對電極接口12、usb-otg手機端接口內部端口13、usb-otg外接電路接口內部端口14、電化學發光反應槽15、電化學發光反應支撐密封底座16、反應腔體17、凹槽18。

具體實施方式

以下結合附圖及具體實施例對本發明作詳細描述，但并不是限制本發明。

本發明提供的一種基于手機usb-otg接口的電化學發光生化檢測系統，該系統包括電化學發光捕獲分析系統(1)、電化學發光可調激勵源系統(2)和電化學發光反應裝置。

所述電化學發光捕獲分析系統(1)包括：如圖1所示，帶有攝像頭(3)的手機和電化學發光分析單元(4)；攝像頭(3)捕獲電化學發光圖像，電化學發光分析單元(4)對電化學發光圖像進行提取、切割、灰度處理、以及定量分析，最終獲得電化學發光分析結果。

所述電化學發光可調激勵源系統(2)，如圖1所示，包括usb-otg手機端接口(5)、usb-otg外接電路接口(7)、工作電極接口(11)和對電極接口(12)；在利用手機提供電壓激勵時，usb-otg手機端接口(5)連接在手機的usb端口，經過連接線(6)連接usb-otg外接電路接口(7)；將usb-otg外接電路接口(7)的電源線和地線分別作為正極和負極(圖2所示)，順序接入過流保護電路(8)、阻抗式分壓電路(9)和穩壓電路(10)，通過穩壓電路(10)后的正極連接工作電極接口(11)，負極連接對電極接口(12)。工作電極接口(11)連接ito導電玻璃，對電極接口(12)連接鉑絲環對電極。此時工作電極接口(11)和對電極接口(12)處可以穩定的輸出1～4v電壓用于激發電化學發光。

所述電化學發光反應裝置包括電化學發光反應槽(15)和電化學發光反應支撐密封底座(16)(圖3所示)，所述電化學發光反應槽(15)具有中通的圓臺形反應腔體(17)；電化學發光反應支撐密封底座(16)的橫截面為凹形結構，凹槽(18)內放置ito導電玻璃，ito導電玻璃的上部放置密封圈，實現與電化學發光反應槽(15)的密封連接；反應腔體(17)內放置鉑絲環對電極，并加入電化學發光的共反應劑體系以及對應的檢測物質，實現穩定的電化學發光檢測。

優選地，鉑絲環對電極的直徑為2.5cm，反應腔體(17)底部圓的直徑為2cm，鉑絲環對電極與ito導電玻璃的垂直距離為4mm～8mm。

一種基于手機usb-otg接口的電化學發光生化檢測系統，該方法包括以下步驟：

(1)電化學發光共反應劑體系選擇及優化：選擇發光物質、共反應劑；確定共反應劑濃度、發光物質與共反應劑用量配比；制備標準濃度的發光物質，在反應腔體(17)內加入電化學發光的共反應劑體系，確定最優發光物質濃度。

(2)電極預處理：使用玻璃切割器將10cm×10cm的ito導電玻璃裁成3cm×5cm，，分別使用丙酮、乙醇與水超聲清洗三次，最后用大量超純水沖洗，氦氣吹干，用作工作電極；直徑為2.5cm的鉑絲環使用超純水沖洗三次，用作對電極。

(3)電壓選擇：利用電化學工作站，實現電化學發光激勵電壓的選擇，將步驟(2)中處理好ito導電玻璃通過導線與電化學工作站的工作電極端口相連，鉑絲環通過導線與電化學工作站的對電極端口相連。如圖5所示，電化學工作站選擇循環伏安法模式，施加1.5v～3.3v電壓，記錄電流信號，電流信號從無到有證明電化學發光反應的產生。

(4)ito電極的生物特異性修飾：根據檢測目標物質的特性，在ito表面修飾一層特異性敏感膜。

(5)將usb-otg手機端接口(5)連接在手機的usb端口，將手機的5v電壓在工作電極接口(11)和對電極接口(12)處穩定的輸出1～4v電壓，從而激發電化學發光。

(6)手機攝像頭(3)捕獲電化學發光圖像。

(7)電化學發光分析單元(4)對電化學發光圖像進行提取、切割、灰度處理等預處理以及電化學發光定量分析，最終獲得電化學發光分析結果(圖4所示)；所述電化學發光定量分析具體為：將灰度處理后的圖像進行灰度分析，計算圖像中像素點的灰度平均值，利用最小二乘法計算灰度標定曲線；將灰度處理后的圖像進行rgb分析，計算圖像中像素點的r平均值，利用最小二乘法計算r標定曲線；將灰度處理后的圖像進行rgb分析，計算圖像中像素點的g平均值，利用最小二乘法計算g標定曲線；將灰度處理后的圖像進行rgb分析，計算圖像中像素點的b平均值，利用最小二乘法計算b標定曲線。

(8)將待測物質置于反應腔體(17)內，重復步驟(5)和(6)得到電化學發光圖像，經與步驟(7)相同的預處理后，根據四個標定曲線，得到待測物質濃度。

一種利用上述系統進行電化學發光生化檢測方法，所述步驟(1)中，共反應劑體系具體為：三聯吡啶釕為發光物質，三丙胺為共反應劑，其濃度為1m；三聯吡啶釕與三丙胺的體積比為1：9；所述步驟(3)中最優激勵電壓為2.5v。該方法包括以下步驟：

(a)標準溶液制配：配制濃度分別為0.1mm，1mm，2mm，3mm，5mm，7mm，10mm和20mm的三聯吡啶釕標準溶液，溶劑為去離子水。

(b)不同濃度三聯吡啶釕電化學發光檢測：在反應腔體(17)內加入200ul的0.1mm三聯吡啶釕與1800ul的1m的三丙胺作為電化學發光的共反應劑體系，然后利用基于手機的電化學發光可調激勵源系統(2)提供由步驟(3)選出的最優2.5v的激勵電壓，最后按照步驟(7)對電化學發光結果進行處理和分析；使用相同的方法，在手機上對1mm，2mm，3mm，5mm，7mm，10mm和20mm的三聯吡啶釕標準溶液進行電化學發光結果處理和分析；最后建立三聯吡啶釕濃度與灰度(圖6、7所示)，以及三聯吡啶釕濃度與rgb之間的對應關系曲線(圖8、9、10所示)。

(c)根據步驟(2)，通過對發光圖像的分析，找到發光強度最大時對應的濃度，以確定最優的發光物質濃度。

實施例1：基于手機的bsa電化學發光檢測，具體包括以下步驟：

(a)ito電極的anti-bsa修飾：剪取面積為1cm²的硝酸纖維素薄膜，溶于1ml的甲醇中，攪拌，待硝酸纖維素薄膜完全溶解后；取10ul的溶解硝酸纖維素薄膜滴于ito導電玻璃的導電面，并在中間均勻鋪成面積為3cm×3cm的正方形修飾區域，靜置1分鐘待甲醇揮發后，在ito中間區域形成硝酸纖維素薄膜修飾的敏感區域；在該區域滴加200ul的1mm的anti-bsa，并均勻鋪成面積為3cm×3cm的正方形修飾區域，靜置30分鐘，利用硝酸纖維素薄膜的吸附作用，在ito電極表面修飾上anti-bsa，在后續的電化學發光反應進行中可以特異性的與bsa反應，引起發光強度的變化。

(b)標準溶液制配：配制濃度分別為10um，20um，50um，100um，200um，500um和1000um的bsa標準溶液，溶劑為去離子水。

(c)基于手機的bsa電化學發光檢測：在反應腔體(17)內加入200ul的10um的bsa標準溶液，反應10分鐘，再加入200ul的由步驟(3)選出的最優濃度的10mm三聯吡啶釕與1800ul的1m的三丙胺作為電化學發光的共反應劑體系，然后利用基于手機的電化學發光可調激勵源系統(2)提供由步驟(3)選出的最優2.5v的激勵電壓，最后按照步驟(7)對電化學發光結果進行處理和分析；使用相同的方法，在手機上對20um，50um，100um，200um，500um和1000um的bsa標準溶液進行電化學發光結果處理和分析；最后建立bsa濃度與灰度(圖11、12所示)，以及bsa濃度與rgb之間的對應關系曲線(圖13、14、15所示)。

(d)將待測濃度的bsa溶液根據步驟(c)建立的標準曲線中，得到待測bsa溶液的濃度。

實施例2：基于手機的凝血酶電化學發光檢測，具體包括以下步驟：

(a)ito電極的凝血酶特異性響應多肽修飾：剪取面積為1cm²的硝酸纖維素薄膜，溶于1ml的甲醇中，攪拌，待硝酸纖維素薄膜完全溶解后；取10ul的溶解硝酸纖維素薄膜滴于ito導電玻璃的導電面，并在中間均勻鋪成面積為3cm×3cm的正方形修飾區域，靜置1分鐘待甲醇揮發后，在ito中間區域形成硝酸纖維素薄膜修飾的敏感區域；在該區域滴加200ul的10^-5m的凝血酶特異性響應多肽(cys-leu-val-pro-arg-gly-ser-cys)，并均勻鋪成面積為3cm×3cm的正方形修飾區域，靜置30分鐘，利用硝酸纖維素薄膜的吸附作用，在ito電極表面修飾上凝血酶特異性響應多肽，在后續的電化學發光反應進行中可以特異性的與凝血酶反應，引起發光強度的變化。

(b)標準溶液制配：配制濃度分別為10^-9m，10^-8m，10^-7m，10^-6m，和10^-5m的凝血酶標準溶液，溶劑為去離子水。

(c)基于手機的凝血酶電化學發光檢測：在反應腔體(17)內加入200ul的10^-9m的凝血酶標準溶液，反應10分鐘，再加入200ul的由步驟(3)選出的最優濃度的10mm三聯吡啶釕與1800ul的1m的三丙胺作為電化學發光的共反應劑體系，然后利用基于手機的電化學發光可調激勵源系統(2)提供由步驟(3)選出的最優2.5v的激勵電壓，最后按照步驟(7)對電化學發光結果進行處理和分析；使用相同的方法，在手機上對10^-8m，10^-7m，10^-6m，和10^-5m的凝血酶標準溶液進行電化學發光結果處理和分析；最后建立凝血酶濃度與灰度(圖16、17所示)，以及凝血酶濃度與rgb之間的對應關系曲線(圖18、19、20所示)。

(d)將待測濃度的凝血酶溶液根據步驟(c)建立的標準曲線中，得到待測凝血酶溶液的濃度。